MDR1启动子调控的CD∷upp基因及MDR1干扰RNA逆转卵巢癌多药耐药的研究

摘要

目的：(1)构建由人MDR1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因(CD∷upp)表达的重组腺病毒；(2)探讨MDR1启动子调控CD∷upp转移及其与5-氟胞嘧啶(5-FC)联合应用对紫杉醇耐药卵巢癌细胞株的特异性杀伤作用及对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及荷瘤裸鼠的生存时间。 方法：(1)从PORF-CD∷upp质粒中切下CD∷upp基因，插入PMDR1-280质粒的MDR1启动子下游，再从中切下目的基因MDR1-CD∷upp，克隆到腺病毒穿梭质粒中，获得带目的基因的穿梭质粒pAdTrack-MDR1-CD∷upp。经内切酶、PCR及测序鉴定后将其与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化，获得的阳性克隆经线性化后脂质体转染293细胞，通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增出重组腺病毒中的MDR1、CD∷upp目的基因加以鉴定。(2)将MDR1启动子调控的CD∷upp基因转染2对人卵巢癌紫杉醇耐药及非耐药株A2780TS和A2780；SKOV3TS和SKOV3，加入含5-FC的培养液培养，MTT法检测细胞存活率；转基因A2780TS、SKOV3TS耐药细胞分别与未转基因A2780TS、SKOV3TS以不同比例混合，观察旁观者效应。(3)将整合有MDR1-CD∷upp基因的腺病毒0.1ml(1×109pfu/ml)注入卵巢癌裸鼠皮下移植瘤瘤体内，联合5-FC裸鼠腹腔内注射，，观察各组裸鼠存活情况。 结果：(1)成功构建了含MDR1-CD∷upp靶向自杀基因的重组腺病毒载体AdMDR1-CD∷upp，病毒滴度为3.0×1010pfu/ml。(2)MDR1-CD∷upp基因在以上2对细胞株中可稳定表达，联合使用5-FC后对A2780TS、SKOV3TS耐药细胞特异性杀伤作用明显高于A2780、SKOV3非耐药细胞株。同时，转MDR1-CD∷upp基因的A2780TS、SKOV3TS耐药细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转染CD∷upp基因的耐药细胞。(3)该重组腺病毒对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤具有明显抑制作用，并能明显延长实验组荷瘤裸鼠的生存时间。 结论：该重组腺病毒AdMDR1-CD∷upp在卵巢癌耐药细胞株的特异性表达，联合5-FC后对A2780TS、SKOV3TS耐药细胞有显著的特异性杀伤作用。对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤具有明显抑制作用，能明显延长对耐药卵巢癌裸鼠的生存时间。 AdMDR1-CD∷upp/5-FC系统可作为紫杉醇耐药卵巢癌基因治疗有效方法之一。

目录

前言

一人MDR1启动子调控CD：：upp的重组腺病毒载体的构建及表达

材料和方法

结果

讨论

参考文献

二腺病毒载体介导的MDR1-CD：：upp基因转移联合5-FC对紫杉醇耐药卵巢癌细胞株的杀伤作用研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

三 MDR1启动子调控CD：：upp基因联合5-FC治疗卵巢癌移植瘤的实验研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分MDR1干扰RNA逆转卵巢癌多药耐药的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述卵巢癌化疗与多药耐药基因逆转

在读期间发表的部分文章

致谢