猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法的建立

摘要

拟建立一种简便、快速、准确的现场快速分子检测方法,为猪圆环病毒2型(PCV2)疾病的生物安全防控提供技术支撑.采用交叉引物恒温扩增技术原理,根据PCV2 Cap基因设计一组交叉扩增引物,用构建的Cap基因重组质粒作为标准DNA模板,对反应体系的引物浓度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反应温度和时间进行优化,并结合核酸试纸条技术,建立可视化检测PCV2的交叉引物恒温扩增检测方法(PCV2-CPA).用建立的CPA检测方法、常规PCR和ELISA方法检测经IFA方法标定的127份临床样品,比较这些方法的敏感性、特异性和符合率.结果显示,最佳反应体系为引物F3、B3各0.5μmol·L-1,CPR l μmol·L-1,DF5F 0.7 μmol·L-1、DF5B 0.9μmol·L-1,Betaine 0.075 mol·L-1,MgSO4 3 mol·L-1,dNTPs 0.4 mmol·L-1,Bst DNA聚合酶9.6U.建立的检测方法58℃扩增50 min,检测限可达7.6拷贝·μL-1,灵敏度是常规PCR的10倍;与PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV无交叉反应.三种检测方法的敏感性分别为78.08％～94.52％,特异性为87.03％～92.59％,符合率为84.25％～91.34％,ROC曲线图显示三种检测方法中,CPA检测方法效能最优.建立的猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法不需要PCR仪,仅一台水浴锅或金属浴即可完成病毒DNA的扩增,密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,可应用于猪圆环病毒2型的现场快速检测.