用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物及检测方法

摘要

本发明公开了用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物，包括（1）内参基因β-actin扩增引物；Forward:5'-TCTGGCACCACACCTTCT-3’；Reverse:5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3’；（2）目的基因5-HT扩增引物；5-HT

说明书

技术领域

本发明涉及一种与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量检测方法，属于农业生物技术领 域。

背景技术

5-羟色胺受体(5-hydroxytryptamine receptor)是细胞膜上与5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)相结合的一类跨膜蛋白，隶属于G蛋白偶联受体超家族。它 包括5-HT₁～5-HT₇受体共7种类型，而多数类型又可细分为几个亚型。5-HT作为第一信使， 与相应受体结合后，激活或抑制跨膜蛋白-腺苷酸环化酶(AC)的活性，从而增加或减少了 胞内环腺苷酸(cAMP、第二信使)的浓度，进而影响蛋白质、糖和脂肪代谢，发挥其生理作 用。之后，5-HT通过5-羟色胺转运体被转运到细胞内灭活，以免发生中毒反应及受体的脱敏。 研究发现，5-HT及其受体在动物体生理过程中发挥着极其重要的作用，主要是调控中枢神经 系统和胃肠道的功能，影响动物的行为情绪和消化吸收(Pytliak et al.,2011；Blessing et al., 2003)。同时，通过第二信使cAMP的调控，对猪的生长和肉质也会产生影响(Hoyer et al.,1994； 杨在清等,1992；王丽,2009)。

随着现代人民生活水平的提高，对优质猪肉的需求渐益旺盛，肉质差异的机理和应用性 研究倍受重视。我国地方猪种通常与外来快大猪种存在着明显差别，地方猪温顺、母性强， 肉质细嫩、鲜美；而外来猪长速快、瘦肉率高，但肉质相对粗糙。关于这其间肉质差异的分 子机理研究已有不少，例如，Naveau(1986)、Gustavsson(1992)和Serge(1993)等发现， 氟烷基因和RN基因是影响肉品质的主效基因，氟烷基因的表达调控导致了PSE肉的产生； RN基因则使肌肉pH值下降，从而产生酸肉。除此之外，Gerbens等(1998)研究发现，影 响肉品质的候选基因还有脂肪酸结合蛋白基因(FABP)，其表达调控主要影响肌内脂肪(IMF) 含量；邓桂馨等(2007)发现，钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)和MyoD基因可调控肌纤维类 型及其含量，从而决定肉的质地、嫩度。但是，5-HT受体基因与肉质的相关性研究尚未见 报道。5-HT受体主要分布于脑、小肠和血管等组织，在其他组织中也有一定的表达。例如， 5-HT_2A、5-HT₇受体在子宫及胃肠道等高表达组织已得到检测，并发现其作为兴奋型受体，具 有收缩子宫的作用，但在肌肉等表达量较低的组织中难以实现准确检测(Sumner et al.,2008； Nakamura et al.,2008)。

本发明研究提供了猪5-HT受体基因的定量检测方法，可对猪肌肉、脂肪等肉质相关组 织的5-HT受体基因的表达进行分析，操作相对简便，检测灵敏度高、准确性强。通过猪5-HT 受体基因的定量检测，有助于进一步了解该基因的组织表达模式，判析其与肉质的相关性， 从而挖掘具有生产应用价值的肉质相关基因，为今后猪的育种工作提供更多辅助手段。

发明内容

本发明的目的在于通过对不同品种猪、不同组织中5-HT受体基因表达量的检测分析， 提供一种用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物、试剂盒及荧光定量PCR方 法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物，其特征在于所述引物包括：

(1)内参基因β-actin扩增引物；

Forward:5'-TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’；

Reverse:5'-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC-3’；

(2)目的基因5-HT扩增引物；

5-HT_2A：Forward:5'-AGG TGC TGG GCA TAG TCT T-3’；

      Reverse:5'-GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’；

5-HT₇：Forward:5’-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’；

      Reverse:5’-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’。

本发明还提供了包含上述扩增引物的试剂盒，可用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基 因表达量。

用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的试剂盒，其特征在于包括以下组成：

(1)内参基因β-actin扩增引物；

Forward:5'-TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’；

Reverse:5'-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC-3’；

(2)目的基因5-HT扩增引物；

5-HT_2A：Forward:5'-AGG TGC TGG GCA TAG TCT T-3’；

      Reverse:5'-GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’；

5-HT₇：Forward:5’-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’；

      Reverse:5’-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’；

(3)荧光定量PCR反应液；

(4)双蒸水。

本发明最后提供了一种利用上述试剂盒检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的荧 光定量PCR方法。

检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的方法，其特征在于包括步骤：

(1)Trizol法提取猪肉不同组织样本的RNA，并反转录为cDNA；

(2)以步骤(1)制得的cDNA为模板原液，取部分原液倍比稀释获得不同浓度的cDNA 模板稀释液，分别用5-HT受体基因和β-actin内参基因引物，进行实时荧光定量PCR扩增；

所述内参基因β-actin扩增引物为：

Forward:5'-TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’；

Reverse:5'-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC-3’；

所述5-HT受体基因扩增引物为：

5-HT_2A：Forward:5'-AGG TGC TGG GCA TAG TCT T-3’；

       Reverse:5'-GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’；

5-HT₇：Forward:5’-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’；

       Reverse:5’-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’；

其中，PCR反应程序：94℃5sec，60℃40sec，40个循环；最后72℃延伸5min；绘 制熔解曲线；

(3)利用2^-ΔΔCt法计算得到目的基因的表达量，计算公式为：基因表达量＝2^^{-((样品的目的基因平均Ct3-内参基因平均Ct4)-(校样品的目的基因平均Ct1-内参基因平均Ct2))}。

采用本发明的引物及差异模板浓度的荧光定量PCR检测方法，可实现不同组织中猪5-HT 受体基因mRNA表达量的准确检测。根据5-HT在组织中的表达量，选择合适的模板浓度， 控制检测到的Ct值在准确的范围内。减少循环数少基底值的影响，及多循环数后异源二聚体 等无效扩增的干扰，具有较高的特异性、敏感性，使相对定量计算结果更准确，提高了5-HT 的检测准确性。本方法操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高。通过 5-HT受体基因与不同品种猪、不同组织肉质的相关分析，有助于挖掘我国地方猪种的资源特 色，为猪育种实践提供科学依据。

附图说明

图1是目的基因5-HT_2A熔解曲线。

图2是目的基因5-HT_2A标准曲线。

图3是目的基因5-HT₇熔解曲线。

图4是目的基因5-HT₇标准曲线。

图5是内参基因熔解曲线

图6是内参基因标准曲线

图7是5-HT受体基因及内参基因PCR扩增片段琼脂糖电泳图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步说明本发明。

实施例1  5-HT受体基因检测方法及其优化

1 实验仪器与材料

实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad OPTICON2，美国)；超低温冰箱(Thermo，美国)；高 速冷冻离心机(Eppendorf5417R，德国)；梯度PCR仪(ABI PCR system9700，美国)；可 调式微量移液器(Eppendorf，德国)；GEL EQ电泳凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；紫外可 见分光光度计(BioSpec-nano，日本)。

2 RNA提取及反转录

用Trizol法提取各组织总RNA。RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光 光度计检测，保证RNA样品质量可靠，并计算样品总RNA浓度。取2～4μg总RNA，按照 Promega M-MLV反转录试剂盒(Promega，美国)的使用说明，合成cDNA第1链。

3 引物设计

根据组织样特点，选取三种常用内参基因β-actin、GAPDH、HPRT设计引物；同时针对目 的基因5-HT_2A、5-HT₇不同区段序列分别设计3对扩增引物。各对引物的详细信息见表1。

表1引物信息

4 实时荧光定量PCR(real-time fluorogenetic quantitative PCR)

PCR反应体系为：SYBR Green Taq Mix反应液10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 模板2μL，加双蒸水至总体积20μL。

用2实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)进行扩增，每个样品3个重复。94 ℃5sec，60℃40sec，40个循环；最后72℃延伸5min。绘制熔解曲线，65℃-95℃，每0.2 ℃读板一次。PCR反应结束后将产物置于4℃保存。取产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳确保产物 单一且大小正确。

5内参及引物的选择

以cDNA原液及其10、100、1000、10000倍稀释液作为模板，使用各对引物进行PCR 扩增。以2为底对模板浓度取对数，对数值作为横坐标；荧光信号达设定的域值时所经历的 循环数(Ct)为纵坐标，分别绘制每对引物扩增的标准曲线。计算各对引物的扩增效率。

不同引物扩增的相对标准曲线、熔解曲线见附图1-6，标准曲线的斜率、可信度(R²)、 扩增效率(E)见表2，扩增产物的琼脂糖电泳图见附图7。由附图1-6可见，内参基因、目 的基因熔解曲线呈单峰曲线，说明引物的特异性较好，没有引物二聚体和非特异性条带产生； 标准曲线的复相关系数R²值介于0.962～0.999之间，可信度较高。扩增效率的计算公式为 E＝10^(-1/斜率)－1，由表2可见，内参的引物扩增效率在99.5％～106％之间，表明引物扩增效率 较高，符合实时荧光定量PCR对扩增效率的要求；而目的基因的引物扩增效率在80％～120％ 之间，个别引物扩增效率过低，不能满足基因准确定量的要求。结合表和附图可以看出， 5-HT_2A-1、5-HT₇-3扩增效率接近100％，与内参基因扩增效率基本一致；电泳获得纯净单一 的扩增产物，特异性好，因此，本发明选取5-HT_2A-1、5-HT₇-3这两对引物用于目的基因的表 达检测。

表2引物扩增效率

3个候选内参基因分别用Normfinder和geNorm程序进行筛选评价，计算得到的稳定性 值越小，表明基因表达越稳定。由表3可见，内参基因的表达稳定性排列顺序为β-actin> GAPDH>HPRT。在肌肉组织和脂肪组织中均以β-actin基因最稳定,因此选取β-actin作为 内参基因用于后续real-time PCR分析试验对目的基因的校正。

表3内参稳定性分析结果

6最终优化的反应体系

5-HT受体基因反应体系：SYBR Green Taq Mix反应液10μL，上、下游引物各0.4μL， cDNA模板原液2μL，加双蒸水至总体积20μL。

内参基因反应体系：SYBR Green Taq Mix反应液10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 模板稀释液2μL，加双蒸水至总体积20μL。

7数据统计

测样品均重复三次，分别确定各样品内参基因和目的基因的Ct值，利用2^-ΔΔCt法计算基 因相对表达量，计算公式为：

基因表达量＝2^^{-((样品的目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值)-(校样品的目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值))}。

计算得到的数据采用SPSS21.0软件(SPSS Inc.，美国)进行统计分析。基因表达量统一 用平均数±标准差(mean±STD)表示，Student’s t-test法进行差异显著性分析，以P<0.05为 差异有统计学意义。

实施例25-HT受体基因在不同猪种、不同组织中的表达量

根据实施例1的方法，分别检测淳安花猪(脂肪型中国地方猪种，n＝12)、外三元猪(瘦 肉型快大商品猪，n＝12)的脂肪和肌肉组织中5-HT受体基因表达量，结果见表4。由表4可 见，5-HT_2A、5-HT₇受体基因在脂肪组织中表达量显著高于肌肉组织(P＜0.05)；5-HT_2A、5-HT₇在外三元猪肌肉中的表达量显著低于淳安花猪(P＜0.05)，而在脂肪中的表达则相反，但差 异不显著。

表4各组织中5-HT受体基因表达量

注：*表示组间差异显著(P＜0.05)。

淳安花猪(n＝12)、外三元猪(n＝12)的屠宰和肉质性能指标见表5。由表5可见，与脂 肪沉积相关的指标如板油率、背膘厚、肌内脂肪等均为淳安花猪显著高于外三元猪(P＜0.05)。 屠宰率、眼肌面积则相反(P＜0.05)。其他肉质相关指标中，24小时pH值为淳安花猪显著 高于外三元猪(P＜0.05)，肉色L值和滴水损失无显著差异。

表5屠宰和肉质性能指标

注：*表示组间差异显著(P＜0.05)。

淳安花猪、外三元猪的5-HT_2A、5-HT₇表达量与屠宰肉质指标相关性分别见表6、表7。 由相关性表可见，猪的体重和屠宰性能指标之间呈显著或极显著正相关。体重大，屠宰率就 高，反映产肉性能的眼肌面积就大，背膘、板油、肌内脂肪等脂肪性状就高。但不同猪种的 24小时pH值无相同规律。

猪肌肉中的5-HT_2A、5-HT₇表达量相关性较强；同样，脂肪中的5-HT_2A、5-HT₇表达量 相关性也较强。但是不同组织的5-HT表达量之间无相同的相关性规律。

各5-HT表达量与屠宰肉质指标之间基本呈负相关，尤其是肌肉中的5-HT_2A表达量，与 屠宰肉质指标负相关较强(外三元猪)或呈显著负相关(淳安花猪)。前面提到，外三元猪肌 肉中的5-HT表达量显著低于淳安花猪，说明这与外三元猪屠宰率、眼肌面积大，产肉量高 于淳安花猪的性能表现是一致的。

表6淳安花猪肌肉、脂肪中5-HT_2A、5-HT₇表达量与屠宰肉质指标的相关性

注：*表示组间差异显著(P＜0.05)，**表示组间差异极显著(P＜0.01)。

表7外三元猪肌肉、脂肪中5-HT_2A、5-HT₇表达量与屠宰肉质指标的相关性

注：*表示组间差异显著(P＜0.05)，**表示组间差异极显著(P＜0.01)。

采用本发明的引物及差异模板浓度的荧光定量PCR检测方法，可实现不同组织中猪5-HT 受体基因mRNA表达量的准确检测。根据5-HT在组织中的表达量，选择合适的模板浓度， 控制检测到的Ct值在准确的范围内。减少循环数少基底值的影响，及多循环数后异源二聚体 等无效扩增的干扰，具有较高的特异性、敏感性，使相对定量计算结果更准确，提高了5-HT 的检测准确性。本方法操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高。通过 5-HT受体基因与不同品种猪、不同组织肉质的相关分析，有助于挖掘我国地方猪种的资源特 色，为猪育种实践提供科学依据。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州市农业科学研究院

 

<120>  用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物及检测方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tctggcacca caccttct                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgatctgggt catcttctca c                                               21

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

aggtgctggg catagtctt                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gacggctgag gagaggtaac                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cagatcaact acggcagagc                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gcagaccgaa atcaccacca g                                               21