抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶Sj TGR单区抗体及其制备方法

摘要

抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR单区抗体及其制备方法，属于生物技术的分子生物学、免疫学及药学技术领域。本发明提供了一种展示抗SjTGR蛋白的单区抗体的重组噬菌体展示库、抗SjTGR蛋白的单区抗体及其制备方法，所述的抗SjTGR单区抗体能与SjTGR蛋白特异性结合，和/或具有抑制SjTGR酶活性，可用于制备治疗血吸虫病的新药或治疗用药物的靶向载体。本发明为开发新的血吸虫病治疗药物及新的治疗方法奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及采用免疫学技术及噬菌体展示技术构建能展示抗Sj TGR蛋白单区抗体的重组噬菌体展示库，并从中筛选能展示能与Sj TGR蛋白结合的重组噬菌体，采用基因工程技术制备和纯化重组抗Sj TGR蛋白的单区抗体，该抗体可与Sj TGR蛋白结合和/或抑制Sj TGR酶活性，可破坏血吸虫生理代谢过程中的氧化还原平衡，导致血吸虫死亡。该抗体还可作为Sj TGR酶活性化学抑制剂的靶向载体，适用于新的血吸虫病治疗药物及靶向治疗方法的开发研究，属于生物技术的分子生物学、免疫学及药学等技术领域。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患病，全球有76个国家有血吸虫病流行，有约6亿人口受到血吸虫感染的威胁，有血吸虫病人2000多万。经过60年不懈努力，我国仍有约2.4亿人口受血吸虫感染威胁，有血吸虫病人20余万人，血吸虫病流行的自然条件依然存在。由于没有预防血吸虫感染的疫苗，血吸虫病的防治目前主要依靠药物治疗。吡喹酮是当前唯一的血吸虫病治疗药物，由于长期大规模的反复使用，曼氏血吸虫、埃及血吸虫已出现了抗吡喹酮的耐药株，而在我国流行的日本血吸虫亦出现了对吡喹酮敏感性下降的现象，给未来血吸虫病防治工作带来了严重的挑战。因此，开发新血吸虫病治疗药物及治疗方法是当前紧迫的科研任务。

生命过程是由一系列的生化代谢过程所组成，在这个过程中，体内许多蛋白分子被氧化，并产生大量的毒性氧分子。被氧化的物质必须经过还原才能恢复其生物学功能，毒性氧分子必须被分解才能去除毒性，这样生物体内的氧化还原重新达到平衡，生命活动过程才能得以延续。一旦这种平衡被破坏就会导致生物死亡。因此，干扰血吸虫生命过程中一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，则可能破坏血吸虫的某一重要生化代谢过程，导致血吸虫死亡，达到治疗血吸虫病的目的，是新药开发的有效策略。生命过程中的这些重要蛋白分子（亦称为生命过程必须的蛋白分子，essential molecules）是新药开发重要的潜在靶标分子。

已有的研究成果显示血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）是血吸虫氧化还原平衡代谢过程中的一个必须蛋白分子，抑制血吸虫TGR的表达或功能，可导致虫体死亡，是一个非常有潜力的抗血吸虫感染新药开发靶标，开发抗血吸虫TGR分子酶活性的抑制剂已成为血吸虫病治疗新药研究的热点。

蛋白酶抑制剂包括了化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。TGR是存在于细胞内的蛋白分子，因此，药物必须先进入细胞内才能与TGR分子结合而发挥药效作用。如果通过能进入细胞内的靶向载体将药物定向传递给细胞内的靶分子，将能有效提高药物的治疗效果，减少药物用量以及药物的副作用。靶向治疗由于其作用效果的高度特异性和选择性，已在抗病原感染和抗肿瘤治疗中获得广泛的应用。根据治疗靶标的结构特征，可以选择能与靶分子特异性结合的抗体分子或配体分子作为靶向载体，而特异性抗体是靶向治疗中使用最多的靶向载体。利用各种技术制备的抗体已广泛应用于疾病诊断、治疗、免疫干预、科学研究及工业化生产等领域，显示出巨大的发展前景。在脊椎动物体内，抗体是保护器官免受病原、恶性细胞和有毒分子侵犯的天然分子，它对靶标分子具有高度的特异性与亲和力。因此，选择抗体作为治疗药物或治疗药物的靶向载体是非常合理的选择。然而，常规的鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会出现严重的人抗鼠抗体反应（HAMA），并且存在分子量大、免疫原性强、穿透力弱和稳定性差等缺点，导致抗体作为治疗药物及靶向载体的应用受到限制。单区抗体（Single domain antibody），是来源于骆驼、羊驼和鲨鱼血清中的一种天然缺失轻链的功能性重链抗体IgG (Heavy chain antibodies，HCAb)的可变区（variable domain of the heavy chain of HCAb, VHH），又称纳米抗体(Nanobody)。与传统的抗体相比，单区抗体的特点是：分子量小，大约只有普通抗体的1/10，约15kDa，组织穿透力强，可以进入细胞内；单区抗体与传统抗体的VH区相似，但其结构和序列均有独特之处，单区抗体的CDR3较传统IgG的VH CDR3长，可以形成特殊的大型凸环结构，使它更容易结合到酶活性中心所在的裂隙，或凹穴中，是天然的酶活性抑制剂；此外，它还具有水溶性好、易于在原核生物中进行表达与生产，性质稳定、能耐高温及酸碱环境、免疫原性低、不易引起排异反应等优点。因此，单区抗体具备了作为新一代治疗性抗体和靶向载体的潜能。

如果制备抗SjTGR蛋白的特异性单区抗体，则该抗体将具备抑制Sj TGR活性的功能，并能进入细胞内杀灭血吸虫。从理论上讲，抗Sj TGR的特异性单区抗体具有治疗血吸虫病的药学及靶向的双重功能。若以抗Sj TGR单区抗体为载体，将抗Sj TGR的化学抑制剂递送进入血吸虫的细胞内，则可达到双重杀虫效果，同时还可以降低化学抑制剂的治疗剂量，从而减轻化学药物的副作用。因此，制备抗Sj TGR的特异性单区抗体，对发展新的抗血吸虫感染药物及治疗手段具有重要的应用价值。 

噬菌体展示单区抗体库是将一组编码单区抗体的基因片段插入到与噬菌体M13的外壳蛋白gⅢ基因的启始信号序列与其琥珀终止密码子之间，由于宿主菌TG1能产生一种抑制型的tRNA，抑制噬菌体上插入外源性基因和gene3蛋白基因序列之间的琥珀终止密码子，使插入外源性基因与gene3蛋白基因之间在转译时可以进行通读，从而使插入外源性蛋白与噬菌体的gⅢ蛋白之间发生融合表达，并一同展示在噬菌体表面。如果将SjTGR免疫骆驼的全部重链抗体基因插入到噬粒pCANTab5E中，便可构建成一个可能展示免疫骆驼体内全部的抗SjTGR重链抗体可变区的噬菌体展示库，又称之为抗SjTGR纳米抗体噬菌体展示库。如果将SjTGR蛋白固定在固相介质（如酶标板）上，使之与噬菌体展示库的全部噬菌体反应，那么噬菌体库展示抗Sj TGR特异性纳米抗体的重组噬菌体便可与固定在固相介质上的SjTGR蛋白相结合，通过洗涤去除未结合的或结合力弱的噬菌体，便可以获得展示抗Sj TGR蛋白特异性纳米抗体的重组噬菌体，既而获得编码抗Sj TGR蛋白特异性纳米抗体的基因，从而可以在体外采用基因工程技术大量生产、制备特异性抗Sj TGR蛋白的纳米抗体，并使纳米抗体象单克隆抗体一样永生化，可为随后的应用提供源源不断的抗体来源。噬菌体展示技术将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合起来，实现了由基因型到表型的转换，是抗体药物开发的一项革命性新技术。

目前关于抗SjTGR单区抗体的研究在国内、外均尚未见有报道。本发明以纯化重组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼，收集免疫驼白细胞，制备白细胞的cDNA，采用单区抗体基因特异性引物，通过PCR方法，扩增出编码骆驼抗体可变区（单区抗体）的基因片段。将此基因片段插入到噬粒载体中，构建重组噬粒库，通过噬菌体拯救，最终形成SjTGR免疫骆驼重链抗体可变区噬菌体展示库（又称单区抗体噬菌体展示库）。利用纯化的SjTGR蛋白筛选噬菌体展示库，获得展示抗Sj TGR特异性单区抗体的重组噬菌体，最后通过原核表达的方式制备纯化的抗Sj TGR单区抗体，为进一步发展基于抗Sj TGR单区抗体的血吸虫病治疗新药与治疗措施奠定了基础。

发明内容

本发明目的是构建了一个展示抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR单区抗体的噬菌体展示库，筛选抗Sj TGR蛋白特异性单区抗体，这些单区抗体能与SjTGR蛋白特异性结合，和/或抑制Sj TGR酶活性的功能，可用于血吸虫病治疗新药和治疗药物靶向载体的研究。

本发明的技术方案：一种单区抗体的噬菌体展示库，其含有SjTGR免疫新疆双峰驼全部的编码单区抗体的基因，可用于筛选和制备抗Sj TGR蛋白单区抗体，以及抗任何其它抗原分子或表位的特异性单区抗体的筛选和制备。

用所述单区抗体的噬菌体展示库筛选和制备的三株抗SjTGR的单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3，其可用于血吸虫病治疗新药的开发和血吸虫病靶向治疗载体、方法或其它基于此三株单区抗体的免疫检测、免疫干预和免疫治疗的免疫学应用。

抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶Sj TGR单区抗体的噬菌体展示库，是由一组含有编码Sj TGR免疫新疆双峰驼全部单区抗体基因的重组噬菌体组成，其中的每一个重组噬菌体均能在其表面表达一种抗体SjTGR的单区抗体。

所述的编码抗SjTGR单区抗体基因来源于采用重组Sj TGR免疫的新疆双峰驼，新疆双峰驼的免疫系统受到外来Sj TGR刺激后形成产生编码抗SjTGR单区抗体mRNA的血白细胞。编码抗Sj TGR单区抗体基因DNA片段在将SjTGR免疫双峰驼血白细胞mRNA反转录为cDNA后，通过聚合酶链反应扩增而获得。

所述的抗SjTGR单区抗体噬菌体展示库是将Sj TGR免疫新疆双峰驼血白细胞中编码单区抗体的全部基因通过基因重组技术插入到噬粒载体pCANTab5E中，构建重组噬粒库，该重组噬粒库包涵有编码抗Sj TGR单区抗体的全部基因。然后，将此重组噬粒群转化到大肠杆菌TG1中，在辅助噬菌体M13KO7的协助下包装成完整的噬菌体，形成一个能在表面展示抗SjTGR全部单区抗体的噬菌体展示库。 

所述的用于构建噬菌体展示库的优选噬粒载体是pCANTab5E，包括但不限于载体pCANTab5E。

所述的抗Sj TGR单区抗体噬菌体的展示库的应用，包括但不局限于用于筛选展示抗Sj TGR特异性单区抗体的噬菌体，亦可以用于抗其它抗原、配体分子的特异性单区抗体的筛选。所述的其它抗原、配体分子包括但不局限于大分子的有机化合物、无机化合物及其结合物。

所述的三株抗Sj TGR蛋白特异性单区抗体的名称分别为JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3。

所述的单区抗体JIPDYYNA-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.1保持有至少90%的同源性。

所述的单区抗体JIPDYYNA-1分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO：4。

所述的单区抗体JIPDYYNA-2分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.2保持有至少90%的同源性。

所述的单区抗体JIPDYYNA-2分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO：5。

所述的单区抗体JIPDYYNA-3分子的氨基酸序列与SEQ ID NO.3保持有至少90%的同源性。

所述的单区抗体JIPDYYNA-3分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO：6。

所述的抗Sj TGR的单区抗体包括但不局限于由本发明三株单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的氨基酸序列演变而产生的其它的具有与SjTGR结合，和/或抑制Sj TGR活性的单区抗体。

本发明用于筛选上述三株单区抗体的蛋白为重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）硒蛋白。

所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID NO：7，保持有至少90%的同源性。

所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO：8。

本发明提供一种筛选展示抗Sj TGR特异性单区抗体的噬菌体展示方法。具体地，以纯化的重组SjTGR包被酶标板，再与本发明构建的单区抗体噬菌体展示库的重组噬菌体进行结合，用洗涤液洗出未结合或结合弱的噬菌体，再用0.1M 甘氨酸溶液（pH2.2）洗脱与重组SjTGR特异性结合的噬菌体。将洗脱噬菌体感染大肠杆菌TG1，在辅助噬菌体的协助下扩增洗脱的噬菌体。以同样的方法重新进行筛选，如此重复筛选三次，最后获得能表达与重组Sj TGR蛋白特异性结合的单区抗体的重组噬菌体。

本发明还提供一种鉴定重组噬菌体中编码抗Sj TGR蛋白特异性单链抗体的外源性基因DNA序列，及单区抗体氨基酸序列的鉴定方法。

具体地，制备能与重组Sj TGR蛋白特异性结合噬菌体DNA，通过DNA序列分析确定噬菌体中编码单区抗体的外源性基因序列，再演绎成肽氨基酸序列。通过与Genbank中已经存在的蛋白质或多肽的氨基酸序列进行比对，确定该噬菌体表达的单区抗体的性质。

本发明提供一种原核表达单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的表达质粒构建方法及工程菌构建方法。

具体地，首先设计合成用于扩增编码单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的基因特异性引物，然后采用PCR方法从重组噬菌体基因组DNA中扩增出编码单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的DNA片段SEQ ID NO：4、5及6。然后将SEQ ID NO：4、5及6插入到一种表达载体pET-28a（+）中形成重组表达质粒JIPDYYNA-1-pET28a、JIPDYYNA-2-pET28a及JIPDYYNA-3-pET28a，然后将重组表达质粒JIPDYYNA-1-pET28a、JIPDYYNA-2-pET28a及JIPDYYNA-3-pET28a分别转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组单区抗体蛋白JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3。

本发明优选的表达质粒是pET28a（+）(美国Novagen公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的三株单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。

具体地，该重组表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子, 优选的启动子为T7。

所述的重组单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3蛋白的制备方法，包括转录、翻译、蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。

重组单区抗体的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：酶学分析，SDS-PAGE，Western Blotting等。

本发明提供一种纯化原核表达的重组单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3蛋白的方法。

具体地，在构建重组表达载体时将此三株单区抗体编码基因的5’端与表达载体pET28a（+）上编码6个组氨酸（6×his）的基因序列相融合，使表达得出来的单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的氨基端均带有一个由6个组氨酸组成的标签，然后利用此6个组氨酸标签能与金属离子结合的特点，采用镍离子亲和层析的方法纯化和制备三株单区抗体。

本发明提供一种原核表达单区抗体驼源性的鉴定方法。

具体地，将单区抗体表达细菌裂解液点在硝酸纤维素膜上，再与HRP标记的抗驼IgG二抗反应，用DAB显色，观察重组表达的单区抗体是否能被抗驼二抗所识别。

本发明提供一种鉴定原核表达单区抗体与重组Sj TGR蛋白结合能力的方法。

具体地，通过SDS-PAGE及电转移方法分别将重组表达单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3蛋白条带转移到硝酸纤维素（NC）膜上，再将含有单区抗体蛋白条带的NC膜与纯化的Sj TGR蛋白反应，洗去未结合的Sj TGR蛋白后，再与鼠抗Sj TGR血清反应，用HRP标记抗鼠IgG二抗检测，经化学发光显色，观察重组表达的单区抗体与重组Sj TGR蛋白的反应情况，以判断单区抗体与Sj TGR蛋白结合的能力。

 本发明提供一种测定重组单区抗体对Sj TGR蛋白的硫氧还蛋白还原酶活性抑制效果的分析方法。

具体地，硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性的测定方法是将5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）与还原型辅酶I（NADPH）混合，在有TGR存在的情况下，DTNB可被还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB），通过测定反应体系中TNB在波长为412 nm处吸收值的增加值来确定Sj TGR的TrxR的活性。在上述体系中加入一定数量的纯化单区抗体，观察其对SjTGR蛋白硫氧还蛋白还原酶活性的抑制作用。

本发明的有益效果：本发明构建的抗Sj TGR单区抗体噬菌体展示库包涵有新疆双峰驼全部单区抗体的编码基因，可用于抗任何抗原分子的特异性单区抗体的筛选与制备。筛选和制备的三株单区抗体能特异性地与日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）结合，其中单区抗体JIPDYYNA-3对Sj TGR的硫氧还蛋白还原酶具有抑制作用, 为开发新的血吸虫病治疗药物及血吸虫病治疗药物的靶向载体奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

附图说明

图1 纯化骆驼抗Sj TGR抗体IgG的SDS-PAGE分析，M 蛋白分子量标志物；1 健康骆驼血清；2 40%饱和硫酸铵沉淀骆驼免疫球蛋白。

图2 PCR扩增编码重链抗体IgG2、IgG3可变区基因，M、1kb标准DNA分子量标志物；1、IgG2可变区基因的PCR产物；2、IgG3可变区基因的PCR产物。

图3重组噬粒VHHn-pCANTab5E双酶切分析，M、1kb标准DNA分子量标志物；1-20、20个重组噬粒的Sfi1/Not1双酶切产物。

图4抗Sj TGR纳米抗体噬菌体库筛选噬菌体淘洗回收率。

图5 第三轮淘洗洗脱噬菌体DNA的限制性酶切分析，M、1 kb标准DNA分子量标志物；1-10、10个噬粒DNA的Sfi1/Not1双酶切产物。

图6三株纳米抗体的氨基酸序列比对

图7 编码纳米抗体基因的扩增，M、100 bp DNA分子量标志物；1 、JIPDYYNA-1扩增产物；2、JIPDYYNA-2扩增产物；3、JIPDYYNA-3扩增产物。

图8 重组质粒JIPDYYNA-1-pET28a，JIPDYYNA-2-pET28a， JIPDYYNA-3-pET28a的酶切分析，M、100 bp DNA分子量标志物；

1、重组的JIPDYYNA-1-pET28a质粒经Nde1/Not1双酶切产物；

2、重组的JIPDYYNA-2-pET28a质粒经Nde1/Not1双酶切产物；

3、重组的JIPDYYNA-3-pET28a质粒经Nde1/Not1双酶切产物。

图9 重组纳米抗体表达产物的分析，A：M、蛋白分子量标准；1、不含质粒的大肠杆菌BL21表达产物； 2、含空质粒pET28a(+)的大肠杆菌BL21表达产物； 3、含JIPDYYNA-1-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的全菌；4、 含JIPDYYNA-1-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的上清；5、含JIPDYYNA-1-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀；6、含JIPDYYNA-2-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的全菌；7、含JIPDYYNA -2-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的上清；8、含JIPDYYNA-2-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀。

B：M 蛋白分子量标准；1、不含质粒的大肠杆菌BL21表达产物；2、含空质粒pET28a的大肠杆菌BL21表达产物；3、含JIPDYYNA-3-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的全菌；4、含JIPDYYNA-3- pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的上清；5、含JIPDYYNA-3-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀。

图10 重组纳米抗体蛋白的纯化，M、蛋白质分子量标志物；1、纯化的重组JIPDYYNA-1蛋白；2、纯化的重组JIPDYYNA-2蛋白；3、纯化的重组JIPDYYNA-3蛋白。

图11 重组VHH的驼源性验证，1、重组JIPDYYNA-1表达菌裂解液；2、重组JIPDYYNA-2表达菌裂解液；3、重组JIPDYYNA-3表达菌裂解液；4、BL21菌裂解液；5、骆驼血清。

图12 免疫印迹分析重组纳米抗体与Sj TGR的相互作用，M、蛋白质分子量标志物；1-3、纯化的重组JIPDYYNA-1蛋白、JIPDYYNA-2蛋白及JIPDYYNA-3蛋白与Sj TGR反应，用鼠抗Sj TGR抗体及HRP标记羊抗小鼠二抗检测；4、纯化的重组JIPDYYNA-1蛋白不与S jTGR反应，用鼠抗Sj TGR抗体与羊抗小鼠二抗检测。

图13 JIPDYYNA-1与Sj TGR不同比例的混合物对Sj TGR酶活性的抑制作用。

图14 JIPDYYNA-2与Sj TGR不同比例的混合物对Sj TGR酶活性的抑制作用。

图15 JIPDYYNA-3与Sj TGR不同比例的混合物对Sj TGR酶活性的抑制作用。

下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。

实施例1：重组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼及血清抗体的制备

免疫前经驼颈静脉采血，分离血清，低温保存备用。首次免疫以重组纯化Sj TGR蛋白（500 μg）完全福氏佐剂抗原，经皮下多点注射新疆双峰驼的颈部皮肤，随后用同剂量不完全佐剂抗原进行加强免疫，免疫间隔为2周，共加强免疫4次。未次免疫后2周，经骆驼颈静脉采血50 mL，分离血清。以重组Sj TGR蛋白的碳酸缓冲液（10 μg/mL）包被酶标板，4℃过夜，第二天用5%的脱脂奶粉PBS封闭，37℃2h，再与倍比稀释的免疫驼血清反应，再与HRP标记的兔抗骆驼IgG二抗反应，用底物TMB显色，测定Sj TGR免疫新疆双峰驼血清Sj TGR蛋白抗体的效价。

按以下方法进行骆驼血清抗体IgG的纯化。使用医用采血针采集免疫前青年雌性新疆双峰，4 ℃过夜析出血清。根据Hanan M. EL-Hewairy法使用40%饱和硫酸铵沉淀出骆驼总抗体IgG，纯化过程如下：

1）取骆驼血清5 mL用生理盐水稀释至50 mL，加入33.3 mL饱和硫酸铵，逐滴加入并进行搅拌。

2）将烧杯放置4℃静置过夜析出免疫球蛋白。

3）以3500 rpm,4 ℃离心20 min,弃上清，沉淀用20 mL生理盐水溶解。

4）将溶解的蛋白溶液放入透析袋中， 用1×PBS 进行透析，4 ℃磁力搅拌，每  2 h更换一次透析液，向透析液中滴加1%氯化钡溶液，检测透析液中是否有硫酸铵存在，直至透析液中加入氯化钡不产生白色雾状物,表示硫酸铵已透析干净。

6）取少量透析后样本进行12% SDS-PAG电泳，观察纯化效果。

结果：经过5次免疫骆驼血清中抗Sj TGR蛋白抗体的效果达到1︰12800，表明免疫获得成功。经过饱和硫酸铵沉淀，制备了纯化的骆驼抗Sj TGR抗体IgG。如图1所示。

实施例2：编码骆驼抗Sj TGR纳米抗体基因片段的制备

    以1000 rpm离心Sj TGR免疫骆驼抗凝血10 min, 分离血浆和血细胞。采用percoll(GE Health产品)配制比重为1.07的骆驼白细胞分离液，将抗凝血细胞加于白细胞分离液的上层，以3000 g 的转速在4 ℃离心30 min，收集界面的白色细胞层于一新的无菌离心管中，加入无菌PBS悬浮并洗涤细胞，1000 rpm 离心10 min，去上清，再加入PBS，如此反复洗涤细胞3次，收集细胞沉淀，并计数。

采用Trizol抽提Sj TGR免疫骆驼外周血白细胞总RNA，方法如下：

1) 取约1×10⁷个Sj TGR免疫新疆双峰驼外周血白细胞，按Trizol说明书要求的比例加入相应体积的Trizol，用无菌枪头混匀数次；

2) 室温放置5 min，让细胞核蛋白复合体完全解离；

3) 按1 mL Trizol试剂加入0.2 mL氯仿的比例向裂解液中加入氯仿，盖紧盖子；

4) 剧烈晃动试管15 Sec，室温孵育2-3 min；

5) 将样品4℃、12000 g离心15 min，离心后液体分为3层，底层是红色酚-氯仿层，中间层和无色上层液相，RNA完全存在于上层水相中；

6) 将上层液小心转移至一个新的离心管中；

7) 加10 μg无RNA酶的糖原和醋酸钾(3M)，混匀，再加入2倍体积的冷无水乙醇，混匀后，-20 ℃沉淀过夜；

8) 以4 ℃、12000 g离心10 min，去上清（此时可见RNA白色沉淀）；

9) 用75%乙醇洗涤沉淀2次，再以4 ℃、12000 g离心10 min。尽量去净上清；

10) 将沉淀在室温中干燥5-10 min至沉淀变至半透明，可加入50 μL RNase-free水溶解RNA沉淀。

采用磁珠亲和层析法制备Sj TGR免疫骆驼外周血白细胞mRNA，方法按Invitrogen公司的Dynabeads mRNA纯化试剂盒的说明书。

1) 将获得的总RNA中加入试剂盒中的Lysis/Binding Buffer，补至总体积为1 mL；

2) 充分重悬试剂盒中的Oligo(dT)25磁珠液，吸取1mL磁珠至一个RNase-free的15 mL离心管中，然后将离心管放在磁力器上；

3) 静置至管中液体变清，用移液管吸出管中的液体，将离心管从磁力器上取出，加入1 mL新鲜的Binding Buffer，重悬洗涤磁珠；

4) 将离心管重新放在磁力器上，静置至管中液体变清，然后吸出液体；

5) 从磁力器上取出离心管中加入1 mL样本裂解液重悬磁珠，再将含有总RNA的样本加入磁珠中，混匀；

6) 在室温下持续轻柔混匀管中的液体10 min，使mRNA的“A尾”与磁珠上的Oligo(dT)25结合；

7) 将离心管放在磁力器上静置2 min，待管中的液体变清后，吸出液体；

8) 室温下用2 mL Washing Buffer A洗涤2次磁珠/mRNA复合物。用磁力器将磁珠从洗涤液中分离，吸出Washing Buffer A；

9) 加入1 mL cDNA第一链合成Buffer洗涤磁珠一次，在磁力作用下分离磁珠，吸出上清液；

10) 最后加入50 μL Elution Buffer（10 mM Tris-HCl，pH7.5），并在80 ℃孵育2 min，随即立即放置于磁力器上分离磁珠，并将包含mRNA的上清转移至一个新的RNase-free管中，并放置于冰上保存；

11) 以Elution Buffer作为空白对照，用Nanodrop 2000紫外核酸蛋白测定仪测量获得的mRNA的浓度和纯度。

使用Pusion^TM RT-PCR kit合成Sj TGR免疫骆驼白细胞第一链cDNA，操作按照说明书：

在一无菌0.5 mL离心管中加入以下成分：

            mRNA                           10 μL

            Oligo(dT) Primer             1 μL

            RNase-free H₂O                4 μL

                      总计       15 μL

混匀后70 ℃水浴10 min，然后立即放置冰上，加入以下试剂：

          5×RT Buffer                    5 μL

          10mM dNTP Mix           1.25 μL

          RNase-free H₂O              2.75 μL 

    混匀后37 ℃孵育2 min，然后加入1μL M-MLV逆转录酶，总体积共25 μL。

将反应管置于42℃保温60 min，随后置80℃加热10 min，终止反应。合成的cDNA置4℃保存。

扩增编抗Sj TGR单区抗体基因的引物设计

根据文献报道的编码骆驼单区抗体基因序列，设计扩增双峰驼两个亚类重链抗体（IgG2, IgG3）可变区引物，以骆驼重链抗体（HCAb）可变区VHH 的前导肽保守序列作为共同上游引物，并引入Sfi1酶切位点，引物序列如下：

VHH-P1：5'-CATGCCATGA CTCGCGGCCC AGCCGGCCGT CCTGGCTGCT CTTCTACAAG G-3'（划线部分为Sfi1酶切位点）。

两种亚型HCAb 特异的铰链区序列作为下游引物并引入Not1酶切位点，引物序列分别为：

VHH-P2-IgG2：5'-CGGCACCGGC GCACCTGCGG CCGCCGTGCA TTCTGGTTCA GGTTTTGGTT GTGG-3'（划线部分为Not 1酶切位点）；VHH-P3-IgG3：5'-CGGCACCGGC GCACCTGCGG CCGCCTTGCA TACTTCATTC GTTCC -3' （划线部分为Not 1酶切位点）。

引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

编码抗Sj TGR单区抗体基因的扩增

分别以两对引物VHH-P1/VHH-P2（IgG2）；VHH-P1/VHH-P3（IgG3）从TGR免疫骆驼血白细胞cDNA中扩增出编码IgG2、IgG3重链可变区的基因片段，并使之5’、3’端分别带有Sfi1、Not1酶切位点。扩增体系如下：   

IgG2扩增：

           5×phusion HF buffer       20 μL

           dNTPs(10 mM）               2 μL

           VHH-P1 (50 μM）             2 μL

           VHH-P2（IgG2）(50 μM）      2 μL

           cDNA模板                  10 μL

          Phusion高保真酶            1 μL

           ddH₂O                      63 μL

   总计                      100 μL 

扩增条件如下：98℃、预变性30 s；98℃、变性10 s，50℃、退火35 s，72℃、延伸40 s，进行35个循环；72℃、10 min，4℃保存。

IgG3扩增：

               5×phusion HF buffer       20 μL

               dNTPs(10mM）           2 μL

               VHH-P1 (50μM）        2 μL

                VHH-P3(IgG3) (50μM）   2 μL

               cDNA模板              10 μL

               Phusion高保真酶         1 μL

              ddH₂O                 63 μL

              总计                  100 μL 

扩增条件如下：98℃、预变性30 s；98℃、变性10 s，55℃、退火35 s，72℃、延伸40 s，进行35个循环；72℃、10 min；4℃保存。

    取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，观察扩增产物状况。

编码抗Sj TGR蛋白单区抗体基因DNA的纯化

将编码IgG2、IgG3重链抗体可变区的PCR产物分别进行低熔点琼脂糖凝胶(NuSieve GTG 琼脂糖，1%）电泳，紫外灯下割取含有预期大小的目的DNA片段胶块，置于冰上。用两倍体积的1×β琼脂糖酶I buffer浸泡胶条两次，每次30 min，平衡胶条。吸净缓冲液后，将胶块置65 ℃加温融化10 min，然后降温至42℃。向已融化的琼脂糖胶液中加入2 U的β琼脂糖酶I，在42 ℃消化1 h。然后在65 ℃加热15 min，失活β琼脂糖酶I。高速离心1 min，将上清液转移到另一干净离心管中。

采用Promega公司的PCR产物纯化试剂盒（Wizard SV Gel and PCR clean-up System）从琼脂糖消化液中纯化编码单区抗体DNA片段，纯化过程如下：

1）在上述琼脂糖消化液中加入等体积的Membrance Bingding Solution，混匀；将SV Minicolumn置于Collection Tube中； 

2）将样本液和Membrance Bingding Solution的混合物加入到SV Mini column中，室温静置1 min； 

3）14，000 rpm离心1 min，将离出的液体倒出，重新放好SV Mini column； 

加 700 μL的Membrane Wash Solution，14，000 rpm离心1 min，将离出的液体倒出，重新放好SV Mini column； 

4）再向柱中加入500 μL的Membrane Wash Solution，14 000 rpm离心1 min，将离出的液体倒出，以相同的转速离心1 min以去除残余的液体； 

5）将 SV Minicolumn置于一干净的1.5 mL离心管中，加 50 μL的Nuclease-Free Water 到SV Mini column柱的硅胶膜上，室温下放置1 min，14，000 rpm离心1 min；收集纯化的目的基因片段，置-20℃保存；用Nanodrop 2000 核酸蛋白测定仪测定纯化DNA片段的浓度与纯度。

结果：使用纯化重组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼，经过5次免疫，ELISA法检测骆驼血清抗Sj TGR抗体IgG的水平达到了1:12800，获得了较好的免疫效果。收集免疫骆驼外周血液中的白细胞，用Trizol法制备细胞的总RNA，再用Invitrogen公司mRNA磁珠分离试剂盒纯化mRNA，获得4.456 μg 免疫骆驼白细胞的mRNA，其OD260/OD280的比值为2.23。

采用NEB的反转录PCR试剂盒中第一链cDNA合成系统，合成了免疫骆驼血白细胞的第一链cDNA。利用基因特异性引物，以免疫骆驼白细胞cDNA为模板，分别扩增IgG2和IgG3重链可变区基因片段，均获得分子量约500 bp的DNA片段，如图2。

实施例3: 抗Sj TGR单区抗体噬菌体展示库的构建

采用Sfi1和Not1双酶切方法制备线性化噬粒pCANTab5E DNA和酶切编码纳米抗体的DNA片段，酶切反应体系如下：

pCANTab5E DNA片段       30 μL

                10×Buffer4                              5 μL

                100×BSA                               0.5 μL

                Not1-HF                            1 μL

                ddH₂O                                 2.5 μL 

                总计                     49 μL 

混匀离心后，置37℃水浴反应4 h。加入Sfi1 1 μL混匀离心后，置50 ℃水浴保温3 h。

酶切产物的回收：将上述酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，100 V电压电泳60 min后，观察酶切产物状况。从琼脂糖胶上切下含有目的片段胶块，用Promega 公司 DNA胶回收纯化试剂盒纯化双酶切的线性化噬粒pCANTab5E DNA片段。酶切后纳米抗体基因片段用Promega 公司DNA胶回收纯化试剂盒直接进行纯化，方法按操作说明书。用Nanodrop 2000 核酸蛋白测定仪测定纯化的线性化噬粒pCANTab5E DNA和纳米抗体DNA片段的浓度与纯度。

连接：采用Lucigen公司的CloneDirect Rapid Ligation Kit进行连接。将双酶切的纳米抗体IgG2和IgG3 DNA 片段和线性化噬粒pCANTab5E DNA按3:1摩尔比混合，在DNA 连接酶的作用下进行连接，连接体系如下：

10×ligase Buffer          1 μL

VHH DNA片段          5 μL

pCA NTab5E             3μL

Clone Smart DNA ligase    1 μL

总计                   10 μL

反应条件：23 ℃水浴孵育2 h，然后在70 ℃ 加热15 min终止反应。

为了扩大噬粒库的多样性，本研究分别进行了5次连接反应，共得到50 μL连接产物。

浓缩：将50 μL连接产物用无菌水稀释至300 μL，加2倍体积无水乙醇，混匀后置-30 ℃沉淀3 h；在4 ℃以12000 g离心30 min，弃上清，在室温干燥5-10 min；沉淀物用10 μL无菌水在4 ℃溶解3 h，最后获得约10 μL的连接产物。

转化：采用电脉冲方法将连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞。方法如下：

1）将狭缝为0.1 cm电击杯和1.5 mL离心管放在冰上预冷；

2）从-80 ℃取出TG1感受态细胞，放冰上10-15 min待完全解冻；

3）吸取25 μL感受态细胞至预冷过的无菌离心管中（置冰上），加入2 μL连接产物，用枪头轻柔搅匀，冰上放置30 min；

4）将TG1感受态细胞/DNA混合物从离心管小心转移至电击杯的狭缝中，不要产生气泡，冰上放置5 min；

5）设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压 2.5 kV，电容 25 μF，电阻200 ?；将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止；

6）取出电击杯，加入0.975 mL 37 ℃预热的SOC培养基，混匀后将细菌液转移到一无菌玻璃试管中，37 ℃，120 rpm 振荡培养1 h； 

7）以相同的方法重复转化5次，将所有连结产物进行电转化；将转化产物混合后分成6份分别涂布至6块24×24cm的2×YT平板上（Amp 100 μg/mL，Glucose 2%）；室温下放置，待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37 ℃培养箱生长过夜；

8）纳米抗体噬粒库的保存：用10 mL 2×YT培养基将6个培养板上的菌落全部刮洗下后混合在一起，加入终浓度为20%的无菌甘油，分装成1 mL/支，-80℃保存备用。

库容的计算：

1）取刮洗下的噬粒库菌液10 μL，用 2 ×YT培养基做梯度稀释后，分别取100 μL 涂2 ×YT板，37℃生长过夜后，取菌落全部为单克隆的平板计数单个克隆数；

2）以平板上全部单个克隆数乘以稀释倍数，再除以该平板上涂布菌液的体积（mL）则为重组噬粒库的库容量。

噬粒库重组率的鉴定

从平板上随机挑取20个单菌落，转种到3 mL LB液体培养基中37 ℃培养过夜，用Promega 公司质粒 DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit）抽提质粒，方法按操作说明书。

用限制性内切酶Sfi1和Not1对20个单个菌落中的质粒进行双酶切，分析其重组率。反应体系如下：

质粒DNA          10 μL             

10×NEB Buffer4      2 μL

100×BSA          0.2 μL

Not1-HF            1 μL

ddH2O            6.8 μL

总计              19 μL

混匀离心后，置37 ℃水浴箱反应4 h；再加1 μL Sfi1 混匀离心后，置50℃水浴箱反应过夜。

将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳40 min，凝胶成像仪上观察重组噬粒DNA的酶切产物是否含有分别与纳米抗体基因片段及线性化pCANTab5E大小相似的DNA条带，并计算重组率。

展示抗Sj TGR纳米抗体重组噬菌体的拯救

1）接种10倍库容量的噬粒库菌液于50 mL 2×YTAG（氨苄100 μg/mL，葡萄糖20% w/v）中，37 ℃、200 rpm振荡培养，每间隔30 min测OD_600nm一次，在OD值接近0.4时，再每20 min测一次，直至OD₆₀₀=0.4；

2）按感染复数（MOI）20:1的比例（即每20个辅助噬菌体感染一个大肠杆菌）在菌液中加入适量数目的辅助噬菌体M13KO7，37 ℃、200 rpm继续培养1 h；

3）以4000 rpm离心10 min，去上清，细菌沉淀重悬于50 mL 2×YTAK（氨苄：100 μg/mL，卡那霉素：50 μg/mL）培养基中，30 ℃、200 rpm培养过夜；

4）第二天，将培养液转移至离心管中，4 ℃以8,000 g离心10 min，然后将上清转移至一个新的管中，弃沉淀（此时噬菌体在上清液中）；

5）重新离心上清液，将80%上清液小心转移至一个新管中，并加入1/6体积的20%PEG/2.5M NaCl，倒转混匀后4 ℃静置沉淀过夜；

6）将沉淀过夜的液体4 ℃以12,000 g离心15 min，弃上清，再次快速短暂离心后将剩余液体吸尽，噬菌体为吸附在管壁上的白色沉积物；

7）用TBS溶解噬菌体沉淀物，室温以14,000 rpm离心5 min；

8）将上清液转移至一个新离心管，加1/6体积的20% PEG/2.5 M NaCl，冰浴放置1 h，4 ℃以14,000 rpm离心10 min，弃上清，短暂快速离心后吸尽剩余上清；

9）用TBS重新悬浮沉淀，室温以14,000 rpm离心1 min，吸取上清至另一新管中，加灭菌甘油至终浓度为30%，混匀并保存于4 ℃；此即为抗Sj TGR单区抗体噬菌体展示库。

抗Sj TGR单区抗体噬菌体展示库滴度测定，方法如下：

1）从2×YT板上挑取TG1单个菌落接种至5 mL 2×YT培养基中，37 ℃振荡培养至OD_600nm≈0.5；

2）当细菌生长时，将顶琼脂用微波炉融化后，分装9 mL到无菌管中，并保持在45 ℃水浴中；

3）用预温的2×YT液体培养基连续稀释库噬菌体液，稀释度分别为1︰10³、10⁵、10⁷、10⁹、10¹¹、10¹²；

4）当TG1菌到达对数生长期时，分别取200 μL加至每个离心管中，每管中加入10 μL一个稀释度的噬菌体液，混匀，室温下感染5 min；

5）将感染的细菌/噬菌体混合物转移到45 ℃预温的顶脂中，颠倒混匀后，快速倾倒37 ℃预热的2×YT平板，旋转平板使顶琼脂均匀分布于平板的表面；

平板冷却10 min后, 倒置，37 ℃培养过夜；

6）选取平板上噬菌斑独立分布的平板，计数噬菌斑数，并计算噬菌体的滴度（pfu/mL）。

结果：将扩增的重链抗体IgG2及IgG3可变区（VHHn）基因片段连接到噬粒载体pCANTab5E中构建重组噬粒VHHn-pCANTab5E。通过多次电转到宿主菌TG1大肠杆菌中，全部涂多块2×YT平板后获得存在于宿主菌中的VHHn- pCANTab5E噬粒库。噬粒库的库容量约为4.5×10¹⁰ CFU/mL。

随机从连接产物转化平板上挑选20个单个菌落，抽提噬粒DNA后进行Sfi1/Not1双酶切，酶切产物的电泳结果显示20个单菌落噬粒DNA经双酶切后，均可产生与骆驼重链抗体可变区（VHH）大小相似，长度约400-500 bp的插入DNA片段，如图3。提示本次制备的纳米抗体噬粒库的重组率达100%。

以M13KO7辅助噬菌体感染纳米抗体噬粒库进行噬菌体拯救，获得展示单区抗体的重组噬菌体展示库，库的效价为4×10¹² pfu/mL，总体积为8 mL。

实施例4： 展示抗Sj TGR单区抗体重组噬菌体的筛选

方法如下： 第一轮淘洗 

1) 挑取大肠杆菌TG1单个菌落，分别接种于10 mL、20 mL的LB培养基中，37℃剧烈振摇至对数生长期，用于噬菌体滴度测定和扩增； 

2) 将纯化的Sj TGR蛋白用0.1 M NaHCO₃（pH 8 .6）溶液配成浓度为1000 μg/mL的溶液，取1 mL（1000 μg）蛋白溶液包被 12孔细胞培养板，4℃过夜； 

3) 将包被液倒掉后，在干净的纸上拍干，去除剩余的液体，再在孔中加满封闭液（5%的脱脂奶粉PBS），置 37℃封闭2 h； 

4) 倒掉封闭液后同法拍干，用 TBST (TBS+0.1%[v/v]Tween-20)洗板，洗板 6次；

5) 用TBST将噬菌体展示库噬菌体（8×10¹³ pfu）稀释至1 mL，加入到包被好的板孔中，室温下轻柔混合，结合 60 min； 

6) 倒掉未结合的噬菌体，然后再拍干，去除残余液体；

7) 用 TBST洗板 10次，再用TBS洗5次。（吸干时每次采用新的纸巾防止交叉污染）；

8) 向孔内加入 900 μL甘氨酸液（0.1M，pH2.2）在室温中轻轻摇动10 min，洗脱结合的噬菌体；然后迅速将洗脱液转移到一个新的无菌管中，加入100 μL Tris-HCl(1 mol/L、pH8.0)，中和pH至约为7.0；

9) 噬菌体扩增： 将洗脱液接种到10 mL对数生长期（OD₆₀₀nm= 0.5）的TG1菌液中，室温孵育30 min后，取10 μL菌液进行梯度稀释，与顶琼脂混合后分别涂布于2×YT平板表面，测定洗脱液中噬菌体的滴度（pfu/mL）；

10）其余的菌液转种到 50 mL的2×YTA培养液中，37℃，200 rpm培养至OD_600 nm约为0.4后，加入100 μL M13KO7辅助噬菌体(10¹² pfu)，感染30 min后补加卡那霉素至终浓度为50 μg/mL，37℃、200 rpm培养过夜；

11) 按照实施例3的方法，用PEG/2.5M NaCl对过夜培养的噬菌体进行沉淀收集，上清液即为扩增的噬菌体；

12) 按实施例3的方法对第一轮淘选、扩增的噬菌体进行滴度测定，扩增的噬菌体加入等体积的无菌甘油，混匀，4℃储存。

第二轮淘洗 

以1 mL(100 μg)纯化Sj TGR蛋白包被12孔细胞培养板，4℃包被过夜，封闭后加入第一轮淘洗后扩增的噬菌体，按第一轮筛洗步骤5)-12)进行第二轮淘洗，所用噬菌体为第一轮扩增的噬菌体液（10¹² pfu），洗液中吐温的浓度增加到 0.5%（v/v）。

按照第一轮的方法测定第二轮洗脱的噬菌体数量，并进行噬菌体扩增、浓缩及滴度测定。

第三轮淘洗 

以1 mL(10 μg)纯化Sj TGR蛋白包被12孔细胞培养板，4℃包被过夜，封闭后加入第一轮淘洗后扩增的噬菌体，按第一轮筛洗步骤5)-12)进行第三轮淘洗，所用噬菌体为第二轮扩增的噬菌体液（10¹² pfu）。

重组噬菌体的鉴定

限制性酶切分析：将第三次淘选获得的噬菌体感染TG1细菌，随机挑选平板上10个单个菌落，分别接种到10个3 mL 2×YTA培养基中。37 ℃、200 rpm摇菌过夜。次日用 Promega 公司质粒DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit）提取10个菌落的噬粒。用限制性内切酶Sfi1和Not1同时进行酶切分析，反应体系如下：

                   质粒DNA         10 μL

                  Not1-HF            1 μL

                   100×BSA          0.2 μL 

                      10×NEB Buffer 4     2 μL

                    ddH₂O            6.8 μL

                   总计              19 μL

混匀离心后，置37℃水浴箱反应4 h。再加1 μL Sfi1 混匀离心后，置50 ℃水浴箱反应过夜。

将酶切产物全部进行1％琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳40 min，凝胶成像仪观察噬粒DNA是否被酶切成两条分别与预期纳米抗体及线性化pCANTab5E大小相似的DNA条带。

DNA序列分析：从第三次淘洗获得的噬菌体感染TG1细菌平板上随机挑选100个单菌落分别接种到100个3 mL 2×YTA培养基中。37 ℃、200 rpm摇菌过夜。次日用Promega 公司质粒 DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit）提取噬粒DNA。所获得的噬粒样本全部寄送至上海invitrogen公司，用噬粒pCANTab5E上游引物（引物序列：CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC）进行单向测序，并对测序结果进行分析。

结果：以M13KO7辅助噬菌体感染纳米抗体噬粒库进行噬菌体拯救，获纳米抗体重组噬菌体展示库，库的效价为4×10¹² pfu/mL，总体积为8 mL。

 用纯化的重组Sj TGR蛋白包被酶标板，再与纳米抗体噬菌体展示库中的重组噬菌体结合，进行3轮淘洗后，随着Sj TGR包被量的降低，淘洗次数的增加，以及淘洗条件逐渐严谨，特异性结合的噬菌体呈显著的富集趋势，噬菌体回收率明显增加。各轮淘洗获得噬菌体的数据如表1及图4。

表1各轮淘洗噬菌体的回收率

从第三轮筛选洗脱噬菌体感染TG1细菌的平板上随机选10个单菌落，抽提噬粒DNA，用Sfi1/Not1进行双酶切分析，酶切产物琼脂糖电泳结果显示，其中有8个单菌落的噬粒中含有400-500 bp的外源性插入DNA片段（图5），表明第三轮洗脱噬菌体的重组百分率约为80%。

将第三轮淘洗获得的噬菌体感染TG1细菌，随机挑选了100个单菌落，抽提噬粒进行DNA测序，对测序结果用VectorNTI10软件进行分析。测序成功的噬粒有93个，含有约500 bp大小外源性插入DNA片段的噬粒有69个。将此69个外源性插入DNA序列翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列同源性比对。结果显示第3号克隆单区抗体编码基因序列长度为429 bp，相同的克隆有27个；第67号克隆单区抗体编码基因序列长度为441 bp, 相同的克隆有8个；而第54号克隆单区抗体的编码基因序列长度为441 bp，相同的克隆有2个；其余的单区抗体序列均没有重复（表2），3株纳米抗体分别被命名为：JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-3及JIPDYYNA-2，氨基酸序列对比结果如图6。

表2 序列同源纳米抗体克隆的分布

通过对3株纳米抗体氨基酸序列进行对比，根据IMGT法对序列进行结构划分，这3株纳米抗体均为骆驼重链抗体的可变区，均含有重链抗体可变区两个标志性的半胱氨酸残基（C22、C97），其骨架区（FR2区）含有VHH亲水性氨基酸特征性位点F37，E44，R45，G47，羰基端氨基酸序列中均含有GTNEVCK域，为IgG3亚型铰链的特征序列，表明此三株纳米抗体皆为IgG3亚型抗体。JIPDYYNA-1的CDR3长度为18个氨基酸，JIPDYYNA-2的CDR3长度为20个氨基酸，JIPDYYNA-3的CDR3长度为21个氨基酸，均大于常规抗体IgG 重链可变区CDR3的长度（9-12个氨基酸）。另外，将JIPDYYNA-1氨基酸序列与NCBI数据库登录进行Blast同源序列比对，发现JIPDYYNA-1与单峰驼与羊驼来源VHH序列的同源性为60%-62%。

实施例5：单区抗体的原核表达质粒的构建与鉴定

单区抗体基因的扩增

引物设计：重新设计扩增编码单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3基因片段的引物，使上游引物5’端带上Nde1酶切位点，下游引物5’端带上Not1位点。引物序列如下：

P1：5'-CGCCATATGT CCTGGCTGCT-3'，

P2：5'-CGCCATATGT CCTGGCTTGC TCTT-3'，

P3：5'- ATTTGCGGCC GCCTACTTGC ATACTTCATT CGTTCC-3 '。

引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

基因扩增：分别以噬粒JIPDYYNA-1-pCANTab5E、JIPDYYNA-3-pCANTab5E DNA为模板，P1作为上游引物，P3作为下游引物，扩增编码JIPDYYNA-1及JIPDYYNA-3的基因DNA片段；

以噬粒JIPDYYNA-2-pCANTab5E为模板，P2作为上游引物，P3作为下游引物扩增出编码JIPDYYNA-2的基因DNA片段。扩增体系如下：

10×buffer                            5 μL

25 mM MgCl₂                                    5μL

10 mM dNTP                      1μL

JIPDYYNA/pCANTab5E    1μL

上游引物（50 mM）          1μL 

下游引物（50 mM）          1μL

Taq酶                                1μL

           ddH₂O                               35μL

                总计                             50 μL

扩增条件：95℃、3 min；95℃、20 s，60℃、35 s，72 ℃、60 s，30个循环；72℃、10 min；4℃保存。

取5-10μL JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察PCR扩增结果。三株纳米抗体的基因片段扩增产物均为单一特异性的DNA带。采用 PCR产物纯化试剂盒（Wizard SV Gel and PCR clean-up System）直接进行DNA纯化。

编码单区抗体基因的TA克隆

连接：将纯化回收后的纳米抗体DNA片段与TA clone载体pGEM T-Easy DNA按照分子摩尔数3︰1的比例混合，在T₄ DNA连接酶的作用下连接，构建重组质粒 JIPDYYNA-1/JIPDYYNA-2/JIPDYYNA-3-pGEMT。连接体系如下：

              2×Ligation buffer                          5μL

              pGEMT-Easy Vector                      1μL

              JIPDYYNA-1、2、3 DNA            3μL

              T4 DNA Ligase                          1μL

                  总计                                      10μL

               4 ℃连接过夜

电转化

1) 取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，小心混匀，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min； 

2) 将连接产物与感受态细胞的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1 cm的电击杯中，转移过程中勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水； 

3) 设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200 ?。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止； 

4) 取出电击杯，加入0.5 mL 37℃预热的SOC培养基，混匀后将细菌液转移到一无菌玻璃试管中，37℃、120 rpm振荡培养40 min；

5) 取200 μL菌液均匀涂布于表面预先涂有40 μL X-gal（40 mg/mL）的LB平板上（含 Amp 100 μg/mL）。室温下放置，待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于 37℃培养箱过夜。

阳性克隆鉴定

1) 蓝/白筛选 在LB平板上出现白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆；

2) Nde1/Not1双酶切鉴定：从 LB平板上挑取单个的白色菌落接种于3 mL LB培养基37 ℃、200 rpm培养过夜。用质粒DNA纯化试剂盒（Wizard Plus Minipreps DNA Purification System）抽提质粒。将质粒分别用Nde1/Not1限制性内切酶做双酶切，酶切反应过程如下：

         10×NEB buffer 4                         2 μL

         质粒DNA                                    13 μL

         Nde1                                      0.5 μL

         Not1                          0.5 μL

         ddH₂O                                      4 μL

           总计                                      20 μL

        37 ℃反应过夜，65 ℃ 20 min失活

    将酶切产物进行1%的琼脂糖电泳，在紫外灯下观察酶切结果。

3) DNA序列分析 将酶切鉴定阳性的菌落送到上海生工生物工程技术有限公司进行DNA序列测定。

重组表达质粒的构建与鉴定

双酶切单区抗体基因DNA片段及线性化质粒pET28a(+) DNA的制备

将纯化的JIPDYYNA-1/JIPDYYNA-2/JIPDYYNA-3-pGEMT质粒DNA和表达质粒pET28a(+) DNA，同时分别用Nde1和Not1-HF进行双酶切。反应体系如下：  JIPDYYNA基因或质粒pET28a(+)       30 μL

  100×BSA                            0.5 μL

  10×NEB Buffer4                       5 μL

  Nde1                                 2 μL

  Not1-HF                              2 μL

  总计                                50 μL

混匀离心后，置37℃水浴酶切过夜。

JIPDYYNA-1/JIPDYYNA-2/JIPDYYNA-3基因和质粒pET28a(+)酶切产物的回收

将上述酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，100 V电压电泳40 min后，从胶上切下含有目的片段胶块，用Promega公司DNA胶回收纯化试剂盒纯化双酶切的VHH片段和线性化质粒pET28a(+) DNA。

连接：将双酶切的纳米抗体DNA片段和线性化质粒pET28a(+) DNA按3︰1比例混合，在T₄ DNA 连接酶的作用下进行连接，连接体系如下：

10×T4 DNA ligase Buffer                           1 μL

JIPDJIPDYYNA-1/JIPDYYNA-2/JIPDYYNA-3         7 μL

线性化pET28a(+) DNA                            1 μL

T4 DNA ligase                                    1 μL

总计                                            10μL

      反应条件：16℃水浴连接过夜。

电转化：将连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合进行电转化，方法同上。

酶切鉴定

1）从LB平板上挑取单个菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。按Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒DNA；

2）将提取的质粒DNA进行Nde1和Not1-HF双酶切，反应体系如下：

质粒DNA           16μL

100×BSA           0.2μL

Nde1              0.5 μL

Not1-HF           0.5 μL

10×NEB Buffer4      2 μL

             ddH₂O             0.8μL

总计               20 μL

37℃水浴消化4 h，取酶切产物10 μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时以重组质粒为对照，100 V电泳1 h，凝胶成像仪观察重组质粒DNA是否被酶切成两条分别与JIPDYYNA片段及线性化pET28a(+)大小相似的DNA条带。

结果：采用单区抗体基因特异性引物分别从质粒JIPDYYNA1，2，3/pCANT ab5E中分别扩增到编码重链抗体可变区的基因片段，大小为500bp左右，与预期的大小一致。如图7。

将上述三个基因片段进行TA克隆，将含有编码纳米抗体基因的质粒JIPDYYNA-1-pGEMT、JIPDYYNA-2-pGEMT、JIPDYYNA-3-pGEMT送到上海生工生物工程技术有限公司进行DNA序列分析，结果与预期的基因序列完全一致。

将纳米抗体基因通过Nde1和Not1酶切位点定向克隆到表达载体pET28a中，构建了重组表达质粒JIPDYYNA-1-pET28a、JIPDYYNA-2-pET28a及JIPDYYNA-3-pET28a。用Nde1和Not1酶限制性酶切分析，结果证实纳米抗体基因均被正确地插入到表达质粒pET28a中, 重组质粒JIPDYYNA-2-pET28a及JIPDYYNA-3-pET28a均能切出一条约500 bp长的目的基因条带，但是由于JIPDYYNA-1基因序列上的125 bp处含有一个Not1限制性酶切位点，所以JIPDYYNA-1基因被切割为大小分别为125 bp和约380 bp的2条DNA条带（图8），但其总长度与预期的大小一致。表明三个重组表达质粒构建成功。

实施例6：抗Sj TGR单区抗体表达工程菌株的构建，蛋白质表达与纯化

将重组质粒JIPDYYNA-1/JIPDYYNA-2/JIPDYYNA-3-pET28a分别电转化到表达宿主菌BL21 (DE3)感受态细胞中，在含卡那霉素（50 μg/mL)的LB平板上筛选含重组表达质粒的转化子菌株。

1）挑取LB平板上单个菌落接种于3 mL LB 液体培养基中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃振荡培养过夜；

2）次日以1︰100 的比例将过夜培养菌转接入1 L LB 培养液中（含卡那霉素50 μg/mL），37℃、200 rpm继续振荡培养4 h；

3）当菌液OD_600nm 达到0.6-0.8时，然后在培养物中加入IPTG至终浓度为1 mM，37℃、200 rpm继续振荡培养4 h；

4）离心收集细菌，去上清，用50 mL的PBS重悬细菌沉淀；

5）在重悬液中加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，在冰上反应1h，裂解细胞壁；

6）将细菌裂解液反复冻融2-3次，直到菌液变为粘稠状；

7）然后将细菌裂解液进行超声裂解（程序：冰浴，功率：200 W，超声10 s，间隔10 s，反复超声10 次），然后4 ℃以12000×g离心30 min；

8）分别取上述表达产物的上清、沉淀物各200 μL，加入等体积2×上样缓冲液，混匀，室温作用 30 min，煮沸10 min，取20 μL表达产物进行15 % SDS-PAG 电泳。120 V电压使样品进入分离胶后，180 V电压继续电泳60 min。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色 30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，观察重组表达蛋白是在表达产物裂解物的上清中还是在沉淀中；

9）按上述方法大量制备纳米抗体表达产物，离心收集细菌沉淀；用PBS悬浮后超声裂解，将裂解物进行离心，收集沉淀物；

10）将表达产物沉淀物用50 mL PBS重悬，再以12000 g离心10 min去上清，如此重复充分洗涤3次；

11）将洗涤后的沉淀物用100 mL含有8 M尿素的LE Buffer溶解，4 ℃搅拌溶解过夜；

12）将溶解后的液体4 ℃高速离心12000 g离心30 min；

13）小心吸取离心上清，用0.45 μm的滤膜过滤，准备上镍螯合亲和层析柱纯化；

14）镍柱准备：用10倍体积含有8 M尿素的LE Buffer平衡柱子；

15）将过滤后的表达产物上镍亲和层析柱，分别取上柱前、后的溶液用于后续分析；

16）用20倍体积（20 mL）的LE Buffer洗柱，收集洗柱液；

17）用20倍体积的Wash Buffer洗柱，收集过柱液；

18）分别用含有不同浓度（20 mM，30 mM，40 mM，50 mM，60 mM，70 mM，200 mM，250 mM）咪唑的Elution Buffer梯度洗脱目的蛋白；

19）分别取10 μL样品与等体积2×SDS loading buffer混匀煮沸10 min进行15% SDS-PAG 电泳。120 V 电压使样品进入分离胶后，180 V电压继续电泳70 min。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，观察结果；

20）取洗脱后的纯化蛋白进行透析复性，透析液为含有50 mM L-精氨酸和不同浓度尿素的PBS缓冲液，并调节缓冲液pH至8.0。采取逐渐降低尿素浓度的方式在4℃透析，最后用1×PBS透析。

结果：将含重组质粒JIPDYYNA-1-pET28a, JIPDYYNA-2-pET28a, JIPDYYNA-3–pET 28a的工程菌分别接种到LB培养基中培养，用IPTG进行蛋白质诱导表达。经过对表达条件的优化，用1 mM IPTG进行诱导，在37℃诱导4 h，可表达出一分子量约20 kDa的重组蛋白, 与预计的带有His标签重组纳米抗体分子量相吻合。SDS-PAGE分析显示重组表达的三株单区抗体蛋白均为不可溶的包涵体蛋白，存在于表达产物裂解物的沉淀中。如图9。

采用镍离子金属螯合亲和层析胶对重组表达纳米抗体在变性条件下进行纯化，均获得较纯的重组单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3蛋白。如图10。

实施例7重组纳米抗体的驼源性分析

采用Dot-ELISA，将重组单区抗体表达菌裂解液作为抗原点膜，同时以阴性菌裂解液为阴性对照，骆驼血清为阳性对照，以HRP偶联羊抗骆驼多抗作为二抗与之反应，DAB显色。结果：纳米抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3表达产物裂解物均可被抗骆驼IgG二抗所识别，有较强反应，而对照菌没有反应。图11。

实施例8：重组表达单区抗体与Sj TGR蛋白的结合能力分析

将纯化的单区抗体蛋白经SDS-PAGE后转移到NC膜上，分别与Sj TGR反应后，再与抗Sj TGR小鼠二抗反应，然后与HRP标记羊抗小鼠二抗进行识别反应。结果：重组表达的JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2、JIPDYYNA-3蛋白均可以与Sj TGR蛋白结合，在分子量约18-20kDa处有明显的显色条带，而未与Sj TGR蛋白反应的重组JIPDYYNA-1蛋白条带则不显色。图12。表明重组JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2、JIPDYYNA-3蛋白均能与Sj TGR特异性结合。

实施例9：重组单区抗体对Sj TGR蛋白硫氧还蛋白还原酶活性抑制作用分析

原理：Sj TGR的硫氧还蛋白还原酶（TR）的活性可以在还原物NADPH存在的情况下将底物DTNB还原为TNB，表现为反应体系溶液在412nm的吸收值升高。本发明将Sj TGR与不同摩尔比的重组表达单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3分别结合后再进行酶促反应，利用紫外分光光度计测定酶促反应后体系的412nm吸收值的变化以观察重组纳米抗体是否对Sj TGR的TR酶活性具有抑制作用。

DTNB的还原试验 

1）反应原理：5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）在还原物NADPH存在情况下，可被Sj TGR还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB），而TNB在波长为412nm处有最大的的吸收峰，发生酶促还原反应后，反应体系在412nm的吸收值会增加。

                                    TrxR

NADPH+H⁺+DTNB           NADP⁺+2TNB 

2）反应体系如下：  EDTA                     5 mM

     磷酸钾缓冲液(pH 7.4)      100 mM 

NADPH                   50 μM 

DTNB                    1.5 mM 

3）样品测定：本实验共分为空白组、对照组和实验组。空白组取5 μL的重组Sj TGR蛋白（0.08 mg/mL）与5 μL磷酸钾缓冲液(pH 7.4)混合，室温下静置反应15 min后加入到体积为100 μL的比色皿中，随后加入90 μL反应体系混合试剂启动反应，连续观察反应起始后前1 min内在412 nm处吸收峰的增加值。连续测试3次并分别计算酶活性，取平均值作为Sj TGR 100%酶活力时的值。

    对照组则是取5 μL的0.08 mg/mL重组Sj TGR与5 μL含0.7 M尿素的JIPDYYNA蛋白稀释液混合，室温下静置反应15 min后加入到体积为100 μL的比色皿中，随后加入90 μL反应体系混合试剂启动反应，连续观察反应起始后前1 min内在412 nm处吸收峰的增加值。连续测试3次分别计算酶活性，并与空白组酶活性进行t检验统计分析，以判断含尿素的蛋白稀释液是否对Sj TGR酶活产生影响。

实验组是取5μL的0.08 mg/mL重组Sj TGR与5μL JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2或者JIPDYYNA-3蛋白分别以2:1/1:1/1:4/1:16的摩尔比混合，室温下静置反应15 min后加入到体积为100μL的比色皿中，随后加入90 μL反应体系混合试剂启动反应，连续观察反应起始后前1 min内在412 nm处吸收峰的增加值，计算酶活性。所有试验均重复 3次。并与对照组酶活性进行t检验统计分析。

4）酶活性计算：一个单位的酶活性定义为25℃条件下1 min内由NADPH产生2 μM的TNB。根据不同时间的吸光度值，在 OriginPro 7.0上进行直线拟合，斜率即为初速度υ（△A412/min）。计算公式如下：  

样品中硫氧还蛋白还原酶活性（μmol·min-1mg-1）= 

计算时使用TNB的吸光系数（ε）为13.6 mM^-1cm^-1。 

结果: JIPDYYNA-1对TGR的TR活性具有较强抑制作用，在摩尔比为1:1时TGR的TR活性抑制达到最大，下降约73.58%（表 3，图13）。空白组与对照组相比，酶活无统计学差异（P>0.05），实验组与空白组、对照组相比，酶活有显著差异（P<0.05），而VHH54和VHH67则在各浓度比下均对Sj TGR无抑制作用（表4、5，图14、 15），实验组与空白组、对照组相比，酶活性无统计学差异（P>0.05）。

 

SEQ ID NO 1

 

Met Gly Ser Ser His  His His His His His  Ser Ser Gly Leu Val

                  5                   10                   15    

Pro Arg Gly Ser His  Met Ser Trp Leu Leu  Phe Leu Gln Gly Val

                 20                   25                   30

Arg Thr Gln Thr Pro  Leu Val Glu Ser Gly  Gly Gly Ser Val Gln

                 35                   40                   45        

Val Gly Gly Ser Leu  Arg Leu Thr Cys Thr  Ala Pro Gly Asn Arg

                 50                   55                   60         

Tyr Asp Thr Met Ala  Trp Phe Arg Gln Ala  Pro Gly Ser Gly Arg

65                   70                   75

Glu Arg Val Ala Ala  Val Tyr Ser Val Ala  Gly Ile Pro Thr Tyr

                 80                   85                   90            

Ala Asp Ser Val Lys  Gly Arg Phe Thr Ile  Ser Gln Ala Thr Asp

                 95                  100                  105     

Ala Lys Thr Leu Asn  Leu Gln Met Thr Asn  Leu Ile Pro Gly Asp

                110                  115                  120         

Thr Ala Met Tyr Tyr  Cys Ala Ala Gln Arg  Phe Pro Cys Gly Ile

                125                  130                  135            

Thr Ala Ala Asp Pro  Arg Asp Tyr Thr Tyr  Trp Gly Gln Gly Thr

                140                  145                  150

Gln Val Thr Val Ser  Ser Gly Thr Asn Glu  Val Cys Lys***

                155                  160          163                                                                                              

 

SEQ ID NO 2     

Met Gly Ser Ser His  His His His His His  Ser Ser Gly Leu Val

                       5                         10                          15

Pro Arg Gly Ser His  Met Ser Trp Leu Ala  Leu Leu Gln Val Val   

                           20                          25                         30

Gln Ala Gln Val Gln  Leu Val Glu Ser Gly  Gly Gly Ser Val Gln  

35                          40                         45

Glu Gly Gly Ser Leu  Arg Leu Ser Cys Ala  Ala Ser Gly Phe Thr 

                             50                         55                        60

Asn Ser Arg Pro Cys  Me tGly Trp Phe Arg  Gln Ala Pro Gly Lys

65                          70                        75

Glu Arg Glu Gly Val  Ala Thr Ile Ser Gln  Gly Gly Thr Ser Gln

                        80                        85                          90

Tyr Tyr Ala Gly Ser  Val Lys Gly Arg Phe  Thr Ile Ser Arg Asn  

                          95                        100                       105

Asn Thr Glu Asp Thr  Val Tyr Leu Lys Met  Asn Asn Leu Lys Pro

                           110                        115                       120

Glu Asp Thr Ala Met  Tyr Tyr Cys Ala Thr  Lys Arg Asp Cys Leu

125                         130                       135

Asp Leu Gly Ser Val  Gly Phe Arg Pro Val  Ala Tyr Asn Tyr Trp 

                          140                        145                       150                      

Gly Gln Gly Thr Gln  Val Thr Val Ser Ser  Gly Thr Asn Glu Val  

                            155                     160                         165

Cys Lys***                                                                                                                                      

    167

 

 

SEQ ID NO 3

                                                                                                                                                                                          

Met Gly Ser Ser His  His His His His His  Ser Ser Gly Leu Val

5                       10                          15

Pro Arg Gly Ser His  Met Ser Trp Leu Leu  Leu Gln Gly Val Gln

                      20                         25                         30                                                      

Gly Gln Val Gln Leu  Thr Glu Ser Gly Gly  Gly Ser Val Gln Ala

                            35                         40                         45

Gly Gly Ser Leu Arg  Leu Ser Cys Ala His  Ser Thr Leu Gly  Ala

                            50                         55                          60

Ala Arg Tyr Cys Leu  Ala Trp Phe Arg Gln  Val Glu Gly Gln Ser

65                            70                            75

Arg Glu Trp Val Ala  Ser Ile Asn Pro Ala  Asn Gly Ala Thr Tyr 

                  80                        85                          90

Tyr Glu Asp Ser Val  Lys Gly Arg Phe Thr  Ile Thr Arg Asp Arg 

                      95                        100                        105

Ala Glu Arg Lys Leu  Phe Leu Gln Leu Asn  Thr Val Lys Pro Gly  

                     110                          115                      120

Asp Ala Ala Met Tyr  Tyr Cys Ala Ala Arg  Arg Asp Arg Leu Gly

125                      130                         135

Ser Tyr Cys Asn Ala  His Gly Val Asn Asp  Arg Tyr Val His Trp 

                     140                       145                         150

Gly Gln Gly Thr Gln  Val Thr Val Ser Ser  Gly Thr Asn Glu Val 

                      155                       160                        165

Cys Lys***

167

 

SEQ ID NO 4

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat  60

atgtcctggc tgctctttct acaaggtgtc cggactcaga cgccattggt ggagtctggg 120

ggaggctcgg tgcaggtcgg agggtctctg agactcacct gcacagcgcc tggcaaccgt 180

tacgacacca tggcctggtt ccgccaggct ccaggatcgg ggcgcgagcg ggtcgcggca 240

gtttacagtg tcgcaggtat cccaacgtat gccgacagcg tgaagggccg attcaccatc 300

tcccaagcaa ctgacgcgaa gacgctcaat ctgcaaatga cgaacttgat acctggggac 360

actgccatgt actattgtgc ggcacagcgc tttccttgtg ggataacagc cgctgatcca 420

cgagactata catactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctcagg aacgaatgaa 480

gtatgcaagt ag                                                     492

 

SEQ ID NO 5

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat  60

atgtcctggc ttgctcttct acaagtggtc caggctcagg tgcagttggt ggagtctggg 120

ggaggctcgg tgcaggaagg agggtctctg agactctcct gtgcagcctc cggattcacc 180

aatagtcgcc cctgcatggg ctggttccgc caggctccag ggaaggagcg cgagggggtt 240

gcgactattt ctcaaggggg tacgagtcaa tactatgccg gctctgtgaa gggccgattc 300

accatctccc gtaacaacac tgaggacacg gtgtatctaa agatgaacaa cctgaaacct 360

gaggacactg ccatgtacta ctgcgcgaca aaaagggact gcctcgacct tggtagtgtt 420

gggttccgac ctgtcgcgta taattactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 480

ggaacgaatg aagtatgcaa gtag                                        504

 

SEQ ID NO 6

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat  60

atgtcctggc tgcttctaca aggtgtccag ggacaggtac agttaacgga gtctggggga 120

ggctcggtgc aggctggagg atctctgaga ctctcctgtg cacactccac actcggcgcc 180 

gcgcgctact gtttggcctg gttccgccag gtcgaaggac aatcgcgcga gtgggtcgca 240

tcaattaatc ctgcgaatgg ggccacatat tatgaagact ccgtgaaggg ccggttcacc 300

atcacccggg acagggccga gaggaagttg tttctccaac tgaacacagt aaaacctggg 360       

gacgctgcga tgtactactg cgcggcgaga agggaccgtc ttggtagtta ctgcaatgcg 420

catggcgtca atgatcgata tgtccactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcttca 480     

ggaacgaatg aagtatgcaa gtag                                        504

                             

SEQ ID NO 7

 

Met Pro Pro Ile Asp  Gly Thr Ser Gln Trp  Leu Gln Arg Thr Ile

                  5                   10                   15

Glu Ser Ala Ala Val  Ile Val Phe Ser Lys  Thr Thr Cys Pro Phe

                 20                   25                   30

Cys Lys Lys Leu Lys  Asp Val Leu Ala Glu  Ala Lys Ile Lys His

                 35                   40                   45

Ala Thr Ile Glu Leu  Asp Gln Leu Ser Asn  Gly Ser Val Ile Gln 

                 50                   55                   60

Lys Ala Leu Ser Asn  Phe Ser Lys Ile Glu  Thr Val Pro Gln Met

                 65                   70                   75

Phe Val Arg Gly Lys  Phe Ile Gly Asp Ser  Lys Ala Val Leu Asn

                 80                   85                   90

Tyr His Asn Asn Asn  Gln Leu Gln Ala Ile  Val Asn Glu Asn Lys

                 95                  100                  105

Tyr Asp Tyr Asp Leu  Ile Ile Ile Gly Gly  Gly Ser Gly Gly Leu

110                  115                  120

Ala Ala Gly Lys Glu  Ala Ala Lys Tyr Gly  Ala Lys Thr Ala Val

                125                  130                  135

Leu Asp Tyr Val Glu  Pro Thr Pro Met Gly  Thr Thr Trp Gly Leu

                140                  145                  150

Gly Gly Thr Cys Val  Asn Val Gly Cys Ile  Pro Lys Lys Leu Met

                155                  160                  165

His Gln Ala Gly Leu  Leu Ser His Ser Leu  Glu Asp Ala Gln His

                170                  175                  180

Phe Gly Trp Ser Leu  Asp Lys Ser Lys Ile  Ser His Asp Trp Ser

                185                  190                  195

Thr Met Val Glu Gly  Val Gln Ser His Ile  Gly Ser Leu Asn Trp

                200                  205                  210

Gly Tyr Lys Val Ser  Leu Arg Asp Asn Ala  Val Thr Tyr Leu Asn

                215                  220                  225

Ala Arg Gly Met Leu  Leu Ser Pro His Glu  Val Gln Ile Thr Glu

                230                  235                  240

Lys Asn Lys Lys Val  Ser Thr Ile Thr Gly  Asn Lys Ile Ile Leu

                245                  250                  255

Ala Thr Gly Glu Arg  Pro Lys Tyr Pro Glu  Ile Pro Gly Ala Ile

                260                  265                  270

Glu Tyr Gly Ile Thr  Ser Asp Asp Leu Phe  Ser Leu Pro Tyr Phe

                275                  280                  285

Pro Gly Lys Thr Leu  Val Val Gly Ala Ser  Tyr Val Ala Leu Glu

                290                  295                  300

Cys Ala Gly Phe Leu  Ala Ser Leu Gly Gly  Asp Val Thr Val Met

                305                  310                  315

Val Arg Ser Ile Leu  Leu Arg Gly Phe Asp  Gln Gln Met Ala Glu

                320                  325                  330

Lys Val Gly Asp Tyr  Met Glu Asn His Gly  Val Lys Phe Ala Lys

                335                  340                  345

Leu Cys Val Pro Asp  Glu Ile Thr Gln Leu  Lys Pro Val Asp Thr

                350                  355                  360

Glu Asn Asn Lys Pro  Gly Leu Leu Leu Val  Lys Gly His Tyr Thr

                365                  370                  375

Asp Gly Lys Lys Phe  Glu Glu Glu Phe Glu  Thr Val Ile Phe Ala

                380                  385                  390

Val Gly Arg Glu Pro  Gln Leu Ser Lys Leu  Asn Cys Glu Ala Val

                395                  400                  405

Gly Val Lys Leu Asp  Lys Asn Gly Arg Val  Val Cys Ser Asp Asp

                410                  415                  420

Glu Gln Thr Thr Val  Ser Asn Ile Tyr Ala  Ile Gly Asp Ile Asn

                425                  430                  435

Ala Gly Lys Pro Gln  Leu Thr Pro Val Ala  Ile His Ala Gly Arg

                440                  445                  450

Tyr Leu Ala Arg Arg  Leu Phe Ala Gly Ala  Thr Glu Leu Thr Asp

                455                  460                  465

Tyr Ser Asn Val Ala  Thr Thr Val Phe Thr  Pro Leu Glu Tyr Gly

                470                  475                  480

Ala Cys Gly Leu Ser  Glu Glu Asp Ala Ile  Glu Lys Tyr Gly Asp

                485                  490                  495

Asn Asp Ile Glu Val  Tyr His Ser His Phe  Lys Pro Leu Glu Trp

                500                  505                  510

Thr Val Ala His Arg  Glu Asp Asn Val Cys  Tyr Met Lys Leu Val

                 515                 520                  525

Cys Arg Ile Ser Asp  Asn Met Arg Val Leu  Gly Leu His Val Leu

                530                  535                  540

Gly Pro Asn Ala Gly  Glu Ile Thr Gln Gly  Tyr Ala Val Ala Ile

                545                  550                  555

Lys Met Gly Ala Thr  Lys Glu Asp Phe Asp  Arg Thr Ile Gly Ile

                560                  565                  570

His Pro Thr Cys Ser  Glu Thr Phe Thr Thr  Leu His Val Thr Lys

                575                  580                  585

Arg Ser Gly Gly Ser  Ala Ala Val Thr Gly  Cys ***

                590                  595  596

 

 

SEQ ID NO 8

atgcctccga ttgatggaac atcccagtgg ttgcagagga ctatcgaatc agcggcggta     60

atcgtcttta gcaaaacaac ttgtccattt tgcaaaaagc taaaggatgt tttagctgaa    120

gcaaagatta aacacgctac aattgaactg gatcaattat ccaatggttc ggttattcaa    180

aaggcattat ctaacttctc taaaattgaa acagtcccgc aaatgtttgt tagaggcaag    240

ttcattggcg attctaaagc agtacttaat taccacaata ataatcaatt gcaggcgatc    300

gtcaacgaaa ataagtatga ctatgatctg ataatcatcg gtggaggatc tggtggactc    360

gctgctggaa aggaggcagc caaatacggc gcaaagacag ctgttctgga ttatgtagaa    420

ccgactccaa tgggtactac ttggggatta ggtggaacct gtgttaacgt tggatgtatc    480

cctaaaaaat taatgcacca agctggactc ttaagtcatt ctttggaaga tgcccaacat    540

ttcggttgga gcttggataa atcaaaaatt tcccatgatt ggtcaactat ggttgaagga    600

gttcagagtc acatcggttc tttaaattgg ggctataaag tttcactaag agataatgcg    660

gttacgtatc ttaatgctcg tgggatgcta ttaagtcctc atgaggttca gattacagaa    720

aagaataaaa aagtatccac aataactgga aataaaatca tcttagctac tggcgagcgt    780

ccaaaatacc cagaaatacc tggagcaatc gaatatggga ttacaagtga tgatttgttt    840

tccttaccat acttcccggg caaaacactg gtcgttggag cgagctatgt tgcattggaa    900

tgtgctggtt ttcttgccag tttgggcggt gatgttactg ttatggttcg ttccattttg    960

cttcgtggtt tcgatcaaca aatggctgag aaggttggcg attatatgga aaatcatgga   1020

gtcaagttcg caaagttgtg tgtaccagac gagattacac agttgaaacc ggtagatact   1080

gagaataaca aacctggact cctgcttgtt aagggtcatt atactgatgg taagaagttt   1140

gaagaagaat ttgaaacggt cattttcgct gttggtcgtg aaccacaatt atcgaagctt   1200

aattgtgaag ctgtcggtgt taaactagat aagaatggtc gggttgtatg ctcagatgat   1260

gaacaaacta cagtcagtaa catttatgcc attggagata taaacgctgg aaaaccacag   1320

ttaactccag tggctattca tgctggacgt tatttggcta gacggttatt cgctggtgca   1380

actgaactga ctgactattc caatgttgct acgactgttt tcactccatt agaatatggc   1440

gcttgtggac tgagtgaaga ggatgcaatt gaaaagtatg gtgataatga tattgaggta   1500

tatcattcac atttcaaacc tttagaatgg actgttgctc atcgtgaaga taatgtttgt   1560

tacatgaaac ttgtttgccg tatatctgat aacatgcgtg tactgggtct acatgtttta   1620

ggacctaatg caggtgaaat aacacagggg tatgcagttg caattaaaat gggtgcaact   1680

aaagaagatt ttgatcgtac cataggaatt cacccaactt gttctgagac atttacaacg   1740

ttgcatgtaa ccaagagatc tgggggctct gcagcggtaa ccggttgctg a            1791