一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶及其应用

摘要

本发明公开了一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或在SEQ ID NO.1基础上经过缺失、突变仍保持唾液酸酶功能不变的氨基酸序列所示且通过大肠杆菌表达后纯化。本发明提供的唾液酸酶具有较强的二价金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性，对α2,3及α2,6连接形式的底物均能进行水解，对猪脑中提取的总神经节苷脂能进行生物转化，制备纯度较高的GM1，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面神经节苷脂转化为GM1而抑制膀胱癌细胞的迁移，具有重要应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种唾液酸酶，特别是一种外切唾液酸酶及其在抑制肿瘤迁移中 的应用。

背景技术

唾液酸(sialic acid，SA)是一类分布广泛的带负电荷的九碳糖，通过不同 的连键方式存在于糖蛋白、糖脂等糖缀合物的糖链末端。在真核生物中，糖缀合 物的唾液酸化修饰在稳定细胞膜结构、促进神经发育、信号识别等过程中具有至 关重要的作用，哺乳动物细胞糖链唾液酸化与癌症的发生和转移过程呈相关性。

细菌外切唾液酸酶可以水解糖缀合物末端的唾液酸，已有研究报道部分细菌 唾液酸酶在生物转化神经节苷脂制备药物GM1，以及治疗脊髓损伤等方面具有 应用价值。然而上述报道中所用的菌株多为致病菌或筛选获得的非常见菌株，遗 传信息不明确且不易获得、难以培养甚至还具有危害性，另外大多数报道中酶纯 化过程繁琐、底物特异性不强，为该类酶的应用推广带来极大的限制。因此，在 遗传背景明晰的非致病菌中开发新的外切唾液酸酶显得尤为重要。

本发明中的唾液酸酶来源于阿维链霉菌，是一种常见的工业菌种，进一步研 究该酶制备药物GM1的能力并发现该酶能通过对癌细胞表面神经节苷脂上唾液 酸的水解，而抑制癌细胞的迁移。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型唾液酸酶，其氨基酸序列如1)或 2)所示且通过大肠杆菌表达后纯化；

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在1)的基础上经过缺失、突变仍保持生物学功能不变的氨基酸序列。

本发明所使用的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株编号为 ATCC31267。

编码所述唾液酸酶的核苷酸序列也为本发明要求保护的范围。

能表达权利要求1所述唾液酸酶的载体或用于表达所述唾液酸酶的转基因 细胞系均为本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题为所述唾液酸酶在抑制癌细胞迁移中的应 用。

使用所述唾液酸酶制备获得的对应性抗体也为本发明要求保护的范围。

本发明涉及内容包括如下方面：

1.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3原核表达质粒的构建；其中涉及构建 质粒所设计的neuA3基因的特异性引物、阿维链霉菌基因组的获得、 pET28a(+)载体的酶切及连接、宿主菌E.coli BL21(DE)的感受态制备及 转化；

2.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3在E.coli BL21(DE)中的诱导表达；其 中涉及诱导表达的温度、时间、IPTG浓度及摇床转速；

3.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3的分离纯化；其中涉及宿主菌超生破 碎的条件、镍柱纯化的条件、酶液的透析条件；

4.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3酶学性质分析；其中涉及该酶反应的 最适温度、最适盐离子浓度、最适反应时间、最适pH、二价离子耐受 性、热稳定性、酸稳定性以及底物特异性；

5.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3转化总神经节苷脂制备药物GM1的应 用；其中涉及猪脑中总神经节苷脂的提取、酶的生物转化体系、转化后 产物的脱盐处理及高效薄层色谱(HPTLC)；

6.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3抑制癌细胞迁移能力的研究；其中涉 及膀胱癌细胞YTS-1的培养、酶液对细胞的处理、划痕实验及胶体金实 验。

本发明提供的唾液酸酶具有较强的二价金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定 性，对α2,3及α2,6连接形式的底物均能进行水解，对猪脑中提取的总神经节苷 脂能进行生物转化，制备纯度较高的GM1，同时首次发现该酶能够通过将癌细 胞表面神经节苷脂转化为GM1而抑制膀胱癌细胞的迁移。

附图说明

图1为唾液酸酶诱导表达及分离纯化后的SDS-PAGE图；

图2为NeuA3最适反应条件；

图3为NeuA3离子耐受性、热稳定性及pH稳定性；

图4为NeuA3生物转化猪脑中提取的总神经节苷脂制备GM1的HPTLC；

图5为NeuA3处理膀胱癌细胞YTS-1后细胞迁移能力变化；

图6为NeuA3处理YTS-1后细胞表面GM1分布的免疫荧光照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：唾液酸酶的获得

1、克隆与表达

neuA3基因的序列信息通过网站http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/获得，并 通过SignalP4.1Server网站对该酶的信号肽情况进行预测，结果显示该酶为不含 有信号肽的胞内酶，大小约为38kDa的小唾液酸酶。在neuA3基因的编码区进 行引物设计，由公司合成如下引物：neuA3-S: GGAATTCCATATGGCGATGACAGAAGCCAGTACAC(下划线处为EcoRI的酶 切位点)和neuA3-AS:CCCAAGCTTCAGTAGAGGTCATGGGGTGA(下划线处 为HindIII的酶切位点)，以上述提取的阿维链霉菌基因组为模板进行PCR扩增， 扩增条件如下：95℃10min，96℃1min，65℃45s，72℃1min30s重复34个 循环，72℃10min。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并采用琼脂 糖凝胶回收试剂盒回收，获得neuA3基因片段。

neuA3基因片段与载体质粒pET28a(+)分别经过EcoRI和HindIII酶切后16℃ 连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，挑取卡那霉素抗性的转化子提取质粒进 行酶切验证和测序验证，获得构建正确的neuA3表达质粒。

利用E.coli BL21(DE3)和pET28a(+)表达系统，将含有构建好表达质粒的宿 主菌接种于少量含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。第二天 以1％接种量接入含卡那霉素的大体积LB液体培养基中，37℃振荡培养。当 OD₆₀₀达到0.3-0.6时，取出部分菌液作为蛋白表达的负对照。在剩余菌液中加入 0.05mM的IPTG后在16℃培养8h，离心收集，重悬于Lysis Buffer(NaH₂PO₄50 mM，NaCl300mM，Imidazole10mM)中，超声波破碎后离心取上清备用，沉 淀用Lysis Buffer悬浮。加适量5×Sample Loading Buffer[pH6.8Tris-HCl250mM， SDS10％(W/V)，BPB0.5％(W/V)，甘油50％，使用前加入5％β-巯基乙醇]， 沸水中煮5min，迅速插在冰上。SDS-PAGE凝胶电泳检测目标蛋白表达情况。

2、唾液酸酶的纯化

(1)以合适条件扩大培养菌体并诱导蛋白表达，离心收集菌体悬于Lysis Buffer 中，超声破碎后离心得到上清。根据His标签与Ni⁺能相互吸附的原理，在 上清中加入50％Ni-NTA(Roche)，在4℃缓慢摇晃60min，使表达产物与 Ni-NTA充分结合；

(2)将混合物转移到层析柱上，收集流出的液体，标记为FT；

(3)用Wash Buffer(NaH₂PO₄50mM，NaCl300mM，Imidazole20-100mM) 洗涤，收集流出的液体，标记为W1、W2、W3、W4……；

(4)用少量Elution Buffer(NaH₂PO₄50mM，NaCl300mM，Imidazole500mM) 洗脱，收集流出的液体，标记为E1、E2、E3、E4……。

以上收集起来的液体进行SDS-PAGE电泳(图1)。纯化后的蛋白经过透析 以去除其中的Imidazole和盐离子，再通过冷冻干燥获得酶粉。唾液酸酶的氨基 酸序列如其氨基酸序列如1)或2)所示，

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在1)的基础上经过缺失、突变仍保持生物学功能不变的氨基酸序列。

实施例2新型唾液酸酶的酶学性质研究

将酶液稀释到0.1mg/mL，以Neu5Ac的衍生物4-MU-Neu5Ac为底物， 在反应体系中加入10μL该浓度的酶液，10μL1mM的底物4-MU-Neu5Ac， 及80μL反应缓冲液，反应一定时间之后加入100μL终止缓冲液(甘氨酸 0.133M，NaCl0.06M，Na₂CO₃0.083M，pH10.7)终止酶解反应获得游离 的4-MU，由于游离的4-MU在365nm的激发波长下可产生450nm的荧光， 而非游离的4-MU-Neu5Ac在这个激发波长只产生微弱的荧光信号，因此可通 过荧光酶标仪收集游离4-MU的荧光信号，并根据荧光信号与4-MU浓度关 系的标准曲线即可计算酶活。1个酶活单位的定义为：1分钟内水解底物释放 出1nmol4-MU时所用的酶量。确定该酶在pH＝5的含300mM NaAc的反 应缓冲液中40℃反应具有最适的酶活(图2)，同时发现该酶能耐受大多数二 价金属离子并在铜离子存在的情况下表现出更高的酶活。该酶的另一个优点 是温度和pH耐受性好，长时间暴露在其反应温度和弱酸性的条件下酶活几 乎不会发生明显损失(图3)。

时间 pH＝5.7 pH＝6 pH＝6.8 1天 100％ 100％ 100％ 4天 78.45％ 99.55％ 93.64％ 5天 69.27％ 94.30％ 85.02％

时间 4℃ 30℃ 37℃ 40℃ 1天 100％ 100％ 100％ 100％ 4天 93.64％ 94.69％ 91.48％ 80％ 5天 98.30％ 107.13％ 86.58％ 65.63％

以不同唾液酸连键形式的底物α2,3唾液乳糖，α2,6唾液乳糖用该酶在相 同的反应条件下进行酶解反应，终止反应后采用硫代巴比妥酸法，在反应液 中加入25mM过碘酸钾，37℃水浴20min，立即加入含2％亚砷酸钠的0.5M HCl溶液，振荡至黄色消失后加入0.3％硫代巴比妥酸(pH＝9)摇匀，沸水浴 10min并冷却于549nm测定吸光值。同样根据不同浓度游离唾液酸与吸光度 的标准曲线即可计算酶对不同底物的酶解效率，即比酶活U/mg，实验表明 NeuA3对这两种底物均能识别，并且具有相近的水解效率，表明该酶具有广 谱的底物识别范围。

实施例3唾液酸酶生物转化神经节苷脂的应用研究

将一定浓度的酶与提取自猪脑中的总神经节苷脂在反应缓冲液中混匀 反应，终止反应后，用氮吹仪将反应后的体系吹干再用氯仿/甲醇(V/V＝2/1) 溶液复溶，以反应前的总神经节苷脂为对照，同时以神经节苷脂标准品作为 Marker进行HPTLC，展层后的硅胶板用地衣酚进行显色反应。同时展层后 的硅胶板也可用于免疫印迹实验，将硅胶板浸泡于1％BSA/PBS(W/V)中， 室温封闭30min，按一定比例加入相应神经节苷脂特异性识别的biotin标记 的霍乱毒素B亚基，室温孵育2h后用TBS-T清洗三次，每次5min。加入 辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，室温孵育1h后再用TBS-T清洗三次， 每次5min。将HRP显色底物试剂A和B等体积混合制备显色液淋洗硅胶 板，采用Bio-Rad Chemi Doc XRS成像系统进行曝光拍照。结果显示NeuA3 能够有效的将总神经节苷脂转化成GM1，转化效率及产物纯度较高(图4)。

实施例4唾液酸酶NeuA3抑制膀胱癌细胞YTS-1迁移能力的研究

膀胱癌是泌尿系统中最常见的一种恶性肿瘤，世界范围内，膀胱癌位列 男性最常见实体瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新诊断的膀胱癌患 者超过三十五万名；在中国，膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，大约90％的 膀胱癌为膀胱尿路上皮癌。在恶性膀胱癌细胞YTS-1的迁移能力较正常膀胱 上皮细胞更强，并且其表面神经节苷脂的表达情况也与正常细胞不同。

对细胞迁移能力的研究采用胶体金和划痕实验的方法进行，结果表明NeuA3 处理过的YTS-1迁移能力较未处理前明显降低，说明该酶能有效抑制恶性膀胱 癌细胞的迁移(图5)；对GM1的含量变化情况的检测将采用免疫荧光的方法以 及流式细胞仪分析，实验发现，酶处理后的YTS-1表面GM1含量明显增加(图 6)，说明NeuA3能有效的转化恶性膀胱癌细胞表面的神经节苷脂，这种转化有 可能是导致细胞迁移能力变化的原因之一。