一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法

摘要

本发明涉及一株类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）fjfst-333，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCCM2013707，以及用该菌株发酵制备κ-卡拉胶酶的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐组成的发酵培养基，在优化后的培养条件下，κ-卡拉胶酶的活力达到67U/ml。发酵液通过硫酸铵盐析，离心收集沉淀，后进行透析，取透析液过离子交换柱及凝胶柱，冷冻干燥即可获得κ-卡拉胶酶干粉。

说明书

技术领域

   本发明属于生物化工领域，涉及一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法。 

背景技术

  卡拉胶是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架,交替连接而成的硫酸线性多糖,主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。根据其二糖单元上所含的硫酸基团的数量和内醚环的有无,可将卡拉胶分为κ-、ι-、γ-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉胶等类型,工业生产和使用的主要为κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶3种。 

  卡拉胶是一种海藻硫酸半乳匀多糖，通过化学或生物手段降解和修饰后，获得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多种生物活性如抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等，对人体的细胞免疫和体液免疫功能也具有显著的增强作用。研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，多糖分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖硫酸酷有可能成为新型海洋药物的重要来源。 

卡拉胶酶主要来源于假单胞菌Paenibacillus、噬纤维菌Cytophaga、弧菌Vibrio、别单胞菌Alteromonas等。目前利用卡拉胶制备半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依赖于化学法。由于化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等无法克服的缺点，而酶解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，从而为药源开发奠定了良好的基础。因此，通过从海藻物质或海洋生物中筛选可以产生卡拉胶酶的细菌成为了国内外的科技工作者的主要方向。 

用微生物法获得卡拉胶酶的研究已经有30余年的研究历史，但迄今为止，仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备卡拉胶酶的功能，包括Pseudomonas carrageenovora(MeLean M W et.Journal of Biotechnology,1979)、Cytophaga sp.lk一C783(Sarwar G et.Journal of Biotechnology,1987)、Delesseria sanguinea（Potin P et.Biotechnology and Bioengineering ,1991）、Pseudoalteromonas carrageenovora (Miehel G et.Journal of Fermentation and Bioengineering,1999)、Pseudoalteromonas porphyrae(刘光磊 et.海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表达，2012)等。因此筛选新的微生物菌种进行酶解法降解卡拉胶成为研究者的新任务。 

发明内容

  本发明的目的是提供一株能高效降解κ-卡拉胶的菌株并用其制备κ-卡拉胶酶的方法。 

  本发明的技术方案：一株筛选自角叉菜的细菌，可用于生产κ-卡拉胶降解酶，其命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC NO: M 2013707，保藏地址为武汉大学。 

  微生物菌株的筛选及鉴定： 

本发明从角叉菜进行卡拉胶降解菌的筛选。将角叉菜剪碎用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-333对其进行生理生化鉴定和16s rDNA序列分析，确定其为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），拟命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333。

  用所述的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333生产κ-卡拉胶酶的方法步骤如下： 

①　将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液；

②　用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液；

③　将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；

④　将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；

⑤　沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；

⑥　粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；

⑦　将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品。

⑧　将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集，4ml/管，分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。 

所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5，其中无机盐母液：NaNO₃ 20g、MgSO₄.7H₂O 5g、K₂HPO₄ 10g、CaC1₂  lg、蒸馏水1L。 

步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。 

用该方法生产的κ-卡拉胶酶的检测方法： 

取步骤③得到含有κ-卡拉胶酶的发酵液上清液1mL，加入20mL的卡拉胶底物（其中含有0.5%卡拉胶），置于32℃酶解1h，后加入1.0mLDNS，沸水浴5min。冷却至室温后，用蒸馏水补齐刻度，使用分光光度计在540nm下进行检测。1U定义为1min产生1ug卡拉胶寡糖的值。

  本发明的有益效果： 

①　新筛选出一株能高效生产κ-卡拉胶酶的菌株，分类命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333。

②　本发明以该菌作为菌种，以常见碳源，氮源，无机盐组成的发酵培养基，可以在48-60h内达到最大酶产量，酶活为67U/ml。 

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。 

   实施例1 

以角叉菜做样品进行κ-卡拉胶降解菌的筛选。将角叉菜剪碎用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得κ-卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-333。

  实施例2 

经形态学和生理生化特性研究，B-333菌株的特征如下：

菌落形态：菌落表面微隆起、呈乳黄色、粘连，边缘整齐。

    细胞形态：此为革兰氏染色阳性、阴性，形态为杆状，鞭毛。 

    生理生化特征：为兼性厌氧菌，氧化酶反应可变，V-P反应(乙酰甲基甲醇产生)可变， V-P液的pH 4～6，不产硫化氢。 

对该菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现其16S rRNA的基因部分片断长度为1539bp，经过NCBI和核糖体数据库进行比对，鉴定为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），拟命名为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333，菌株的16S rRNA序列具体可见序列表。 

   实施例3 

①　将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）fjfst-333接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h。发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5。

无机盐母液:NaNO₃ 20g、MgSO₄.7H₂O 5g、K₂HPO₄ 10g、CaC1₂ lg、蒸馏水1L。 

②　用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液。于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液并测其酶活。所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。 

该实施例所得的琼胶酶的活力为67U/mL。 

实施例4 

①.      将类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）fjfst-333接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5。

  无机盐母液:NaNO₃ 20g、MgSO₄.7H₂O 5g、K₂HPO₄ 10g、CaC1₂  lg、蒸馏水1L。 

②.      用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液，所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。 

③.      将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液。 

④.      将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，10000g离心40min取沉淀； 

⑤.      沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；

⑥.      粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；

⑦.  将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；

⑧. 将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集（4ml/管），分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。

  

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法

 

<130>  1

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1539

<212>  DNA

<213>  16s rDNA序列

 

<400>  1

cagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag     60

 

cggagttatt ccttcgggga tagcttagcg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct    120

 

gcctgtaaga ctgggataac attcggaaac gaatgctaat accggatacg cgaattggtc    180

 

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