一种利用酶-化学法定向制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的方法

摘要

本发明公开了一种利用酶-化学法定向制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的方法，首先以甘油为起始原料，搅拌条件下，与油酸在反应的温度下溶解，加入游离或固定化的脂肪酶做催化剂，进行选择性酯化反应，得到1,3-位甘油二酯；再将得到的甘油二酯与棕榈酸或棕榈酸衍生物反应，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的粗产品；最后通过分子蒸馏，得到所述的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。本发明通过筛选特定的脂肪酶用于1,3-DAG的制备，获得1,3-DAG的含量为90％以上，收率达到90％以上；最终获得的1,3-二油酸-甘油二酯的含量高达95％,收率达到95％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及功能性脂质研究领域，具体涉及一种利用酶-化学法定向 制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的方法。

背景技术

甘油三酯(TAG)是脂肪的重要组成，其含有甘油和三种脂肪酸。TAG 主要根据脂肪酸与酰基结合位点的不同，可分为α(Sn-1,3)位与β(Sn-2) 位两种主要类型。由于TAG中存在不对称的C原子，脂肪酸与甘油的结 合位点可分为三种：Sn-1(α)位，Sn-2(β)和Sn-3(α)位。结构脂(Structured  lipids)是根据脂质在体内消化和代谢过程所设计的一种特殊的脂肪，通过 改变天然脂质中脂肪酸的组成和各种脂肪酸在TAG中的位置，并将具有 特殊营养或生理功能的脂肪酸结合到特定位置，从而最大限度地发挥各种 脂肪酸的物理和功能性质。由于不同的异酸甘油三脂在体内消化和代谢过 程的不同，因此可以通过改变天然脂质中脂肪酸的组成和各种脂肪酸在 TAG中的位置，将具有特殊营养或生理功能的脂肪酸结合到特定位置， 从而可以最大限度地发挥各种脂肪酸的营养和吸收等功能。

新生儿的舌脂肪酶水解Sn-3(α)位脂肪酸的速率要比Sn-1(α)位 的速率要快2倍。这些消化的短链与中链脂肪酸进入口腔粘膜，转化为乙 酰CoA。乙酰CoA作为细胞内的能量来源，脂肪酸无需转化为酰肉碱通 过细胞的内质网。人乳中TAG中棕榈酸主要在Sn-2(β)位，棕榈酸在 Sn-2(β)位有利于小肠对脂肪酸的吸收。因此，新生儿通过此机制可以 方便地吸收能量。但是，与人乳不同的是天然的脂肪酸和油脂中TAG中 Sn-2(β)位主要是棕榈酸，目前在婴儿配方食品中，TAG中Sn-1和Sn-3 一般酯化的是棕榈油，少量结合在Sn-2位。牛乳中Sn-2位的棕榈酸含量 要比植物油高40％。因此为了改善TAG的结构，更好地使其应用于婴儿 食品，需要对天然的脂肪和油脂中的TAG进行改造，这些改造的人乳脂 肪(HMF)称为人乳脂肪替代物(HMFS)。

HMFS是结构三酰甘油，又称结构脂，其结构与HMF相似，其中结构 脂的Sn-2位被饱和脂肪酸所占据。其中，不饱和脂肪酸约占在结构脂的1,3- 位总棕榈酸和不饱和脂肪酸的70％。结构脂除作为人乳脂肪替代物外， 还是控制肥胖症和降低血清胆固醇的有效类脂物，在医药领域具有广泛的 应用。目前，主要的类型为Sn-USU(S指饱和脂肪酸，U指不饱和脂肪酸)， 被广泛应用的是1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(1,3-dioleoyl-2- palmitoylglycerol，OPO)。

包括OPO在内的结构脂在自然界不存在，需要人工改造合成。如果采 用化学合成法，在甘油分子上定位分布某种脂肪酸目前还无法控制，因此 文献中未有化学法制备的报道。目前结构脂的制备国内外主要通过酶法或 化学－酶法实现。

脂肪酶由于具有位置选择性，可对催化产品有目的地作用，从结构上 进行分子设计，制备具有高附加值产品。酶法生产OPO主要是以一种富含 Sn-2位棕榈酸的油与酰基供体在Sn-1，Sn-3位专一性脂肪酶的催化下通 过酯交换来制备合成结构脂。现有的OPO的制备工艺主要是从棕榈酸三甘 油脂(PPP)为原料出发进行制备的，同时根据制备过程中使用脂肪酶的 次数，可以分为一步酶法、两步酶法和其它方法，如下式所示。

1)一步酶法

OPO的制备一般用棕榈油(硬脂精或棕榈酸三甘油酯)为底物，在 1,3特异脂肪酶催化下发生酯交换反应，在制备过程中，由于这种方法存 在的问题是产物中含有PPP，PPO和OPP，其中产物中PPO，OPO和PPP 的摩尔比分别为48:36:16，OPO比例不高。而且产物需要用蒸馏法分离， 成本较高，OPO的得率只有42.8％(理论值应为66.6％)。该法已有联合 利华申报专利，并已投入产业化生产。

由于该法存在上述缺点，目前已有很多人对该法进行改进，如下所述：

(1)保加利亚Guncheva M等人(Journal of the American Oil Chemists  Society,2008,129-132)将棕榈酸三甘油酯(99％)与油酸(98％)在脂肪 酶MC7(Bacillus stearothermophilus)作用下合成OPO甘油三酯。缺点： 该反应产物中有大量的副产物，给后续分离纯化带来了一定的困难。

(2)台湾Chen M L等人(Journal of the American Oil Chemists  Society,2004,525–532)报道了通过三步获得富含OPO甘油三酯的方法： 首先将棕榈油水解后并经分馏获得棕榈酸，接着将棕榈酸转化为棕榈酸乙 酯；其次将棕榈酸乙酯和甘油在Novozym435的作用下合成PPP；最后将棕 榈酸三甘油酯和油酸在正己烷体系和Lipozyme IM60作用下合成OPO甘油 三酯，其中油酸的插入率为66.1％，Sn-2棕榈酸为90.7％，OPO纯度可到74％ 左右。

(3)Antia S等人(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006, 5175–5181)比较了LIPI(Candida rugosa lipase)和Lipozyme RMIM脂肪 酶在正己烷溶剂体系催化棕榈酸三甘油酯和油酸及油酸甲酯合成OPO的 效果，研究了反应底物、反应温度、反应时间等因素对合成OPO的影响。 结果发现LIPI的Sn-1,3专一性没有Lipozyme RMIM的强，另外油酸甲酯比 油酸做酰基供体的插入率高。

(4)韩国JEUNG HL等人(NewBiotechnology,2010,38-45)将棕榈酸 三甘油酯(92％)与油酸乙酯在Lipozyme TLIM脂肪酶的作用下合成富含 OPO的结构脂肪。结果在最佳条件下可以获得含量为31.43％的OPO，其中 Sn-2棕榈酸为80.6％，Sn-1,3油酸为64.9％。

(5)西班牙Luis E等人(Biochemical Engineering Journal,2011,62-69) 通过两步酶法酯交换反应获得OPO产品：首先棕榈油硬脂精与棕榈酸在非 专一性脂肪酶作用下合成棕榈酸三甘油酯；接着将棕榈酸三甘油酯与油酸 在不同Sn-1,3专一性脂肪酶(如来源Rhizopus oryzae的lipaseDF from, Mucor miehe的Palatase20000L,Rhizomucor miehei的Lipozyme RM IM (诺维信公司)，Thermomyces lanuginosus的Lipozyme TL IM和 Alcaligenes sp的lipase QLC)的对和成OPO的影响。

(6)Toshihiro N等人(Journal of the American Oil Chemists Society, 2001,167-172)将棕榈酸三甘油酯(含89％C16:0和8％C18:0)与油酸(88％) 在热稳定性脂肪酶R275A(Fusarium heterosporum)的作用下合成OPO 甘油三酯。并考察了固定化的R275A在无溶剂体系的热稳定性，发现 R275A在无溶剂体系60℃具有很高的热稳定性，其半衰期可达370d。在 棕榈酸三甘油酯和油酸的比例为1︰2(质量比)，反应温度为50℃，反应 时间为24h，8％酶量等反应条件下最终产品中含有36％的OPO。

(7)公开号为WO2005036987A1和WO2007029018A1的美国专利文献 中公开了将棕榈油硬脂精和油酸在Sn-1,3脂肪酶的作用下进行合成反应， 接着将反应产物进行分提得到富含OPO的甘油三酯的结构脂肪。

(8)公开号为WO2008104381A1的美国专利文献中公开了将碘值为 18～40两种或两种以上的来自棕榈硬脂酸精的棕榈油先自身随机酯交换， 再与油酸或其非甘油酯进行酯交换。随机酯交换能显著提高棕榈酸在Sn-2 位分布，从而提高最终产品的得率。

2)两步酶法

虽然一步酶转换法可以制备OPO，但该法很难将所有中间反应产生的 甘油二酯(DAG)转化为OPO，而且一步酶法会产生大量的副产物，这对 产业化生产OPO较为不利。目前，采用两步酶法生产OPO已经引起了人们 的兴趣。将棕榈酸三甘油酯在溶剂体系中，在Sn-1,3专一性脂肪酶的作用 下，经醇解(alcoholysis)和提纯后得到纯度大于95％的Sn-2-棕榈酸单甘 油酯(2-MAG)，接着将Sn-2-棕榈酸单甘油酯与酰基供体油酸在溶剂或 无溶剂体系下合成(trans-esterification)OPO。该法的优点是采用醇解代 替水解可有效地防止酰基转移，从而得到高纯度2-MAG，但该法也存在一 定的问题，主要是需要多步纯化，从而影响了该工艺的工业化应用。

(1)Schmid U等人(Biotechnology and Bioengineering,1999,678-684) 通过两步法获得富含OPO甘油三酯：首先将棕榈酸三甘油酯在溶剂体系 中，在Sn-1,3专一性脂肪酶的作用下，经醇解和提纯后得到纯度为大于95％ 的Sn-2-棕榈酸单甘油酯，接着将Sn-2-棕榈酸单甘油酯与酰基供体油酸在 溶剂或无溶剂体系下合成OPO甘油三酯，产品纯度可达82％，其Sn-2棕榈 酸为96％。

(2)公开号为EP0882797的欧洲专利报道了首先将棕榈油硬脂精在 Sn-1,3专一性脂肪酶Rhizopus Delamar作用下获得纯度大于95％的Sn-2棕 榈酸单甘油酯。接着将Sn-2棕榈酸单甘油酯与油酸在固定化的Rhizopus  Delamar脂肪酶以及正己烷体系或无溶剂体系的反应条件下获得纯度大于 90％，得率为大于70％的OPO。

(3)Jan P等(Pfeffer Jan,Freund Andreas,Bel-Rhlid Rachid,et al.Highly  efficient enzymatic synthesis of2-monoacylglyceridesand structured lipids and  their production on a technical scale[J].Lipids,2007,42:947-953.)通过小型中 试设备将棕榈油棕榈酸三甘油酯和乙醇在诺维信CaIB(Novozym435)和 丙酮溶剂体系中经醇解作用和冷冻分提获得Sn-2棕榈酸单甘油酯。接着将 Sn-2棕榈酸单甘油酯与油酸在CaIB以及正己烷反应条件下获得纯度95％， 得率为90％的OPO。

3)其它方法

(1)Nese S等人(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006, 3717–3722和Journal of the American Oil Chemists'Society,2005,549-557) 将棕榈酸三甘油酯与榛子油脂肪酸(富含油酸)和EPA、DHA酰基供体在 正己烷溶剂体系下通过脂肪酶Lipozyme RMIM的催化作用下合成富含 OPO，EPE和DPD甘油三酯的结构脂肪。此方法可以解决鱼油的腥味问题。

(2)Yuji S等人(Journal of the American Oil Chemists Society,2000, 89-93)将棕榈酸三甘油酯与花生四烯酸在Sn-1，3专一性脂肪酶Rhizopus  delemar的作用下合成APA。其中棕榈树三甘油酯与ARA的摩尔比例为1：5， 反应温度为40℃，时间24h，结果有60％的ARA结合在结构脂肪的Sn-1，3 位，30％的棕榈酸结合在结构脂肪的Sn-2位。

(3)Huri I等人(Food Science and Technology,2011,999-1004)通过棕 榈酸三甘油酯(85％纯度)与榛子油脂肪酸(富含油酸)和C8:0、C10:0 脂肪酸在Lipozyme RMIM的作用下合成富含OPO、CPC和CyPCy甘油三 酯结构。

(4)公开号为EP0965578的欧洲专利报道了通过棕榈酸三甘油酯和 C8:0，在Lipozyme IM60作用下合成CPC甘油三酯结构。该方法能够提高 产品的稳定性能。

从上述研究报告可以发现，目前以OPO为主要代表的结构三酰甘油的 制备方法主要以同酸甘油三脂即棕榈酸三甘油酯为原料，采用1,3位选择性 转酯酶将PPP经过1,3位转酯化合成OPO等1,3-位相同脂肪酸甘油三脂，该 类方法存在的主要问题是产品纯度低,1,3位转酯率低,产品中杂质含量高, 产品分离成本高以及生产步骤繁杂等问题,不仅影响了产品的纯度和收率, 而且还提高了产品的生产成本。

发明内容

本发明提供了一种利用酶-化学法定向制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油 三酯的方法，从价格低廉的甘油出发，筛选高效的脂肪酶，经选择性酯化 反应获得高产率的1,3-甘油二酯中间体，再经化学酯化法制备得到OPO， 产品纯度最高可达96％。

本发明公开了一种利用酶-化学法定向制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油 三酯的方法，包括如下步骤：

(1)将摩尔比为2.0～2.2:1的油酸和甘油加入反应器，搅拌条件下加 热至35℃～65℃，加入脂肪酶，在真空度为300～500Pa下进行酯化反应， 直至体系中油酸含量<0.5％，经过滤得到1,3-二油酸甘油二酯；

(2)将步骤(1)得到的1,3-二油酸甘油二酯、三乙胺和溶剂混合， 搅拌冷却至0～6℃，再加入棕榈酸或棕榈酸衍生物，保温反应1～5h后， 升温至室温后继续反应，直至1,3-二油酸甘油二酯的转化率>97％，再经过 滤、洗涤、干燥得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的粗品；

所述的三乙胺与1,3-二油酸甘油二酯的摩尔比为1～2:1；

所述的棕榈酸或棕榈酸衍生物与1,3-二油酸甘油二酯的摩尔比为 1～1.5:1；

(3)将步骤(2)得到的粗品进行分子蒸馏，得到所述的1,3-二油酸 -2-棕榈酸甘油三酯。

本发明设计了一条从低成本的甘油出发的新路线，涉及的工艺主要包 括以下关键技术：

①、首先是在甘油的Sn-1,3位进行选择性酯化反应，在脂肪酶催化作 用下进行，通过真空蒸馏除水或其它方法使酯化的平衡偏向目标化合物， 制备得到1,3-甘油二酯中间体。

②、然后在甘油剩下的2位用化学方法选择性引入棕榈酸，具体步骤 如下式所示：

式中：R₁＝-CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇，R₂＝-C₁₆H₃₁。

所述的脂肪酶为游离脂肪酶或固定化脂肪酶，酶的加入量为50～5000 国际单位/每摩尔甘油。

所述的脂肪酶为Lipase PL、CALA(菌种为Candia antarctica)、TTL (菌种为Thermus thermophilus)、RAL(菌种为Rhizopus arrhizus)、CLL (菌种为Candia lipolytica)、Lipolase Ultra、CRL(菌种为Candiada  rugosa)、Lipase PS(菌种为Burkholderia cepacia)、Amano AK(菌种为 Pseudomonas fluorescens)、PPL(菌种为Porcine pancreas)、LipSM54(菌 种为Stenotrophomonas maltophilia CGMCC4254)或LipPA99(菌种为 Pseudomonas pseudoalcaligenes CGMCC No.4405)。

所述的固定化脂肪酶可以通过包埋、吸附或交联获得。

作为优选，所述的脂肪酶为LipSM54、Lipolase Ultra或LipPA99。

LipSM54为游离脂肪酶，制备方法可参照公开号为CN102031237B的 中国专利文献，具体为：

将保藏号为CGMCC No.4254的寡养单胞菌加入到培养基中进行发酵 培养，将发酵液冷冻干燥制得所述的LipSM54脂肪酶。

所述培养基的成分为：蛋白胨1～25g/L、乳糖1～15g/L、酵母膏1～8g/L、 硫酸铵0～10g/L、磷酸氢二钾1～6g/L、氯化钠0～2g/L和无水硫酸镁0～1g/L， 所述培养基的pH值为5～10。

进一步优选：

所述的脂肪酶Lipolase Ultra为多孔玻璃吸附的Lipolase Ultra，制备方 法如下:

按质量百分比为65：27：8称取SiO₂、B₂O₃和Na₂O，在马弗炉中1000℃ 加热2小时，1500℃保温12小时，将熔融的玻璃粉碎，再用氧化镁作隔 离剂，加热至850℃，保温1小时后取出，冷却、过筛除去氧化镁，得到 玻璃微珠，再挑选直径为1.5～2mm的玻璃微珠为原料。

称取1g多孔玻璃微珠置于250mL三角烧瓶中，加入50mL的Lipolase  Ultra脂肪酶缓冲溶液，所述的缓冲液为pH＝7.0的100mLKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲溶液，真空抽气15min，在4～8℃的水浴恒温振荡器中振荡吸附1～4h 后，倒出残余酶液，用pH＝6.5～7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液充分洗涤 玻璃微珠后，真空干燥即为多孔玻璃吸附的Lipolase Ultra，为固定化酶。

其中，作为原料的Lipolase Ultra可以通过市售获得。

所述的脂肪酶LipPA99为海藻酸钙包埋的LipPA99或离子交换吸附的 LipPA99。

海藻酸钙包埋的LipPA99的制备方法：

称取5～10g LipPA99酶粉，溶解于pH＝7.0的100mL KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲溶液中，过滤得到酶液。向酶液中加入0.2～1mol/L海藻酸钠溶液，混 合均匀后利用脉冲电场微球制备仪滴入20mg/mL的CaCl₂水溶液中，固化 15～30min得到海藻酸钙包埋的LipPA99，为固定化酶。

离子交换吸附的LipPA99的制备方法：

称取10g经清洗、浸泡后的罗门哈斯AMBERLITE FPA42Cl离子交 换树脂于250mL三角烧瓶中,加入含有1g酶粉(脂肪酶活力大于50单 位/g)的pH＝7.0的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液100mL，控制温度0～6℃恒定， 转速110r/min，在恒温振荡器中吸附固定。固定完成后，移取一定量的 上清液,抽滤，用4℃的去离子水洗涤，得到所述的离子交换吸附的脂肪酶 LipPA99，为固定化酶。

其中，作为原料的脂肪酶LipPA99的制备方法可参照公开号为 CN102154166A的中国专利文献，具体为：

将保藏号为CGMCC No.4405的产碱假单胞菌加入到培养基中进行发 酵培养，所述产碱假单胞菌相对于培养基的接种量为1～10％(体积)，发 酵时间为12～48h，温度为15～50℃，再将发酵液冷冻干燥制得所述的 LipPA99脂肪酶。

所述培养基的成分为：酪蛋白1～10g/L、吐温-801～15g/L、酵母膏 1～8g/L、硫酸铵0～10g/L、磷酸氢二钾1～6g/L、氯化钙0～0.5g/L和无水硫 酸镁0～1g/L，所述培养基的pH值为5～10。

更进一步优选，所述脂肪酶的加入量为500～1500国际单位/每摩尔甘 油。

作为优选，所述的溶剂为碳数为5～12的脂肪烃、石油醚或碳数为1～6 的氯代烷烃。

作为优选，所述的分子蒸馏的温度为180～220℃，真空度<40Pa，进 料速度为5～10g/min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明以便宜易得的甘油为起始原料，利用脂肪酶的选择性，在 甘油的Sn-1,3位反应生成1,3-甘油二酯(1,3-DAG)，进一步采用化学酯化 反应生产OPO，是一种合成此类产品的新策略和新工艺，目前未见文献报 道。

2、本发明通过筛选获得的高选择性脂肪酶进行1,3-二油酸-甘油二酯 的制备，其中1,3-DAG的含量在90％以上，收率也达到90％以上；采用包 埋(微胶囊或海藻酸钙或卡拉胶)、共价交联、多孔材料(如多孔玻璃或 多孔陶瓷)吸附等方法对脂肪酶进行固定化后，1,3-二油酸-甘油二酯的含 量95％以上,收率达到95％以上，固定化酶可以循环使用20次以上。

3、通过本发明建立的酶-化学法合成得到的结构脂产品，不仅产品收 率高，而且不经过分子蒸馏进一步纯化产品纯度就可以大于85％(w/w)， 其中Sn-2位饱和脂肪酸占所有饱和脂肪酸的比例大于65％以上，产品纯度 和Sn-2位饱和脂肪酸的含量都已超过国家标准，优于目前已有报道的工 艺。

具体实施方式

实施例1：

A、游离酶法制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入游离油酸282g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，LipSM54脂肪酶10g。搅拌，加热55℃，系统用真空泵抽真 空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷肼回收反应产生的水。反应 大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后，停止反应，过滤除去脂肪酶， 用于下次使用，产品为淡黄色滤液，收率97％，1,3-二油酸甘油二酯的含 量在96％左右。

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)和1,3-二油酸甘油二酯 (1,3-Di(cis-9-octadecenoyl)glycerol)的测定方法为与标准样品对照的气象 色谱法：(OPO和1,3-二油酸甘油二酯标样购买于Sigma)

采用高温气相色谱法(HT-GC)直接分析游离脂肪酸和各种甘油单酯、 二酯、三酯。具体方法是：以叔丁醇为溶剂，以三月桂酸甘油酯为内标， 配置待测甘油酯和内标的溶液，待测物和内标浓度均为1mol·L^-1。在气 相色谱上进样分析。进样量0.5μL；色谱柱：DB-17ht；柱箱温度：300℃， 汽化室(进样器)温度：340℃，检测器温度：340℃；载气(氢气)流 速：240mL·min^-1，空气流速：170mL·min^-1。甘油单酯出峰时间：1.7min， 内标出峰时间5.3min，1,2-二酯8.4min，1,3-二酯9.1min，OPO三酯: 14.1min。

B、棕榈酸酰氯化学转酯制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入石油醚300ml、三乙胺53g (0.503mol)和步骤A中的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加 棕榈酸酰氯(0.5mol)的石油醚溶液(200ml)，滴加完毕，保温反应3h， 慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停止反应， 过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系的pH为中 性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体产品，OPO 的含量在94％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，加热油 的温度控制在200℃左右，把上面的OPO粗品，根据设备按5g/min的速度 进行分子蒸馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为96％。

实施例2：

A、包埋法固定化酶法制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入油酸280g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，加入海藻酸钙包埋的LipPA9910g。搅拌，加热55℃，系统用 真空泵抽真空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷肼回收反应产生 的水。反应大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后，停止反应，过滤 除去固定化脂肪酶，用于下次使用，产品为淡黄色滤液，收率98％，1,3- 油酸甘油二酯的含量在97％左右。

B、棕榈酸酐化学转酯制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入正己烷300ml、三乙胺53g (0.503mol)和上面的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加棕 榈酸酐(0.5mol溶于100ml正己烷)的正己烷溶液，滴加完毕，保温反应 3h，慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停止反 应，过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系的pH 为中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体产品， OPO的含量在93％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，控制导 热油的温度，第一次蒸馏回收少量棕榈酸，然后升高加热油的温度进行分 子蒸馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为95％。

实施例3：

A、包埋法固定化酶法制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入油酸280g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，加入已重复使用20次的海藻酸钙包埋LipPA9910g。搅拌，加 热55℃，系统用真空泵抽真空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷 肼回收反应产生的水。反应大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后， 停止反应，过滤除去固定化脂肪酶，用于下次使用，产品为淡黄色滤液， 收率96％，1,3-油酸甘油二酯的含量在95％左右。

B、棕榈酸酐化学转酯制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入正己烷300ml、三乙胺53g (0.503mol)和上面的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加棕 榈酸酐(0.5mol溶于100ml正己烷)的正己烷溶液，滴加完毕，保温反应 3h，慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停止反 应，过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系的pH 为中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体产品， OPO的含量在91％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，控制导热 油的温度，第一次蒸馏回收少量棕榈酸，然后升高加热油的温度进行分子 蒸馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为93％。

实施例4：

A、共价交联固定化酶法制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入油酸280g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，用离子交换树脂吸附的脂肪酶LipPA9910g。搅拌，加热55℃， 系统用真空泵抽真空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷肼回收反 应产生的水。反应大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后，停止反应， 过滤除去脂肪酶，用于下次使用，产品为淡黄色滤液，收率97％，1,3-二 油酸甘油二酯的含量在95％左右。

B、棕榈酸化学转酯制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入二氯甲烷300ml、三乙胺53g (0.503mol)和上面的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加棕 榈酸(0.5mol溶于100ml石油醚中)的石油醚溶液，滴加完毕，保温反应 3h，慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停止反 应，过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系的pH 为中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体产品， OPO的含量在90％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，控制导 热油的温度，第一次蒸馏回收少量棕榈酸，然后升高加热油的温度进行分 子蒸馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为92％。

实施例5：

A、吸附法固定化脂肪酶制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入游离油酸282g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，多孔玻璃吸附的Lipolase Ultra脂肪酶10g。搅拌，加热55℃， 系统用真空泵抽真空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷肼回收反 应产生的水。反应大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后，停止反应， 过滤除去脂肪酶，用于下次使用，产品为淡黄色滤液，收率96％，1,3-油 酸二酯的含量在95％左右。

B、棕榈酸酐法制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入正己烷300ml、三乙胺53g (0.503mol)和上面的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加棕 榈酸酐(0.5mol溶于100ml正己烷)的正己烷溶液，滴加完毕，保温反应 3h，慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停止反 应，过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系的pH 为中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体产品， OPO的含量在90％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，控制导 热油的温度，第一次蒸馏回收棕榈酸，然后升高加热油的温度进行分子蒸 馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为91％。

实施例6：

A、Lipozyme RM IM酶法制备1,3-二油酸甘油二酯：

在一个500mL的三口烧瓶中，加入油酸280g(1mol)，甘油46g (0.5mol)，游离脂肪酶Lipozyme RM IM10g。搅拌，加热55℃，系统用 真空泵抽真空，维持体系在300～500Pa，真空泵前面用冷肼回收反应产生 的水。反应大约持续12h，检测，当油酸的含量<0.5％后，停止反应，过滤 除去脂肪酶，用于下次使用，产品为淡黄色滤液，收率78％，其中1,3-油 酸甘油二酯的含量在75％。

B、棕榈酸酰氯制备OPO：

在一个1000mL的三口烧瓶中，加入石油醚300ml、三乙胺53g (0.503mol)和上面的滤液，搅拌冷却至0℃，维持在此条件下，滴加棕 榈酸酰氯(0.5mol溶于100ml石油醚中)的石油醚溶液，滴加完毕，保温 反应3h，慢慢升至室温，继续反应10h，至二酯的转化率达到97％以上停 止反应，过滤除去生成的三乙胺盐酸盐，滤液用少量水洗涤数次，至体系 的pH为中性，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏回收溶剂至干，得到黄色的液体 产品，OPO的含量在75％左右。

C、产品的精制：

在一个小型的分子蒸馏设备中，工作时体系的真空度<40Pa，加热油 的温度控制在200℃左右，把上面的OPO粗品根据设备按一定进料的速度 进行分子蒸馏，收集产品为淡黄色的油状液体，OPO的含量为79％。