一种以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶点的双通道抑制剂

摘要

本发明公开了一种以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶点的双通道抑制剂，化学名称为1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐，具有结构式(Ⅰ)的化合物：，还公开了该化合物的制备方法和在抗肿瘤药物制备中的应用。本发明的双通道抑制剂具有以下优势：1)提高效价并降低耐药的发生概率；2)降低毒性，改善病人依从性。因此，双通道抑制剂的设计和开发可以为癌症研究团体提供一个新的化学工具，并可能开发为一个新的抗癌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶点的双通道抑制剂,具体地，本发明提 供了1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐及其制备方法，可用作 以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为双靶点的双通道抑制剂，可用于治疗癌症，属于医药化学技术 领域

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，浸润与转移是其基本特征之一，也是临床治 疗失败致病人死亡的主要原因。目前，临床缺乏有效的抗肿瘤转移药物。而已有药物多数对 肿瘤选择性差，疗效低，毒副作用大等。研究有效抗癌与抗转移药物已经成为肿瘤化疗中亟 待解决的问题，对肿瘤转移的信号转导研究及基于靶点为基础的化学小分子化合物设计是解 决这些问题的有效途径之一。

信号传导通路特异性表达可以促进癌细胞的生存和生长，如Raf/MEK/ERK(细胞外信号 调节激酶)和PI3K(磷脂酰肌醇(-3)激酶)/Akt级联反应。Raf/MEK/ERK通路是进化保守的 丝裂原活化蛋白激酶通路的一种，在促进细胞增殖和抑制凋亡的过程中发挥重要作用。在被 生长因子，血清，细胞活素及渗透应力激活之后，ERK可以磷酸化并调节许多底物，如细胞 骨架蛋白，激酶和转录因子等。这些反应终会改变基因的表达和细胞的增殖，分化，存活过 程。Roberts,P.J.等研究表明，该通路在不同水平的异常激活与许多人类肿瘤的生成密切 相关，尤其是黑素瘤，乳腺癌，卵巢癌和白血病(Oncogene2007,26,3291-3310)。而PI3K/Akt 信号通路在癌症的发展过程中发挥重要作用。相对于癌症发展过程中的其他通路，PI3K/Akt 通路中更常见的形式为基因畸变，该通路信号可通过凋亡前体和凋亡因子，mTOR，GSK-3(糖 原合成激酶-3)，p53等一些下游效应器调节细胞的许多基础功能如细胞生长，增殖，存活， 凋亡，代谢等。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)是PI3K/Akt 的负性调节因子，通过将PIP3脱磷酸化而发挥作用。Paz-Ares,L.等研究证实，PTEN可通 过遗传或者后天修饰而在人类原发性或转移肿瘤中失去其活性(Clin.Transl.Oncol. 2009,11,572-579)，在人类许多癌症中均可检测到PI3K和Akt的变异和/或激活。

值得注意的是，这两个信号通路可相互协同作用来调节细胞凋亡和变异细胞的存活。这 两个信号通路均可磷酸化和调节许多共同的下游效应器包括调节细胞存活和凋亡的因子，如 CREB，Bad，Bim和caspase9等。越来越多的证据表明这两个途径之间的作用可相互干扰并且 存在一个反馈调节机制，Carracedo,A.等研究证实，在转移癌病人及癌细胞系和前列腺癌动 物模型中，mTOR抑制剂的应用会激活Raf/MEK/ERK途径，这一现象即暗示了在Raf/MEK/ERK和 PI3K/Akt之间存在反馈调节机制(J.Clin.Invest.2008,118,3065-3074)。然而，这一机 制的存在可能会导致对以某一单一途径为靶点的药物的耐药性。在人前列腺癌晚期患者中 Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt的频繁激活也证实了这一结论。更重要的是，体内和体外实验都表明 这两个途径的相伴中断可以协同激活癌细胞的凋亡，提示人们可以同时以这两条途径为靶点 进行临床药物治疗的研究。然而，据我们所知，目前所有的组合靶疗法都是应用分别以 Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶点的抑制剂的联合用药，而联合用药会使药物的用量增加,对人 体的毒性增大,并提高了耐药的发生概率。但尚未发现可以同时抑制此两条途径的单体小分子 物质。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶 点的双通道抑制剂，化学名称为1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐 酸盐，该双通道抑制剂提高了效价并降低了耐药的发生概率，降低了毒性，改善了病人依从 性。

本发明的另一目的是提供该双通道抑制剂的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种以Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt为靶点的双通道抑制剂，化学名称为1-(2-氨基)乙基 -3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐，具有结构式(Ⅰ)的化合物：

所述双通道抑制剂的制备方法，包括以下反应步骤：

1)N-苯基乙二胺(2)的合成:

以甲苯为溶剂，2-溴乙胺氢溴酸盐和苯胺(1)加热回流14-18h，冷却，经萃取、洗涤、 纯化，得到化合物(2)N-苯基乙二胺；2-溴乙胺氢溴酸盐和苯胺(1)的摩尔比为1：(1.5～ 2.5)；

2)N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)的合成:

以甲醇为溶剂，将步骤1)制得的N-苯基乙二胺(2)和二叔丁基碳酸酯混合，反应3-5h， 得到化合物(3)N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺；N-苯基乙二胺(2)和二叔丁基碳酸酯的摩 尔比为1：(1～1.5)；

3)N-(2-(N’-氯乙酰基)苯氨基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(4)的合成：

将步骤2)制得的N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)溶于二氯甲烷，加入三乙胺并冷 却至0oC，搅拌下滴加入氯乙酰氯，反应2-4h，将反应液倒入乙酸乙酯中，洗涤，干燥，得 到化合物(4)；N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)、三乙胺、氯乙酰氯的摩尔比为(1～1.5)： (1～1.5)：1；

4)N-(2-氧代吲哚-1-基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(5)的合成：

在氮气保护下，向醋酸钯、2-(二叔丁基膦基)联苯、步骤3)制得的化合物(4)中，加 入无水三乙胺和无水甲苯，70-90oC反应14-18h，冷却，用乙酸乙酯稀释，过滤，浓缩，纯 化，得到化合物(5)N-(2-氧代吲哚-1-基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯；醋酸钯、2-(二叔丁基膦 基)联苯、化合物(4)、无水三乙胺、无水甲苯的摩尔比为2:1:(1～2)：(2～4):(1～3)；

5)5-(4-甲氧基)苯基亚甲基-2,2-二甲基-1,3-二噁唑烷-4,6-二酮(7)的合成：

以乙醇为溶剂，对甲氧基苯甲醛(6)、丙二酸环(亚)异丙酯(麦氏酸)、哌啶混合，室温 下搅拌反应过夜，过滤，洗涤，得到化合物(7)；对甲氧基苯甲醛(6)、丙二酸环(亚)异丙酯 (麦氏酸)的摩尔比为(1～1.5)：(1～1.5)；

6)1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐的合成：

以二氯甲烷为溶剂，加入化合物(7)，在酸的存在下，于0oC滴加硼氢化钠，反应得到 化合物(8)；化合物(7)与硼氢化钠的摩尔比为1:(3～4)；

以四氢呋喃为溶剂，加入化合物(8)、苯基硅烷、三乙胺，反应15-30min，洗涤，纯化， 得化合物(9)；化合物(8)、苯基硅烷、三乙胺的摩尔比为1：(2～4)：(1.5～3)；

将化合物(9)和哌啶加入到化合物(5)的乙醇悬浮液中，加热至70-90oC反应1-2h，将反 应液冷却至室温，过滤得化合物(10)；化合物(9)、哌啶、化合物(5)的摩尔比为(1～2)： (0.2～0.4)：1；

将Boc保护的化合物(10)溶于乙酸乙酯，然后加入二氧六环-HCl，反应1-3h，出现悬 浮物，过滤，洗涤，即得；化合物(10)与二氧六环-HCl的摩尔比为(1～2):(1～2)。

所述步骤(1)中，萃取、洗涤、纯化的操作，具体为：加入水以及50％的KOH水溶液， 静置分层；用饱和NaCl洗涤水相并用二氯甲烷萃取数次；合并有机相后用饱和NaCl洗涤， 无水Na₂SO₄干燥，过滤后蒸干，柱层析法进行纯化。

所述步骤(3)中，氯乙酰氯的加入方式为：先滴加氯乙酰氯加入量的80％，反应1.5-3 小时后，再滴加剩余20％的氯乙酰氯，反应30-60分钟。

所述步骤(4)中，过滤、浓缩、纯化的具体操作为：采用硅藻土过滤，滤液旋干浓缩， 得产物粗品，粗品经硅胶色谱进行纯化。

所述步骤(6)中，化合物(8)的制备所用的酸为冰醋酸。

合成路线如下：

本发明的双通道抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

相对于单通道抑制剂，本发明的双通道抑制剂具有以下优势：1)提高了效价并降低了耐 药的发生概率；2)降低了抗肿瘤药物的毒性，改善病人依从性。因此，双通道抑制剂的设计 和开发可以为癌症研究团体提供一个新的化学工具，并可能开发为一个新的抗癌剂。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。

实施例1

1).N-苯基乙二胺(2)的合成:

将2-溴乙胺氢溴酸盐(0.1mmol)和苯胺(1)(0.2mmol)加到40ml的甲苯中加热回流16 个小时，冷却。加入60ml水以及20ml50％的KOH水溶液，静置分层。用饱和NaCl洗涤水相 并用二氯甲烷萃取三次。合并有机相后用饱和NaCl洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤后蒸干。柱 层析法得到纯品化合物(2)，收率60％。¹H(400MHz,MeOH):δ7.10-7.08(t,J＝3.4Hz,2H), 6.67-6.60(m,3H),3.23-3.20(t,J＝6.08Hz,2H),2.90-2.87(t,J＝6.24Hz,2H)。

2).N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)的合成:

将N-苯基乙二胺(2)(1.0mmol)和二叔丁基碳酸酯(1.2mmol)溶于15ml甲醇中，搅拌反应 4小时，减压浓缩得棕色油。柱层析得到纯品白色固体化合物(3)，收率92％。¹H NMR(400MHz, CDCl₃):δ7.25-7.18(m,2H),6.81-6.6(m,2H),3.38-3.36(d,J＝7.6Hz,2H),3.27-3.23(t,J＝8.0Hz, 2H),1.48(s,9H)。

3).N-(2-(N’-氯乙酰基)苯氨基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(4)的合成：

将化合物(3)(1.2mmol)溶于40ml二氯甲烷中，加入三乙胺(1.2mmol)并冷却至0oC，搅拌 下滴加入氯乙酰氯(0.8mmol)。反应3小时后，继续滴加氯乙酰氯(0.2mmol)，反应30分钟后， 将反应液倒入20ml乙酸乙酯中，依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤。 用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩得到棕色油状化合物(4)，收率48％。¹H NMR(400MHz, CDCl₃):δ7.48-7.41(m,3H),7.28-7.27(d,J＝6.6Hz,2H),3.87-3.83(m,4H),3.35-3.34(d,J＝5.44 Hz,2H),1.4165(s,9H)。

4).N-(2-氧代吲哚-1-基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(5)的合成:

烘箱干燥后的双颈瓶，冷却至室温、配电磁搅拌，加入醋酸钯(1.0mmol)、2-(二叔丁基 膦基)联苯(0.5mmol)和化合物(4)(1.0mmol)。持续通氮气，将装置内气体排空，氮气保护下 分别加入无水三乙胺(1.5mmol)及无水甲苯(1.0ml)。将双颈瓶置于预热到80oC的油浴中。反 应16小时后，停止加热、冷却至室温，加乙酸乙酯(10ml)稀释。将混合物经硅藻土过滤、滤 液旋干浓缩，得产物粗品。粗品经硅胶色谱纯化得到化合物(5),收率65％。¹H NMR(400MHz, CDCl₃):δ7.28-7.21(m,2H),7.04-7.00(t,J＝7.5Hz,1H),6.96-6.93(d,7.8Hz,1H),4.14-4.07(d,J＝ 7.2Hz,2H),3.86-3.82(t,J＝8.0Hz,2H),3.39-3.35(q,J＝5.7Hz,2H),1.40(s,9H)。

5).5-(4-甲氧基)苯基亚甲基-2,2-二甲基-1,3-二噁唑烷-4,6-二酮(7)的合成：

将对甲氧基苯甲醛(6)(1.1mmol)溶于20ml乙醇中，加入丙二酸环(亚)异丙酯(麦氏酸) (1.2mmol)及5滴哌啶。将反应液于室温下搅拌过夜。反应混合物减压抽滤，并用乙醇和甲 醇洗涤得到纯品(7)。收率51％。¹H NMR(300MHz,CDCl3):8.38(s,1H),8.24-8.21(d,J＝9.3Hz, 2H),6.99-6.97(d,J＝9.3Hz,2H),3.91(s,3H),1.79(s,6H)。

6).1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐的合成：

将化合物(7)(1mmol)溶于30ml二氯甲烷中，加入4ml冰醋酸，于0oC加硼氢化钠(3.2 mmol)。反应1小时后，将反应液加入20ml二氯甲烷中，然后用盐水洗涤。将有机相用无水 Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂得化合物(8)；

将化合物(8)(1mmol)溶于四氢呋喃中，分别加入苯基硅烷(3mmol)，三乙胺(2mmol)。 将反应液于室温下搅拌15分钟，然后向反应液中加入10ml水，搅拌15min；反应液加入乙 醚(50ml)，并用水(2×50ml)、盐水(50ml)洗涤，分出有机相，用盐水洗涤，然后经快速柱 色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化得无色油状物(9)；

将化合物(9)(1.5mmol)和哌啶(0.3mmol)加入到化合物(5)(1mmol)的乙醇(15ml)悬浮液 中。加热至80oC反应1.5小时，将反应液冷却至室温，过滤得沉淀，即为化合物(10)；

将Boc保护的化合物(10)(1mmol)溶于乙酸乙酯(3mL)，然后加入二氧六环-HCl(1mmol)， 搅拌下反应2小时。出现悬浮物，过滤并用乙酸乙酯和乙醚洗涤，得到1-(2-氨基)乙基 -3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐,代号为LD12，收率38％。

¹H NMR(400MHz,DMSO):δ8.14(s,1H),7.65-7.64(d,J＝7.48,1H),7.35-7.31(t,J＝7.72,1H), 7.24-7.20(t,J＝8.48,3H),7.10-7.06(t,J＝7.60,1H),6.89-6.85(m,3H),4.00-3.96(t,J＝6.52,2H), 3.01-2.95(m,4H),2.88-2.85(t,J＝6.92,2H),2.51-2.49(m,3H)；

¹³C NMR(100MHz,DMSO):167.0,157.7,142.1,141.9,140.9,140.6,132.6,129.3,129.2,129.1, 128.7,127.2,123.5,122.2,121.8,121.6,119.4,113.8,108.7,108.4,55.0,37.0,36.8,36.8,36.6, 33.4,32.8,30.4,30.4,29.3。

实施例2

1).N-苯基乙二胺(2)的合成:

将2-溴乙胺氢溴酸盐(0.1mmol)和苯胺(1)(0.25mmol)加到40ml的甲苯中加热回流 18个小时，冷却。加入60ml水以及20ml50％的KOH水溶液，静置分层。用饱和NaCl洗涤水 相并用二氯甲烷萃取三次。合并有机相后用饱和NaCl洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤后蒸干。 柱层析法得到纯品化合物(2)，收率62％。

2).N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)的合成:

将N-苯基乙二胺(2)(1.0mmol)和二叔丁基碳酸酯(1.5mmol)溶于15ml甲醇中，搅拌反应 5小时，减压浓缩得棕色油。柱层析得到纯品白色固体化合物(3)，收率90％。

3).N-(2-(N’-氯乙酰基)苯氨基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(4)的合成：

将化合物(3)(1.5mmol)溶于40ml二氯甲烷中，加入三乙胺(1.0mmol)并冷却至0oC，搅拌 下滴加入氯乙酰氯(0.8mmol)。反应1.5小时后，继续滴加氯乙酰氯(0.2mmol)，反应60分钟 后，将反应液倒入20ml乙酸乙酯中，依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液、盐水 洗涤。用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩得到棕色油状化合物(4)，收率46％。

4).N-(2-氧代吲哚-1-基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(5)的合成:

烘箱干燥后的双颈瓶，冷却至室温、配电磁搅拌，加入醋酸钯(1.0mmol)、2-(二叔丁基 膦基)联苯(0.5mmol)和化合物(4)(1.0mmol)。持续通氮气，将装置内气体排空，氮气保护下 分别加入无水三乙胺(1.5mmol)及无水甲苯(1.0ml)。将双颈瓶置于预热到90oC的油浴中。反 应14小时后，停止加热、冷却至室温，加乙酸乙酯(10ml)稀释。将混合物经硅藻土过滤、滤 液旋干浓缩，得产物粗品。粗品经硅胶色谱纯化得到化合物(5),收率62％。

5).5-(4-甲氧基)苯基亚甲基-2,2-二甲基-1,3-二噁唑烷-4,6-二酮(7)的合成：

将对甲氧基苯甲醛(6)(1.5mmol)溶于20ml乙醇中，加入丙二酸环(亚)异丙酯(麦氏酸) (1.0mmol)及5滴哌啶。将反应液于室温下搅拌过夜。反应混合物减压抽滤，并用乙醇和甲 醇洗涤得到纯品(7)。收率53％。

6).1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐的合成：

将化合物(7)(1mmol)溶于30ml二氯甲烷中，加入4ml冰醋酸，于0oC加硼氢化钠(4.0 mmol)。反应1小时后，将反应液加入20ml二氯甲烷中，然后用盐水洗涤。将有机相用无水 Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂得化合物(8)；

将化合物(8)(1mmol)溶于四氢呋喃中，分别加入苯基硅烷(4mmol)，三乙胺(3mmol)。 将反应液于室温下搅拌15分钟，然后向反应液中加入10ml水，搅拌15min；反应液加入乙 醚(50ml)，并用水(2×50ml)、盐水(50ml)洗涤，分出有机相，用盐水洗涤，然后经快速柱 色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化得无色油状物(9)；

将化合物(9)(1.0mmol)和哌啶(0.2mmol)加入到化合物(5)(1mmol)的乙醇(15ml)悬浮液 中。加热至70oC反应2.0小时，将反应液冷却至室温，过滤得沉淀，即为化合物(10)；

将Boc保护的化合物(10)(1mmol)溶于乙酸乙酯(3mL)，然后加入二氧六环-HCl(1mmol)， 搅拌下反应2小时。出现悬浮物，过滤并用乙酸乙酯和乙醚洗涤，得到1-(2-氨基)乙基 -3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐,收率35％。

实施例3

1).N-苯基乙二胺(2)的合成:

将2-溴乙胺氢溴酸盐(0.1mmol)和苯胺(1)(0.15mmol)加到40ml的甲苯中加热回流 14个小时，冷却。加入60ml水以及20ml50％的KOH水溶液，静置分层。用饱和NaCl洗涤水 相并用二氯甲烷萃取三次。合并有机相后用饱和NaCl洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤后蒸干。 柱层析法得到纯品化合物(2)，收率58％。

2).N-叔丁氧羰基-N’-苯基乙二胺(3)的合成:

将N-苯基乙二胺(2)(1.0mmol)和二叔丁基碳酸酯(1.0mmol)溶于15ml甲醇中，搅拌反应 3小时，减压浓缩得棕色油。柱层析得到纯品白色固体化合物(3)，收率86％。

3).N-(2-(N’-氯乙酰基)苯氨基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(4)的合成：

将化合物(3)(1.0mmol)溶于40ml二氯甲烷中，加入三乙胺(1.5mmol)并冷却至0oC，搅拌 下滴加入氯乙酰氯(0.8mmol)。反应2小时后，继续滴加氯乙酰氯(0.2mmol)，反应45分钟后， 将反应液倒入20ml乙酸乙酯中，依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤。 用无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩得到棕色油状化合物(4)，收率44％。

4).N-(2-氧代吲哚-1-基)乙基氨基甲酸叔丁醇酯(5)的合成:

烘箱干燥后的双颈瓶，冷却至室温、配电磁搅拌，加入醋酸钯(1.0mmol)、2-(二叔丁基 膦基)联苯(0.5mmol)和化合物(4)(1.0mmol)。持续通氮气，将装置内气体排空，氮气保护下 分别加入无水三乙胺(1.5mmol)及无水甲苯(1.0ml)。将双颈瓶置于预热到70oC的油浴中。反 应18小时后，停止加热、冷却至室温，加乙酸乙酯(10ml)稀释。将混合物经硅藻土过滤、滤 液旋干浓缩，得产物粗品。粗品经硅胶色谱纯化得到化合物(5),收率59％。

5).5-(4-甲氧基)苯基亚甲基-2,2-二甲基-1,3-二噁唑烷-4,6-二酮(7)的合成：

将对甲氧基苯甲醛(6)(1.0mmol)溶于20ml乙醇中，加入丙二酸环(亚)异丙酯(麦氏酸) (1.5mmol)及5滴哌啶。将反应液于室温下搅拌过夜。反应混合物减压抽滤，并用乙醇和甲 醇洗涤得到纯品(7)。收率48％。

6).1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4-甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐的合成：

将化合物(7)(1mmol)溶于30ml二氯甲烷中，加入4ml冰醋酸，于0oC加硼氢化钠(4.0 mmol)。反应1小时后，将反应液加入20ml二氯甲烷中，然后用盐水洗涤。将有机相用无水 Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂得化合物(8)；

将化合物(8)(1mmol)溶于四氢呋喃中，分别加入苯基硅烷(3mmol)，三乙胺(1.5mmol)。 将反应液于室温下搅拌15分钟，然后向反应液中加入10ml水，搅拌15min；反应液加入乙 醚(50ml)，并用水(2×50ml)、盐水(50ml)洗涤，分出有机相，用盐水洗涤，然后经快速柱 色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化得无色油状物(9)；

将化合物(9)(2.0mmol)和哌啶(0.4mmol)加入到化合物(5)(1mmol)的乙醇(15ml)悬浮液 中。加热至90oC反应1.0小时，将反应液冷却至室温，过滤得沉淀，即为化合物(10)；

将Boc保护的化合物(10)(1mmol)溶于乙酸乙酯(3mL)，然后加入二氧六环-HCl(1mmol)，搅 拌下反应2小时。出现悬浮物，过滤并用乙酸乙酯和乙醚洗涤，得到1-(2-氨基)乙基-3-(3-(4- 甲氧基)苯基)丙烯基吲哚-2-酮盐酸盐,收率33％。

实施例4

对癌细胞增殖的抑制作用实验：

(1)实验方法：将细胞按5×104(U937)/孔或1×104(PC-3,DU145,M12,HT29)/孔接 种于96孔板，加入不同浓度的本发明实施例1制备的LD12，37℃(5％CO2)培养24小时后， 每孔加入20μL CellTiterAqueous One Solution Reagent(Promega,Madison,WI)。 一小时后，用酶标仪测量490nm处的吸收来测定细胞活力。

(2)实验结果：LD12对不同种类的癌细胞的半抑制浓度见表1，

表1.LD12对癌细胞增殖的抑制作用*

^*表示细胞用不同浓度的待测化合物处理24h，然后用MTT法测量细胞活力及计算IC50。

结果表明，化合物LD12对多种癌细胞的增殖具有抑制作用，其IC50在个位数μmol浓 度水平，但对HT29细胞敏感性稍低。

实施例5

体外激酶选择性筛选筛选实验：

(1)实验方法：通过测定不同激酶活性，将本发明实施例1制备的LD12在10μM浓度 下对一组激酶进行了筛选。

(2)实验结果：LD12对不同种类的激酶的抑制率见表2；

表2.LD12的体外激酶选择性筛选结果

激酶 抑制率(％) 激酶 抑制率(％) ABL 6 LCK 4 AKT1 3 LYN 0 AKT2 8 MAPKAPK2 3 AMPK 76 MARK1 0 AurA -4 MEK1 69 BTK 12 MEK2 27 CAMK2 60 MET -1 CAMk4 71 MSK1 6 CDK2 -2 MST2 -3 CHK1 11 p38a -13 CHK2 8 p70S6K 5 Ck1d -5 PAK2 10 c-Raf -1 PDK1 -2 c-TAK1 6 PI3Ka 45 DYRK1a -5 PIM2 38 Erk1 21 PKA -3 Erk2 11 PKCb2 16 FGFR1 3 PKCz -8 FLT3 38 PKD2 0 FYN 0 PKGa -2 GSK3b 0 PRAK 4 HGK -1 ROCK2 -1 IGF1R -1 RSK1 2 INSR -2 SGK1 14 IRAK4 -1 SRC 2 KDR -28 SYK 9

由结果可见，在此浓度下LD12可明显抑制MEK1,CAMK2,CAMK4和AMPK。同时，LD12还 可适度的抑制PI3Ka。在基础细胞研究中发现，LD12抑制PI3K的下游底物Akt的磷酸化，但 该抑制活性低于对p-MEK和p-ERK的抑制活性。总之，这些结果可确切的证明LD12能同时抑 制癌症发展过程中的多重信号通路，显示LD12及其衍生物具有多通道抑制活性，可作为新型 抗癌剂进行开发研究。