一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器,及其制备方法,用途以及检测方法

摘要

本发明涉及一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，及其制备方法，用途以及检测方法，以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，此DNA-Ag NCs具有光稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜在应用价值。通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种DNA-Ag NCs适体传感器的制备方法及对 PDGF-BB的检测。

背景技术

近年来，应用于临床诊断相关的蛋白质组学越来越重要，因此发展生物传感器用于检测 与癌症相关的蛋白质十分有必要。血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)与多种疾病密切相关，如 动脉硬化、纤维病，并且作为肿瘤血管发生指示剂在人类恶性肿瘤细胞中过度表达。因此开 发高选择性、高灵敏性、低耗及无标记的生物传感器用于检测PDGF-BB至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，及其制备方 法，用途以及检测方法，应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以DNA为模板，利用化学还原 法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的 双链DNA，利用富G碱基的DNA在血晶素(hemin)和K⁺存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧 光DNA-Ag NCs发生猝灭，制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB 高灵敏、高选择性的检测。

具体技术方案如下：

一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)DNA探针加热一定时间后自然冷却并培养一段时间；

(2)DNA溶液加入AgNO₃后振荡；

(3)黑暗中放置一段时间；

(4)溶液中加入NaBH₄，振荡，黑暗中放置；

(5)得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

进一步地，步骤(1)中，10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养 50分钟。

进一步地，步骤(2)中DNA溶液加入AgNO₃后剧烈振荡30秒，步骤(3)中黑暗中放置20 分钟。

进一步地，步骤(4)中溶液中加入NaBH₄，剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1-2小时。

一种基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器，采用上述的方法制备得到。

上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器的用途，用于无标记检测血小板源生 长因子-BB(PDGF-BB)。

上述基于DNA-银纳米簇(DNA-Ag NCs)适体传感器无标记检测PDGF-BB的方法，包括如 下步骤：

a、Apt-G4探针加热数分钟后自然冷却培养一段时间；

b、步骤a得到溶液加入一定浓度AgNO₃并振荡；

c、步骤b得到溶液黑暗中放置一段时间后加入一定浓度NaBH₄并振荡；

d、步骤c中溶液加入不同浓度的PDGF-BB，血晶素(hemin)及K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培 养数小时。

步骤a中，10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间； 步骤b中，加入一定浓度AgNO₃并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓度 NaBH₄并剧烈振荡。

步骤d中，溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin) 及50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

进一步地，步骤a中，10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50 min；和/或，步骤b中，溶液加入20μL170μM AgNO₃并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min 后加入20μL170μM NaBH₄并剧烈振荡30s；和/或，步骤d中，溶液黑暗中放置50min后加 入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。

与目前现有技术相比，本发明制备DNA-Ag NCs方法与已有技术相比，具有重现性高， 耗能低，制备时间短且易控制等优点。以此无标记的适体传感器检测PDGF-BB，线性范围 宽，检测限低，且本传感器选择性佳，灵敏度高。

附图说明

图1为基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB示意图；

图2为合成的DNA-Ag NCs的SEM图；

图3(A)中,aDNA-Ag NCs紫外吸收光谱；b存在PDGF-BB及hemin时紫外吸收光谱；

图3(B)DNA-Ag NCs激发a及发射光谱b-e；

图3(C)中a为DNA-Ag NCs荧光寿命；b为存在PDGF-BB及hemin时荧光寿命；

图3(D)DNA-Ag NCs在PDGF-BB及hemin存在时的循环伏安图；

图4(A)不同浓度PDGF-BB对应荧光光谱；

图4(B)荧光强度与不同PDGF-BB浓度对数间线性关系；

图5为基于DNA-Ag NCs适体传感器的选择性考察；

图6为基于DNA-Ag NCs适体传感器的重复性考察。

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

针对现有技术以检测PDGF-BB的不足(需标记信号分子、特异性不足)，本实施例提供 一种无标记的DNA-Ag NCs生物传感器的制备及其应用于PDGF-BB蛋白质的检测。本发明以 DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，得到的DNA-Ag NCs可用于 适体传感器的构建，实现对PDGF-BB高选择性，高灵敏性的检测。

实施例一：

一种基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB，步骤如下：

a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10min后自然冷却到室温培养50min。

b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO₃并剧烈振荡30s，黑暗中放置20min后加入20μL170 μM NaBH₄并剧烈振荡30s。

c、(b)中溶液黑暗中放置50min后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM hemin及50mM K⁺， 此混合溶液于黑暗中继续培养2.0h。

DNA-Ag NCs的制备：10μM DNA探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。 然后此DNA溶液加入AgNO₃后剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟。随后在此溶液中加入NaBH₄， 剧烈振荡30秒，黑暗中至少放置1小时，得到具有荧光的DNA-Ag NCs。

实施例二：

基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

a、10μM Apt-G4探针于88℃加热10分钟后自然冷却到室温培养50分钟。

b、(a)中溶液加入20μL170μM AgNO₃并剧烈振荡30秒，黑暗中放置20分钟后加入20μL170 μM NaBH₄并剧烈振荡30秒。

c、(b)中溶液黑暗中放置50分钟后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及 50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养2.0小时。

实施例三：

一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟 后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶液加入AgNO₃后剧烈振荡一段时间，黑暗中 放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH₄，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有 荧光性的DNA-Ag NCs。

基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO₃并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定浓 度NaBH₄并剧烈振荡。

c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

实施例四：

以DNA为模板，利用化学还原法制得了具有荧光性质的DNA-Ag NCs，此DNA-Ag NCs具有光 稳定性佳，光强高，无细胞毒性等优点，因此将此传感器应用于蛋白质的检测具有很好的潜 在应用价值。通过PDGF-BB及其适配体之间的特异性结合打开杂交的双链DNA，利用富G碱基的 DNA在血晶素(hemin)和K⁺存在时形成的DNA模拟酶(DNAzyme)使得荧光DNA-Ag NCs发生猝灭， 制备了基于DNA-Ag NCs的适体传感器，此传感器实现了对PDGF-BB高灵敏、高选择性的检测。

一种荧光性DNA-Ag NCs的制备方法，步骤包括：

10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。然后于此DNA溶 液加入AgNO₃后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶液中加入NaBH₄，剧烈 振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO₃并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定 浓度NaBH₄并剧烈振荡。

c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及 50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

实施例五：

一种荧光性DNA-Ag NCs，以DNA为模板，利用化学还原法制得。一种荧光性DNA-Ag NCs 的制备方法，步骤包括：10μM DNA探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段 时间。然后于此DNA溶液加入AgNO₃后剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间。随后在此溶 液中加入NaBH₄，剧烈振荡，黑暗中至少放置1-2小时，得到具有荧光性的DNA-Ag NCs。

基于DNA-Ag NCs适体传感器无标记检测PDGF-BB步骤如下：

a、10μM Apt-G4探针于80-90℃加热数分钟后自然冷却到室温培养一段时间。

b、(a)中溶液加入一定浓度AgNO₃并剧烈振荡一段时间，黑暗中放置一段时间后加入一定 浓度NaBH₄并剧烈振荡。

c、(b)中溶液黑暗中放置一段时间后加入不同浓度的PDGF-BB，1.0μM血晶素(hemin)及 50mM K⁺，此混合溶液于黑暗中继续培养数小时。

所制得的DNA-Ag NCs的形貌如图2所示，Ag纳米粒子均匀，分散。

取200μL DNA-Ag NCs溶液于石英比色皿中，检测波长段450nm-750nm间吸收峰，所得 吸收光谱如图3A所示。取200μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其580nm激发处的 发射光谱，所得光谱如图3B所示。取500μL DNA-Ag NCs溶液于荧光比色皿中，检测其荧光寿 命，所得荧光寿命图如图3C所示，从图中可以看出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs的 荧光寿命减小，发生了电子的转移。取50mM磷酸盐缓冲溶液作为电解质溶液放入电解槽中， 将制备的DNA-Ag NCs滴于工作电极上，检测其循环伏安曲线，从得到的CV图(图3D)可以看 出，存在PDGF-BB及hemin时，DNA-Ag NCs发生了电子的转移。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制， 只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合 的，均在本发明的保护范围之内。