一种利用花生粕制备可抑制调理肉氧化变质的糖肽的方法

摘要

本发明公开了一种利用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功效的糖肽的方法，该方法通过生物酶解技术降解多糖，释放寡糖和多糖，然后采用糖基化技术促进花生粕本身蛋白质和寡糖单糖的结合来制备花生糖蛋白，然后再次采用生物酶解技术降解花生糖蛋白，制备出糖肽。糖肽的抗氧化作用显著，将其应用于调理肉中，该糖肽可显著抑制调理肉中蛋白和脂肪的氧化变性，从而抑制调理肉的氧化变质，延长其货架期。本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得糖肽的抑制蛋白和脂肪氧化活性强。

说明书

技术领域

本发明属于花生粕深加工领域，具体涉及一种利用花生粕制备可抑制调理 肉氧化变质的糖肽的方法。

背景技术

调理肉，是指以畜禽肉为主要原料，添加适量的调味料或辅料，经适当加 工，以包装或散装形式在冷冻(-18℃)或冷藏(7℃以下)或常温条件下贮存、 运输、销售，可直接食用或经简单加工、处理即可食用的肉制品。调理肉因食 用方便、营养均衡和小容量化而深受消费者喜爱，市场前景广阔。随着冷链的 不断完善，低温调理肉的消费量逐步增加，尤其是速冻调理肉，因其具有较长 的保质期，是当今世界发展速度最快的食品类别之一。

然而，随着人们消费水平的提高和消费观念的转变，人们对生鲜类调理肉 (7℃以下冷藏)的需求越来越大，但是生鲜类调理肉在0～4℃的货架期仅为1～2 天，严重限制其消费。

肉的腐败变质主要由微生物作用和脂肪、蛋白质氧化两种因素导致。在调 理肉的制备过程中，只要对肉原料、辅料及其影响因子进行微生物菌群控制， 并保证生产设备的安全卫生或添加常用防腐剂即可较好的控制微生物污染。而 对于如何控制调理肉在贮藏过程中的油脂和蛋白质氧化，保持调理肉营养成分 和风味，延长保质期，一直是科研和企业工作者亟待解决的技术难题。

目前，主要通过添加天然或人工合成的抗氧化剂来抑制肉制品中脂肪和蛋 白质的氧化，常见的抗氧化剂有异抗坏血酸及其钠盐、茶多酚、迷迭香提取物 等。人工合成的抗氧化剂虽然具有功效明确，成本低的优点，但多有不同程度 的毒性，而天然抗氧化剂具有安全性高、抗氧化能力强、无副作用等优势，但 价格偏高，直接提高了调理肉产品的生产成本。因此，寻找抗氧化功效显著、 价格合理的安全抗氧化剂成为必然的趋势。

糖蛋白是肽链通过共价键与寡糖链(或糖基)结合而形成的蛋白质，糖蛋 白形成的过程称为糖基化。糖蛋白广泛存在于动植物及某些微生物中，且人体 血浆和多种激素中大部分蛋白质为糖蛋白。

目前发现糖蛋白具有良好的医疗保健功效，如抗肿瘤活性，提高免疫力活 性、抗炎活性和降血脂活性，且具有较强的抗氧化活性。此外，食源性的糖蛋 白经水解后，可产生具有更强抗氧化活性的糖肽活性成分。糖蛋白降解为糖肽 后，不仅提高了其溶解性，更是提高了其营养特性和生物活性，在食品开发方 面具有更广阔的应用前景。

花生是我国三大油料作物之一，每年有50-60％的花生用来榨油。花生粕是 花生油加工过程中的副产物，我国每年花生粕产量高达400多万吨，其富含蛋 白质(40-50％)，氨基酸组成合理，是一种优质的低值大宗蛋白质资源。但由于 经过高温压榨处理，蛋白质发生了严重变性，且花生粕中多糖(纤维)含量高 达30％，限制了花生粕的应用领域，目前多用于饲料或肥料，造成蛋白资源的 严重浪费。

由于蛋白质和多糖为花生粕的主要成分，如果能将花生粕中的多糖降解为 寡糖或单糖，再使得糖与蛋白或多肽结合生成糖蛋白或糖肽，既可提高花生粕 的附加值，拓宽应用范围，又可制备具有多种生物活性的糖肽产品。因此，以 花生粕为原料制备生物活性糖肽，具有较大的经济和社会意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功 效的糖肽的方法，该方法的要点在于促使花生粕中的多糖降解为寡糖或单糖、 促使糖蛋白和糖肽的生成、对水解酶和水解程度的具体选择，以及采用了干菊 花和活性碳的脱苦技术。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有抑制调理肉氧化变质功 效的糖肽。

本发明的再一目的在于提供上述的糖肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功效的糖肽的方法，包括以下 步骤：

(1)花生糖蛋白的制备：取花生粕，加水搅匀，加入糖化酶和复合植物水 解酶，在50-60℃下保温加热4-8h，然后在100-110℃下加热1-1.5h，冷却至常 温，得到花生糖蛋白混合物；以花生粕质量为计算基准，糖化酶加入量为 0.6-1.2％；复合植物水解酶加入量为0.8-1.5％；糖化酶和复合植物水解酶作用于 花生粕使其中的多糖被水解成单糖或寡糖，而在高温条件下，单糖或寡糖容易 与花生粕中蛋白质发生糖基化反应生成糖蛋白；

(2)糖肽的制备及祛苦：将花生糖蛋白混合物加热至45-55℃，加入Alcalase  2.4L水解蛋白酶和风味蛋白酶进行保温水解，当水解度达到6-10％时，加入干 菊花和活性碳继续酶解，1-2h后灭酶(85-95℃加热15-30min)，离心，取上清 液，为花生糖肽混合物，真空浓缩至固形物含量70％以上，得到糖肽浓缩膏； 以花生糖蛋白混合物固形物质量为计算基准，Alcalase 2.4L水解蛋白酶的添加量 占0.4-0.8％，风味蛋白酶的添加量占0.8-1.5％，干菊花添加量占0.5-1.0％，活性 碳添加量占0.3-0.6％；Alcalase 2.4L水解蛋白酶和风味蛋白酶使得花生糖蛋白中 的蛋白质降解成多肽或寡肽，从而生成糖肽；当花生粕酶解产物的水解度为 6-10％使容易产生苦味，而干菊花与活性炭同时作用，可吸附花生粕酶解产物中 的苦味物质，从而达到降苦去苦的目的；

步骤(1)中，所用的花生粕是油脂含量不高于10％的高温或低温压榨花生 粕，所述的加水是加水使花生粕质量含量达到8-12％(w/w)。

由上述方法制得的糖肽可用于抑制调理肉氧化变质；具体使用时，是将糖 肽、调理肉的配料(诸如食盐、复合磷酸盐等)与新鲜肉混合，然后按现有方 法腌制；糖肽的使用量优选为新鲜肉质量的1-2％。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过生物酶解技术降解多糖，释放寡糖和多糖，然后采用糖基 化技术促进花生粕本身蛋白质和寡糖单糖的结合来制备花生糖蛋白，然后再次采 用生物酶解技术降解花生糖蛋白，制备出糖肽。糖肽的抗氧化作用显著，将其应 用于调理肉中，该糖肽可显著抑制调理肉中蛋白和脂肪的氧化变性，从而抑制调 理肉的氧化变质，延长其货架期。

(2)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得糖肽的抑制 蛋白和脂肪氧化活性强。

附图说明

图1是调理肉在保藏过程中TBARS值的变化曲线图。

图2是调理肉在保藏过程中巯基含量的变化曲线图。

图3是调理肉在保藏过程中色差的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

以下各实施例中，调理肉的制备方法及各样品对调理肉的氧化抑制作用的 实验方法如下：

1、调理肉的制备方法

新鲜猪肉清洗干净→切片→配料(1.0-2.0％糖肽浓缩膏/花生肽膏，1.5％食 盐，0.3％复合磷酸盐，以猪肉质量为基准)→搅拌→腌制→PE真空包装→4℃冰 箱保藏。

2、糖肽浓缩膏和花生肽膏苦味评定

采用定量描述分析法对糖肽浓缩膏和花生肽膏苦味进行感官评定，用去离 子水将待测样稀释到1.0％浓度作为感官评价样品。感观分析评价员根据国标 GB/T 14195-93的方法进行筛选和培训，其中男生5名，女生5名(年龄22-35岁)。 采用0～10分制，以0.5％L-异亮氨酸作为苦味标准溶液进行感官评定，评分为10 分，参照标准液苦味，评价员分别对样品的苦味进行评分。

3、氧自由基清除能力(ORAC)测定方法

基于ORAC反应在75mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)环境中进行，FL (荧光素钠盐)、AAPH(自由基产生剂)、标准抗氧化物质Trolox(维生素E水 溶性类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为：在96 孔板各微孔中分别加入待测样品20μL后添加缓冲溶液20μL及FL(70nmol·L^-1)20μL，在37℃下预置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH(12.8 mmol·L^-1)140μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波 长485nm，发射波长528nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度， 测定108min，荧光强度分别记为f0，f1，f2…f54。将记录的各微孔不同时间点 的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据 公式如下公式统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，

$\mathrm{AUC}=1+\underset{i=1}{\overset{54}{\Sigma }}{f}_i/f_0$

然后根据公式：net AUC＝AUC_sample-AUC_blank分别计算不同浓度Trolox和抗氧化 剂net AUC值，其中AUC blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。

4、DPPH自由基抑制率测定

准确称取0.0198g DPPH，用无水乙醇溶解并定容到250mL，配制成0.2 mmol/L DPPH的溶液，棕色瓶中避光低温保存备用。用去离子水将酶解液蛋白 浓度稀释1.0 mg/mL。取2 mL样品液于试管内，加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液 混合均匀，室温下避光静置30min后，测定517nm处吸光度值，计为Ai，同时测 定2mL样品液加2mL无水乙醇在室温下避光静置30min后在517nm处吸光度 值，计为Aj，以及2mL 0.2mmol/L DPPH溶液加2mL蒸馏水静置后的吸光度值， 计为Ac。样品对DPPH自由基的清除率按下式计算：

5、TBARS(硫代巴比妥酸值)测定

每3天取样测定。取适量调理肉绞碎成肉糜，取10g，添加50mL 7.5％TCA， 均质30s，在4℃8000r/min下离心15min，滤纸过滤，上清液体积记为V。取2 mL上清液，添加2mL 0.02M TBA，沸水浴20min，冷却，测定532nm处吸光值。 根据吸光值和丙二醛标准曲线计算上清液中丙二醛浓度，记为C。

丙二醛标准曲线绘制：

TBARS值mg/kg＝C×V/m，m为样品质量。

6、巯基含量测定

每3天取样测定。取适量调理肉绞碎成肉糜，取10g加入50mL pH6.5缓冲液 (含150mM NaCl，25mM KCl，3mM MgCl₂，4mM EDTA)均质30s，4℃6000 r/min离心15min，滤纸过滤。取0.5mL滤液，添加2.5mL Tris-Gly溶液，混合均 匀，再添加0.02mL 4mg/mL DTNB(二硝基苯甲酸)，迅速混合后在25℃下保 温反应30min，测定412nm处吸光值，记为A412。上清液蛋白浓度采用双缩脲 法测定。

巯基含量计算：巯基含量μmol/g＝73.53×A412/C，其中73.53＝106/1.36×104， 1.36×104为摩尔消光系数，C为上清液蛋白浓度，mg/mL。

7、色差

每3天取样测定。采用WSC-S色差计直接测定。每个调理肉样品随机选取 3处平滑面测定，计算平均值。

实施例1

一种利用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功效的糖肽的方法，包括以 下步骤：

(1)花生糖蛋白的制备：加水使花生粕质量含量达到10％(w/w)，加入花 生粕质量0.8％的糖化酶(诺维信公司)和1.5％的复合植物水解酶(诺维信公司)， 在55℃下保温加热5h，然后在100℃下加热1.5h，然后冷却至常温，得到花生 糖蛋白混合物。

(2)花生糖肽的制备及祛苦：将花生糖蛋白混合物加热至50℃，加入花生 糖蛋白混合物固形物质量0.5％的Alcalase 2.4L水解蛋白酶(诺维信公司)和1.0％ 风味蛋白酶(诺维信公司)进行保温水解，当水解度达到8％时，加入花生糖蛋 白混合物固形物质量0.6％的干菊花和0.3％的活性碳继续酶解，1.5h后在85℃下 加热30min灭酶，离心，取上清液，为花生糖肽混合物，真空浓缩至固形物含量 70％以上，得到糖肽浓缩膏1。

糖肽浓缩膏1的苦味值和抗氧化值(ORAC和DPPH清除率)如表1。

添加糖肽浓缩膏1的调理肉在保藏过程中TBARS值、巯基含量和色差的变化 情况如图1、图2和图3。

实施例2

一种利用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功效的糖肽的方法，包括以 下步骤：

(1)花生糖蛋白的制备：加水使花生粕质量含量达到8％(w/w)，加入花 生粕质量1.2％的糖化酶(诺维信公司)和1.0％的复合植物水解酶(诺维信公司)， 在55℃下保温加热6h，然后在110℃下加热1.0h，然后冷却至常温，得到花生 糖蛋白混合物。

(2)花生糖肽的制备及祛苦：将花生糖蛋白混合物加热至50℃，加入花生 糖蛋白混合物固形物质量0.8％的Alcalase 2.4L水解蛋白酶(诺维信公司)和1.2％ 风味蛋白酶(诺维信公司)进行保温水解，当水解度达到10％时，加入花生糖蛋 白混合物固形物质量0.5％的干菊花和0.6％的活性碳继续酶解，1.0h后在95℃下 加热15min灭酶，离心，取上清液，为花生糖肽混合物，真空浓缩至固形物含量 70％以上，得到糖肽浓缩膏2。

糖肽浓缩膏2的苦味值和抗氧化值(ORAC和DPPH清除率)如表1。

添加糖肽浓缩膏2的调理肉在保藏过程中TBARS值、巯基含量和色差的变化 情况如图1、图2和图3。

实施例3

一种利用花生粕制备具有抑制调理肉氧化变质功效的糖肽的方法，包括以 下步骤：

(1)花生糖蛋白的制备：加水使花生粕质量含量达到12％(w/w)，加入花 生粕质量0.6％的糖化酶(诺维信公司)和1.2％的复合植物水解酶(诺维信公司)， 在50℃下保温加热8h，然后在105℃下加热1.2h，然后冷却至常温，得到花生糖 蛋白混合物。

(2)花生糖肽的制备及祛苦：将花生糖蛋白混合物加热至55℃，加入花生 糖蛋白混合物固形物质量0.6％的Alcalase 2.4L水解蛋白酶(诺维信公司)和1.5％ 风味蛋白酶(诺维信公司)进行保温水解，当水解度达到7％时，加入花生糖蛋 白混合物固形物质量1.0％的干菊花和0.5％的活性碳继续酶解，2.0h后在90℃下 加热20min灭酶，离心，取上清液，为花生糖肽混合物，真空浓缩至固形物含量 70％以上，得到糖肽浓缩膏3。

糖肽浓缩膏3的苦味值和抗氧化值(ORAC和DPPH清除率)如表1。

添加糖肽浓缩膏3的调理肉在保藏过程中TBARS值、巯基含量和色差的变化 情况如图1、图2和图3。

对比例1

一种花生肽膏的制备方法，包括以下步骤：

(1)花生粕的预处理：加水使花生粕质量含量达到10％(w/w)，在110℃ 下加热1.5h，冷却至常温，得到花生粕浆液。

(2)控制酶解：

A、将花生粕浆液加热至50℃，加入花生粕质量0.5％的Alcalase 2.4L水解蛋 白酶(诺维信公司)和1.0％风味蛋白酶(诺维信公司)，当水解度达到8％时，在 95℃下加热15min灭酶，离心，取上清液，为花生粕酶解液A；

B、将花生粕浆液加热至50℃，加入花生粕质量0.8％的酸性蛋白酶和Alcalase  2.4L水解蛋白酶(诺维信公司)和1.2％风味蛋白酶(诺维信公司)，当水解度达 到10％时，在85℃下加热30min灭酶，离心，取上清液，为花生粕酶解液B；

C、将花生粕浆液加热至50℃，加入花生粕质量0.6％的Alcalase 2.4L水解蛋 白酶(诺维信公司)和1.5％风味蛋白酶(诺维信公司)，当水解度达到7％时，在 90℃下加热20min灭酶，离心，取上清液，为花生粕酶解液C；

(3)分别将花生粕酶解液A、B、C真空浓缩至固形物含量70％，分别得花 生肽膏A、花生肽膏B和花生肽膏C。

花生肽膏A、B、C的苦味值和抗氧化值(ORAC和DPPH清除率)如表1。

分别添加花生肽膏A、B、C的调理肉在保藏过程中TBARS值、巯基含量和 色差的变化情况如图1、图2和图3。

表1各实施例产品的苦味值及抗氧化指标

  苦味值 ORAC(umolTE/g) DPPH清除率(％) 0.5％L-异亮氨酸 10.0 / / 糖肽浓缩膏1 5.1 1542 67.2 糖肽浓缩膏2 4.8 1374 65.9 糖肽浓缩膏3 5.2 1706 68.1 花生肽膏A 7.3 934 49.7 花生肽膏B 7.0 883 45.5 花生肽膏C 6.8 892 48.3

调理肉由于方便快捷、附加值高、营养美味而受到越来越多消费者的青睐， 因此，调理肉的滋味质量是重要的指标之一，要求添加的食品辅料本身必须具 有较好风味。

由表1可知，采用实施例1-3和对比例1制得的产品其苦味值均比0.5％L-异亮 氨酸的苦味值要低，而采用本发明方法制备的糖肽浓缩膏其苦味值比采用常规 方法制备的花生肽膏苦味值要低得多。主要是因为本发明的方法中，活性炭结 合菊花可有效的祛除花生蛋白肽中的苦味成分，说明采用本专利方法制备的糖 肽浓缩膏应用到调理肉中不会给调理肉的风味造成负面影响。

调理肉在保藏过程中容易发生脂肪和蛋白质的氧化变质，脂肪氧化是指脂 肪酸与氧气作用发生的一系列反应，脂肪氧化生成过氧化物，而光、温度和金 属离子等因素又进一步促进氧化酸败，使过氧化物进一步分解产生醛、酮、酸 等，产生不愉快的臭味，从而导致食品腐败。而蛋白质氧化是蛋白质分子在活 性氧自由基(ROS)作用下，或通过次生氧化产物间接作用于蛋白质而导致的 蛋白质共价结构修饰。蛋白氧化机制被证实与脂肪氧化是相似的，也是由自由 基链式反应引起的。一般蛋白质氧化会同时伴随着脂肪的氧化，而脂肪的氧化 反过来又会促进蛋白质氧化，两者相互促进。因此，为了防止调理肉的脂肪蛋 白质氧化变质，在生产调理肉过程中需要添加抗氧化剂。

由表1可看出，采用本发明方法制备的糖肽浓缩膏的抗氧化值(ORAC值和 DPPH清除率)是采用常规方法水解得到的花生肽膏的1.5倍以上，说明采用本发 明方法制备得到的糖肽浓缩膏具有较强抗氧化潜力。

硫代巴比妥酸(TBARS)值是当前测定脂肪氧化最通用的方法，通过测定 脂肪氧化终产物丙二醛的含量来评定脂肪氧化程度。一般来说，TBARS值越大， 脂肪氧化的程度就越高，酸败就越严重。

调理肉保藏过程中TBARS值变化如图1所示。由图1可知，添加抗坏血酸的 调理肉在保藏过程中TBARS值变化不大，说明其可较好的抑制调理肉的氧化变 质。同时发现采用本发明方法制备的糖肽浓缩膏(实施例1-3)也可较好抑制调 理肉的氧化变质，而添加采用常规方法制备的花生肽膏与未添加任何抗氧化剂 的调理肉的TBARS值在第六天已经达到了0.76mg/kg，并在第9天超过了1mg/kg， 据文献报道，当TBARS值处于0.20～0.76mg/kg时，为良质肉；超过1mg/kg时， 为变质肉，被认为已严重氧化，产品不能食用。因此，采用本发明方法制备的 糖肽浓缩膏可较好的抑制脂肪发生氧化。

蛋白质氧化导致巯基氧化形成各种氧化产物，如次磺酸(RSOH)，亚磺酸 (RSOOH)和二硫交联物(RSSR)，且肉中巯基的总量是不受宰后肉的成熟过 程影响的，因此巯基含量是衡量蛋白氧化的重要指标之一。

调理肉保藏过程中巯基含量如图2所示。由图2可知，添加不同添加剂及 空白调理肉在保藏过程中巯基含量逐渐降低。空白调理肉巯基含量在保藏过程 中显著下降，保藏15天较初始下降75％。添加抗坏血酸、糖肽浓缩膏和花生肽 膏均能减缓巯基含量下降趋势，其中，添加抗坏血酸可显著减缓调理肉巯基含 量的下降趋势，添加采用本发明方法制得的糖肽浓缩膏次之，最后是常规方法 制得的花生肽膏。添加糖肽浓缩膏的调理肉保藏15天巯基含量最多下降48.6％， 由此可见采用本发明方法制备的糖肽浓缩膏具有显著抑制蛋白氧化作用。

色泽是肉制品感官品质之一，可通过感官评定和仪器分析来评价。肉色主要 是由肌红蛋白决定的，占肉制品总色素的80％；肌红蛋白分子类型、化学状态及 肉中其他成分的理化状态也有一定影响。研究表明，抗氧化剂对肉制品颜色具有 保持作用，通过延缓或抑制脂肪氧化，减少过氧化物、羟自由基等自由基生成， 抑制水分散失等。

肉丸保藏过程中色差变化如图3所示。由图3可知，添加不同物料的调理肉 在保藏过程中红度值逐渐增大，空白调理肉红度值上升趋势最大，其次为添加采 用常规方法制备的花生肽膏，然后是采用本发明方法制备的糖肽浓缩膏和抗坏血 酸。主要是因为糖肽浓缩膏和抗坏血酸抑制了调理肉中蛋白质和脂肪的氧化，保 持肉丸颜色。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。