一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置及快速检测方法

摘要

本发明提供了一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置，主要包括可供细胞贴壁生长并且能直接在激光共聚焦显微镜上成像的多孔腔室；一个嵌套在腔室内可选择性透过并可支持细胞生长的滤膜。通过此装置，可将不同粒径的纳米材料以及纳米材料与溶解析出的离子分开，也可以将能透过细胞膜的纳米材料和不能够透过细胞膜的纳米材料分开，从而有助于明确纳米材料在水环境中的迁移、转化影响其遗传毒性的决定机制。本发明还提供了一种纳米材料诱导DNA损伤的快速检测方法，主要包括以下步骤：将细胞均匀种在装置内，与待检测的纳米材料共孵育；暴露后细胞用多聚甲醛固定；并通过TNBS溶液处理增加细胞膜通透性；利用DNA损伤标志性产物γ-H2AX特异性荧光抗体，结合共聚焦显微成像技术或流式细胞术，对“转化态”纳米材料引发的单细胞内DNA损伤进行快速、定位、定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置及快速检测 方法，主要应用于纳米毒理学检测的技术领域之中。

背景技术

纳米材料由于具有比表面积大和表面缺陷产生的一系列新的不 同于宏观物质的特性，目前已被广泛应用于涂料、染料、电子、医药、 国防、服装、化妆品、日用品、生物医药、农业、航天航空等多个领 域。根据美国Project on Emerging Nanotechnologies网站统计，截止 2011年3月，全球有明确标注、与人类生产生活密切相关的纳米产 品已达1317种，其中个人用品267种，化妆品和防晒霜176种，食 品和饮品105种。这意味着，纳米材料在被广泛应用的同时，会不可 避免地通过各种途径直接或间接地进入到环境介质(如水体、土壤、 沉积物等)中，对生态系统和人类健康产生不可预知的影响。

DNA是细胞核遗传信息的重要载体。纳米材料造成DNA损伤可 分为直接作用和间接作用：前者是纳米材料穿过细胞膜与核膜到达细 胞核，直接与DNA或核蛋白作用造成损伤；后者则是纳米材料通过 氧化压力、炎症反应或DNA修复异常等方式，间接造成DNA损伤。 然而，即使同一组成的纳米材料也会因环境因素的不同而导致理化性 质、赋存状态迥异，这使得其毒理学效应及机制研究存在诸多的不确 定性。如何在纳米材料复杂体系中研究其转归和毒性效应是当前纳米 材料生物安全性评价中迫切解决的关键科学问题之一。

发展一种能将与细胞共孵育的纳米材料按照粒径大小分开，纳米 颗粒与其溶解析出的离子分开以及能将进入细胞和不能进入细胞的 纳米材料分开的装置，可对阐明纳米材料诱导DNA损伤的机制提供 关键性技术支撑。

目前，纳米材料诱导DNA损伤的检测方法主要包括：彗星实验、 微核实验、Ames实验、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末 端标记测定等。这些实验从不同方面反映了DNA损伤情况。其中， 彗星实验又叫做单细胞凝胶电泳实验。细胞与琼脂糖混合，经裂解后 电泳，受损伤的DNA或DNA片段泳动出细胞形成区段，经图像分 析和计算机处理后能判断细胞DNA损伤情况。但是彗星实验一次只 能分析一个样品，实现大样本统计较难，并且重复性较差，人为因素 造成的误差较大。微核是指细胞有丝分裂后期出现在细胞质中的染色 体片段或染色体单体。对一定数量的细胞进行微核数目统计，可以判 断细胞DNA损伤程度。但是微核实验需要人工统计大样本细胞，费 时费力，效率较低，而且微核实验对DNA损伤响应的灵敏度不高。 Ames实验利用鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株，受诱变剂作用 后大量细胞发生回复突变，可自行合成组氨酸，在平板上形成肉眼可 见的菌落，对菌落数进行统计后，可以计算出突变率。虽然Ames实 验简单、方便、体系成熟，但是实验工作量较大，并且细菌是原核生 物，其结构和代谢方式与真核生物有一定的区别，诱变剂能诱导细菌 DNA损伤，但可能在真核生物上却不能诱导DNA损伤。末端脱氧核 苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记方法也称TUNEL法，其原理 是基因组DNA发生断裂时，3’-OH端可以在末端脱氧核苷酸转移酶 介导下，加上荧光素标记的dUTP，受损伤的DNA通过荧光显微镜 可直接观察。但是TUNEL法的不足在于，对于坏死的细胞TUNEL 也呈阳性，降低了TUNEL法检测DNA损伤的特异性。更重要的是 上述这些遗传毒性检测方法都是DNA发生严重损伤后才能探测，不 能作为DNA损伤早期预警。因此，建立一种快速、方便、高灵敏性 并且能探测早期DNA损伤的方法就显得尤其重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种纳米材料诱导DNA损 伤的检测装置。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种纳米材料诱导DNA损伤的检测装置，包括具有多个腔室的 细胞培养板，上述每个腔室均嵌套可透过细胞培养基并且选择性通透 纳米材料的滤膜。

进一步地，上述腔室底部设置有硅硼酸盐玻片，上述硅硼酸盐玻 片由胶原包被。

进一步地，上述滤膜为由聚碳酸酯材料构成的含有微孔的滤膜。

孔径大小有20nm、50nm、100nm、和200nm可供选择。

例如挑选孔径大小为50nm的滤膜嵌套在腔室内，把细胞均匀种 在腔室底部硅硼酸盐玻片上，将纳米材料在培养基中分散后加到嵌套 进腔室内的滤膜中。经滤膜过滤后，粒径小于50nm的材料才能通过 滤膜与底层的细胞相互作用，粒径大于50nm的材料则被截留在滤膜 上。

进一步地，上述滤膜为由阳离子交换膜材料构成的吸附金属阳离 子的含有微孔的滤膜。

滤膜由阳离子交换膜材料构成，其特征为可吸附金属阳离子。一 些金属及金属氧化物纳米材料，如纳米银、纳米氧化锌，在溶液中可 释放相应的金属离子，这些溶出的金属离子可被阳离子交换膜吸附， 使得与细胞发生相互作用的仅为纳米颗粒。

因考虑到阳离子交换滤膜在吸附金属阳离子时会向培养基中释 放氢离子，所以在试验中需注意在细胞培养基内应加入HEPES等缓 冲试剂，以保证培养基中的PH维持在合适细胞生长的范围内。

进一步地，上述滤膜为由磷脂双分子层构成的细胞膜透过性的滤 膜。

此类滤膜用以模拟细胞膜结构，其特征是细胞膜可透的纳米材料 能穿过滤膜，细胞膜不透的纳米材料则被截留在滤膜上。

进一步地，上述滤膜均由支架固定，上述支架和滤膜构成漏斗构 造，上述支架悬挂在上述腔室口处。

纳米材料分散于培养基后，直接将培养基加进漏斗结构中，培养 基可穿透滤膜与腔室底部细胞接触，根据选择性滤膜性质，允许透过 的材料则进入腔室内，与细胞相互作用，不允许透过的材料则被截留 在滤膜上，实现纳米材料选择性分离。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种纳米材料诱导DNA损 伤的快速检测方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种纳米材料诱导DNA损伤的快速检测方法，包括步骤：

1.取一皿满度生长的哺乳动物细胞，经胰蛋白酶酶解后统计细胞 总数；

2.取带若干个腔室玻片的细胞培养板，每个腔室玻片上种一定数 量的细胞，连续培养48小时待细胞进入对数生长期；或取若干个细 胞培养皿，每个细胞培养皿内种一定数量的细胞，连续培养48小时 待细胞进入对数生长期；

3.细胞进入对数生长期后，将纳米材料与培养基混合后再与细胞 共孵育；

4.孵育一定时间后，去除条件培养基，用磷酸盐缓冲液PBS漂洗 细胞3-5遍；

5.每个腔室玻片中的细胞用1ml2％-5％的多聚甲醛溶液室温固 定20分钟；或者将培养皿中的细胞酶解下来后，每皿细胞再用1ml 2％-5％的多聚甲醛溶液室温固定20分钟；

6.固定完成后去除多聚甲醛溶液，用PBS漂洗细胞3-5遍；

7.每皿细胞加入1ml TNBS溶液室温作用45分钟，TNBS溶液 与固定后的细胞反应后，能增加细胞膜通透性，使抗体能进入细胞内， TNBS溶液按照体积百分比包括0.5％-1.5％胎牛血清、 0.1％-0.5％Triton X-100、98％-99％PBS；

8.将抗γ-H₂AX的一抗按1:200-1:1000稀释到含1％胎牛血清的 PBS中，混匀后与细胞于室温孵育60分钟；

9.一抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3-5遍，每遍5分钟；

10.将FITC连接的羊抗兔IgG的二抗按1:200稀释到含1％胎 牛血清的PBS中，混匀后与细胞于室温孵育60分钟；

11.二抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3-5遍，每遍5分钟；

12.将10μg/ml的Hoechst33342溶液与细胞于室温孵育20分钟；

13.用TNBS溶液漂洗3-5遍，每遍5分钟；

14.加入甘油碳酸缓冲液，4℃暗盒保存，至共聚焦显微镜成像或 者用流式细胞仪检测。

进一步地，上述抗γ-H₂AX的一抗为多克隆抗体。

进一步地，上述细胞用纳米材料处理之前应在腔室玻片或细胞培 养皿中满度生长。

进一步地，利用激光共聚焦显微镜，原位检测γ-H₂AX蛋白的表 达。

进一步地，细胞核染料Hochest33342用紫外激发，发射波长为 400nm-480nm；FITC连接的抗γ-H₂AX抗体的二抗用488nm激发， 发射波长为500-580nm。

本发明以DNA双链断裂标志蛋白γ-H₂AX为靶标，通过免疫荧 光染色，观察细胞核内γ-H₂AX蛋白表达量变化，进而判断纳米材料 诱导的DNA损伤。其具体原理为DNA双链断裂被诱导后，引起细 胞内DNA断裂效应分子ATM(毛细血管扩张共济失调突变体基因表 达产物)自磷酸化和二聚体解离，解离后的ATM单体游离到底物P53 或DNA断裂处构型发生改变的组氨酸蛋白家族之一的H₂AX附近， 使H₂AX第139位的丝氨酸发生磷酸化，即称之为γ-H₂AX。研究表 明，γ-H₂AX和DNA双链断裂位点之间有很好的对应关系，一个DNA 双链断裂位点可形成一个γ-H₂AX位点，一个γ-H₂AX位点代表一个 DNA双链断裂的产生。研究表明，细胞对DNA双链断裂早期反应之 一就是组蛋白H₂AX的139位丝氨酸磷酸化，磷酸化后的H₂AX蛋白 可以招募如MDC1、RAD51、MRE11/RAD50/NBS1(MRN)等一系 列DNA损伤修复蛋白，对损伤的DNA进行修复。过氧化氢暴露10min 即可在细胞核区域看到形成小的γ-H₂AX位点，30分钟后形成的 γ-H₂AX位点清晰明显，位点数目达到最大值。因此，利用γ-H₂AX 免疫荧光染色，分析DNA双链断裂水平，能够很好地反应纳米材料 诱导的DNA损伤效应，并且能够在原位进行DNA双链断裂成像， 有助于快速、准确、高灵敏地探测纳米材料诱导的遗传毒性。

当细胞处于正常生理状态时，胞内DNA也会发生断裂。例如， 生殖细胞减数分裂时，同源染色体非姐妹染色单体基因重组过程中会 发生DNA双链断裂，H₂AX蛋白被磷酸化成γ-H₂AX；淋巴细胞发育 过程中，通过V(D)J基因重组产生各种各样的抗体来保卫机体不被外 来抗原侵袭，基因重组的过程伴随着DNA双链断裂，γ-H₂AX也会 随之形成；甚至个别情况下，在DNA复制期间，复制叉形成过程中 也伴随着H₂AX蛋白的磷酸化。所以，为降低细胞内源性γ-H₂AX的 背景，本发明采用细胞接触抑制方法，即在纳米材料处理细胞之前， 让细胞在腔室玻片或细胞培养皿中满度生长，细胞相互接触时停止分 裂，基因组不会发生重排，这样就能有效降低细胞内源性γ-H₂AX的 背景。本发明利用激光共聚焦显微镜，可以在细胞原位直接观察到纳 米材料诱导的DNA损伤。为实现纳米材料诱导DNA损伤的快速筛 查，在细胞培养之前，将细胞种在带若干个腔室玻片的细胞培养板上。 每块细胞培养板包含若干个独立封闭的腔室，细胞可在腔室底部的硅 硼酸盐玻片上贴壁生长，经纳米材料处理、γ-H₂AX免疫荧光染色后， 可直接用激光共聚焦显微镜观察。一块细胞培养板根据规格不同，分 别含6、12、24、96个腔室，这样在一块细胞培养板上最多可同时检 测96种纳米材料诱导的DNA损伤，提高了检测速度和效率。本发 明同时利用流式细胞仪，对纳米材料诱导的DNA损伤实现高通量检 测。流式细胞术具有数据采集量大、检测速度快、数据统计客观等特 点。对单个样品的分析能在数分钟内完成，并能得到细胞群的参数变 化情况。流式细胞仪虽然不能对纳米材料诱导的DNA损伤进行原位 观察，但是将激光共聚焦显微镜和流式细胞仪这两种方法相结合，既 能够在原位进行DNA损伤观察，也能够得到细胞群体的DNA损伤 数据，互补互足，发挥了各自的优势。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明提供了一种纳米材料诱导DNA损伤的 检测装置及检测方法。利用检测装置中的选择性微孔滤膜，可以将不 同粒径的纳米材料分离，能初步确定纳米材料粒径与DNA损伤之间 的相互关系；利用阳离子交换滤膜，可以吸附金属及金属氧化物纳米 材料溶出的阳离子，能够初步确定是纳米颗粒本身还是溶出的离子造 成了DNA的损伤；利用磷脂双分子层滤膜，可以使得细胞膜可透的 纳米材料与细胞相互作用，将细胞膜不透的纳米材料留在滤膜上，由 此可探明纳米材料水悬液复杂体系各组成成分对其遗传毒性的贡献， 所诱导DNA损伤是发生在膜内还是在膜外起作用。本发明提供的一 种纳米材料诱导DNA损伤的检测方法，利用抗原抗体反应的特异性， 能够准确地反映细胞内DNA损伤效应；并且利用抗原抗体反应具有 高效性，能够较为灵敏地检测纳米材料诱导的DNA损伤效应。利用 免疫荧光染色，可以在原位对DNA损伤进行成像。利用流式细胞仪， 可以对纳米材料诱导的DNA损伤进行快速、高通量筛查。γ-H2AX 蛋白作为DNA双链断裂早期过程标志蛋白，以γ-H2AX蛋白为靶标， 本发明也可作为纳米材料诱导DNA损伤的早期预警方法。本检测方 法过程简单，易于操作，成本低，灵敏度高，并且能同时检测多个样 品，能实现纳米材料遗传毒性准确、高效、快速的检测。

附图说明

图1为本实施案例DNA损伤检测装置的三维结构示意图；

图2为本实施案例DNA损伤检测装置的平面结构示意图；

图3为纳米氧化锌和纳米氧化钛诱导人鼠杂交瘤细胞γ-H₂AX蛋 白表达量的变化示意图。

具体实施方式

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

参照图1-图2，本发明，纳米材料诱导DNA损伤的检测装置， 包括具有多个腔室1的细胞培养板2，上述每个腔室1均嵌套可透过 细胞培养基并且选择性透过纳米材料的滤膜3。

进一步地，上述腔室1底部设置有硅硼酸盐玻片4，上述硅硼酸 盐玻片4由胶原包被。

进一步地，上述滤膜3为由聚碳酸酯材料构成的含有微孔的滤 膜。

孔径大小有20nm、50nm、100nm、和200nm可供选择。

例如挑选孔径大小为50nm的滤膜嵌套在腔室内，把细胞均匀种 在腔室底部硅硼酸盐玻片4上，将纳米材料在培养基中分散后加到嵌 套进腔室1内的滤膜3中。经滤膜3过滤后，粒径小于50nm的材料 才能通过滤膜3与底层的细胞相互作用，粒径大于50nm的材料则被 截留在滤膜3上。

进一步地，上述滤膜3为由阳离子交换膜材料构成的吸附金属阳 离子的含有微孔的滤膜。

滤膜由阳离子交换膜材料构成，其特征为可吸附金属阳离子。一 些金属及金属氧化物纳米材料，如纳米银、纳米氧化锌，在溶液中可 释放相应的金属离子，这些溶出的金属离子可被阳离子交换膜吸附， 使得与细胞发生相互作用的仅为纳米材料。

因考虑到阳离子交换滤膜在吸附金属阳离子时会向培养基中释 放氢离子，所以在试验中需注意在细胞培养基内应加入HEPES等缓 冲试剂，以保证培养基中的PH维持在合适细胞生长的范围内。

进一步地，上述滤膜3为由磷脂双分子层构成的细胞膜透过性的 滤膜。

此类滤膜用以模拟细胞膜结构，其特征是细胞膜可透的纳米材料 能穿过滤膜，细胞膜不透的纳米材料则被截留在滤膜上。

进一步地，上述滤膜3均由支架30固定，上述支架30和滤膜3 构成漏斗构造，上述支架30悬挂在上述腔室1口处。

纳米材料分散于培养基后，直接将培养基加进漏斗结构中，培养 基可穿透滤膜与腔室底部细胞接触，根据选择性滤膜性质，允许透过 的材料则进入腔室内，与细胞相互作用，不允许透过的材料则被截留 在滤膜上，实现纳米材料选择性分离。

一种纳米材料诱导DNA损伤的快速检测方法，其步骤是：

1.将购自美国NanoAmor公司的纳米氧化锌(粒径20nm)和纳米氧 化钛(粒径15nm)配置成1mg/ml的母液分散于超纯水中常温避光保 存。

2.人鼠杂交瘤细胞(A_Lcell，来源于美国哥伦比亚大学Tom K.Hei 实验室)用含8％胎牛血清的Ham’s F12培养基在37℃、5％二氧 化碳环境中培养(详见《动物细胞培养—基本技术指南(第四版)》)。 取一皿满度约80％的A_L细胞，经胰蛋白酶酶解后用血细胞计数板计 数。

3.取一个带4孔腔室的细胞培养板，每个腔室内种1×10⁵个A_L细胞，连续培养48小时待细胞进入对数生长期。

4.待细胞进入对数生长期后，分别将纳米氧化锌和纳米氧化钛分 散于培养基中，配制成终浓度10μg/ml的工作液与A_L细胞共孵育24 小时。

5.24小时后，去除条件培养基，每皿细胞用1ml磷酸盐缓冲液 (PBS)漂洗3遍。

6.漂洗后，每皿细胞用1ml2％的多聚甲醛溶液室温固定细胞 20分钟。

7.固定完成后去除多聚甲醛溶液，每皿细胞用1ml PBS漂洗3 遍。

8.漂洗后，每皿细胞加入1ml TNBS溶液室温作用45分钟，以 增加细胞膜通透性。

9.移除TNBS溶液，再将抗γ-H₂AX的一抗按1:200稀释到含 1％胎牛血清的PBS中，混匀后加到腔室玻片上，室温孵育60分钟。

10.一抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3遍，每遍5分钟。

11.将FITC连接的羊抗兔IgG(二抗)按1:200稀释到含1％胎 牛血清的PBS中，混匀后加到腔室玻片上，室温孵育60分钟。

12.二抗标记完成后，用TNBS溶液漂洗3遍，每遍5分钟。

13.将10μg/ml的Hochest33342溶液加到腔室玻片上，室温孵育 20分钟。

14.用TNBS溶液漂洗3-5遍，每遍5分钟。

15.加入甘油碳酸缓冲液，4℃暗盒保存，至共聚焦显微镜成像。

图3显示的是以Zeiss激光共聚焦显微镜拍摄的细胞图片。细胞 核用紫外激发，图像显示为灰斑(应为蓝斑，为符合审查要求将颜色 修改为灰斑)；γ-H₂AX用488nm激光激发，图像显示为白点(应为 绿点，为符合审查要求将颜色修改为白点)。从图中可以看出：经 γ-H₂AX免疫荧光染色，激光共聚焦显微成像并合成，位于细胞核内 的DNA双链断裂位点清晰可见。在10μg/ml浓度下，纳米氧化锌与 纳米氧化钛均能诱导A_L细胞γ-H₂AX的产生，纳米氧化锌诱导的DNA 损伤程度更大，上述结果初步表明纳米氧化锌诱导细胞DNA损伤的 能力比纳米二氧化钛强。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟 悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限 制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修 饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。