一株降解花生粕中黄曲霉毒素B

摘要

本发明公开了一株降解花生粕中黄曲霉毒素B

说明书

技术领域

本发明涉及一株降解花生粕中黄曲霉毒素B₁的解淀粉芽孢杆菌，属于应用微生物技术领 域。

背景技术

花生粕是一种优良的植物性蛋白饲料，每年产量在300万吨，来源广泛；蛋白质含量丰 富；代谢能也是粕类饲料中最高的；同时含有8种必需氨基酸；但是花生粕极易污染黄曲霉 毒素。

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus) 产生的强毒性次级代谢产物。1993年，国际癌症组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)将其列为一级致癌物。黄曲霉毒素主要通过致癌、致畸、致突变的“三致”作用 和免疫抑制等危害动物及人体健康。其危害的靶器官主要是肝脏。目前已经鉴定出的黄曲霉 毒素有20多种，而黄曲霉毒素B₁是食品、饲料中最常见，也是毒性最大的。

目前用于去除黄曲霉毒素的方法主要有物理法、化学法和生物法。而生物法以其处理条 件温和，不破坏产品品质，且可以增加产品营养价值而得到广泛认可。

目前针对黄曲霉毒素的生物脱毒方法主要有乳酸菌和酵母菌等菌体细胞对毒素的吸附作 用，但是其作用机理是菌体和黄曲霉毒素通过疏水相互作用以非共价键形式结合形成菌体- 黄曲霉毒素复合体，这种吸附作用是物理性质，可逆，在一定条件下可能脱吸附，黄曲霉毒 素仍然具有本身的毒性，并没有被有效去除。微生物发酵产生的酶或植物提取物对毒素的降 解作用，如所报道的橙色黏球菌、分枝杆菌、红串红球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、假蜜环菌、 白腐真菌等所产生的代谢酶，萝卜中的辣根氧化酶等都有明显降解黄曲霉毒素的作用。但是 相关的研究更多是局限在实验室研究阶段，工业化应用的研究并不多。

本发明提供的一株能够降低花生粕中黄曲霉毒素B₁的解淀粉芽孢杆菌及应用，菌株在生 长过程中不仅显著抑制黄曲霉生长，从源头上减少黄曲霉毒素B₁产生；而且能够高效降解花 生粕中已有的黄曲霉毒素B₁。菌株的脱毒机理为胞外代谢产物的降解作用，通过非诱导作用 产生，具有很高的工业应用价值。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)， 该菌已于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为CGMCC No.9021，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所。所述解淀粉芽孢杆菌能够抑制黄曲霉的生长，并降解黄曲霉毒素。

所述黄曲霉毒素优选黄曲霉毒素B₁。

所述解淀粉芽孢杆菌具有以下特性：

(1)较易培养

在肉汤琼脂培养基上菌落形状不规则，有皱褶，边缘不整齐，灰白色，中央隆起，菌落 粘稠。在肉汤培养基中生长时，形成白色皱醭。革兰氏染色镜检阳性，菌体中央部位有芽孢。 在肉汤培养基中培养12h能迅速达到10⁹CFU/mL，且培养基配方简单。

(2)能抑制黄曲霉生长

解淀粉芽孢杆菌在生长过程中能显著抑制黄曲霉生长，从源头上减少黄曲霉毒素B₁的产 生。

(3)降解黄曲霉毒素B₁的成分为胞外产物，且非诱导产生

该菌株是通过胞外酶降解黄曲霉毒素，而非菌体吸附作用；且胞外酶对黄曲霉堵塞的降 解为非诱导性。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述解淀粉芽孢杆菌降低花生粕中黄曲 霉毒素B₁的方法，是向灭菌后的花生粕中接种经活化培养的解淀粉芽孢杆菌。

所述应用方法优选以下步骤：将污染有黄曲霉毒素B₁的花生粕样品粉碎、烘干、称量 20～50g，加入250mL发酵瓶中，高压蒸汽灭菌；将活化、扩培好的解淀粉芽孢杆菌种子液以 5～15％接种量，料水比1:0.5～1接入冷却后的花生粕中，搅拌均匀；在发酵温度35～40℃条件 下发酵60～72h，每隔6h翻拌一次，使其再次混匀；将发酵后的花生粕烘干、粉碎。

本发明提供的一株能够降低花生粕中黄曲霉毒素B₁含量及抑制黄曲霉生长的解淀粉芽 孢杆菌，不仅从源头上抑制了黄曲霉产生黄曲霉毒素，而且也对黄曲霉毒素实现了高效降解 的双重作用。该菌菌不是通过菌体吸附作用，而是真正实现了酶解花生粕中黄曲霉毒素B₁， 更加安全可靠。同时菌株胞外酶的非诱导型降解作用，非常有利于工业化的运用。该菌应用 过程简单，操作方便，生物降解法条件温和，不破坏产品品质，能够使污染花生粕得到有效 利用，而且可以增加产品营养价值，具有很高的工业应用价值。

生物材料保藏

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)已于2014年4月8日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9021，保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌在生长过程中对黄曲霉生长的抑制。

具体实施方式

实施例1解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.9021的特性

(1)较易培养

解淀粉芽孢杆菌在肉汤琼脂培养基上菌落形状不规则，有皱褶，边缘不整齐，灰白色， 中央隆起，菌落粘稠。在肉汤培养基中生长时，形成白色皱醭。革兰氏染色镜检阳性，菌体 中央部位有芽孢。在肉汤培养基中培养12h能迅速达到10⁹CFU/mL，且培养基配方简单，工 业化应用将更加经济、实用。

(2)能抑制黄曲霉生长

解淀粉芽孢杆菌在生长过程中显著抑制黄曲霉(如黄曲霉CGMCC NO.3.4408、CGMCC No.3.4410)生长，从源头上减少了黄曲霉毒素B₁产生。如图1所示，滤纸片周围生长有解 淀粉芽孢杆菌，中间呈现黄绿色被抑制的是黄曲霉(CGMCC>

(3)降解黄曲霉毒素B₁的成分为胞外产物，且非诱导产生

如表1、2所示，解淀粉芽孢杆菌液体发酵后的胞外液具有明显降解黄曲霉毒素B₁的效 果，而其菌体细胞、胞内液对黄曲霉毒素B₁降解效果甚微；对胞外液加热或加入蛋白酶-K 处理，胞外液的作用效果几乎消失；而且在有、无黄曲霉毒素B₁底物存在的情况下，发酵后 的胞外液对黄曲霉毒素B₁的降解作用没有明显区别。以上现象说明该菌株对黄曲霉毒素的降 解机理为胞外酶的降解作用，而非菌体的吸附作用，且该酶的产生为非诱导性，这些都有利 于该菌株的工业化应用。

表1

表2

实施例2解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.9021对花生粕中低含量黄曲霉毒素B₁的降解作用

挑取斜面上的解淀粉芽孢杆菌于肉汤培养基中，37℃、200r/min振荡条件下进行24小时 一级活化，再经含3％(m/v)花生粕的肉汤培养基二级扩培12小时。将污染有黄曲霉毒素 B₁的花生粕样品粉碎、烘干，准确称量50g，加入250mL发酵瓶中，高压蒸汽灭菌。将二级 扩培的解淀粉芽孢杆菌种子液以10％(v/w)接种量接入冷却后的花生粕中，调整料水比为 1:0.8，无菌条件下搅拌均匀，瓶口用8层纱布包裹。将接种后的发酵瓶置于37℃恒温培养箱 中，发酵72h，发酵期间每隔6h对发酵瓶中的花生粕进行搅拌。将发酵后的花生粕60℃烘干、 粉碎。准确称取20g，以固相萃取法提取其中黄曲霉毒素B₁，利用高效液相色谱测定其含量。

本实施例所采用的花生粕样品中黄曲霉毒素B₁含量为12.32μg/kg，经解淀粉芽孢杆菌固 态发酵脱毒后其含量降低至1.45μg/kg，脱毒率达88.24％。未接种解淀粉芽孢杆菌的对照组 中黄曲霉毒素B₁含量为16.52μg/kg。

实施例3解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.9021对花生粕中高含量黄曲霉毒素B₁的降解作用

挑取斜面上的解淀粉芽孢杆菌于肉汤培养基中，37℃、200r/min振荡条件下进行24小时 一级活化，再经含3％(m/v)花生粕的肉汤培养基二级扩培12小时。将污染有黄曲霉毒素 B₁的花生粕样品粉碎、烘干，准确称量50g，加入250mL发酵瓶中，高压蒸汽灭菌。将二级 扩培的解淀粉芽孢杆菌种子液以10％接种量，1:0.8料水比接入冷却后的花生粕中，无菌条件 下搅拌均匀，瓶口用8层纱布包裹。将接种后的发酵瓶置于37℃恒温培养箱中，发酵72h， 发酵期间每隔6h对发酵瓶中的花生粕进行搅拌。将发酵后的花生粕60℃烘干、粉碎。准确 称取20g，以固相萃取法提取其中黄曲霉毒素B₁，利用高效液相色谱测定其含量。

本实施例所采用的花生粕样品中黄曲霉毒素B₁含量为145.17μg/kg，经解淀粉芽孢杆菌 固态发酵降解后其含量降低至27.01μg/kg，脱毒率达81.39％。未接种解淀粉芽孢杆菌的对照 组中黄曲霉毒素B₁含量为141.14μg/kg。

综上所述，该菌不仅对低黄曲霉毒素B₁含量(12.32μg/kg)的花生粕样品有88.24％的脱 毒率；而且对较高黄曲霉毒素B₁含量(145.17μg/kg)的花生粕样品也有81.39％的脱毒率， 脱毒后其黄曲霉毒素B₁含量小于30μg/kg，符合国家对饲料中黄曲霉毒素B₁含量的限量要求 (≤50μg/kg)，达到了饲用安全标准，适合应用于对发霉饲料中黄曲霉毒素B1的工业化脱毒 处理。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。