来源于强烈火焰菌的小热激蛋白HSP基因、表达载体及其构建和应用

摘要

本发明涉及一种来源于强烈火焰菌的小热激蛋白HSP基因、表达载体及其构建和应用。所述基因的碱基序列如SEQ ID No1所示，通过构建包含该基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，经试验表明，该HSP基因能够在梭菌中稳定高效表达，有效提高了梭菌对丁醇的耐受性。同时，利用厌氧发酵，还表明该HSP基因能够大幅度提高梭菌的产丁醇能力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于强烈火焰菌（Pyrococcus furiosus）的小热激蛋白HSP基因、包含该基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建方法，以及它们在提高梭菌的丁醇耐受性和梭菌丁醇产量中的应用。

背景技术

上世纪70年代的石油危机，促使人们重新认识到丙酮-丁醇发酵工业的重要性，开发利用可再生能源由此成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。目前市场上的生物燃料以燃料乙醇和生物柴油最为常见。生物丁醇作为一种重要的化工原料，是一种极具潜力的第二代新型生物燃料（Durre2007，Biotechnol J），丁醇比乙醇作为生物燃料具有如下众多优势：1）能量含量高，与乙醇相比可多走30%的路程；2）丁醇的挥发性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，与汽油混合对水的宽容度大，对潮湿和低水蒸气压力有更好的适应能力；3）丁醇可在现有燃料供应和分销系统中使用，而乙醇则需要通过铁路、船舶或货车运输；4）与其他生物燃料相比，腐蚀性较小，比乙醇、汽油安全；5）与现有的生物燃料相比，生物丁醇与汽油的混合比更高，无需对车辆进行改造，就可以使用几乎100%浓度的丁醇，而且混合燃料的经济性更高；6）丁醇可以通过不消耗粮食、不占用耕地、不增加环境压力为前提下进行发酵生产。如果丁醇占生物燃料市场的20%，全球市场将超过200亿美元。

2006年，美国杜邦（Dupont）公司和英国石油（BP）公司联合宣布建立合作伙伴关系，共同开发生产并向市场推出新一代生物燃料--生物丁醇，以满足全球日益增长的燃料需求。BP公司从2008年开始利用丙酮-丁醇发酵梭菌进行商业生产，目标是在2010年利用进一步改进的方法生产丁醇。美国农业部农业研究所（USDA-ARS）2004年立项利用拜氏梭菌转化纤维素生物质生产生物丁醇，2009年完成。美国绿色生物有限公司（GBL）和专业级公司EKB公司合作，投资85.5万欧元创新丁醇发酵工艺技术，计划开发生产生物燃料丁醇用于交通运输，将其生产成本降低。

早期的丁醇发酵工业因其成本高，不敌于石油化工产品而衰落，这也是当今限制其大规模发展的瓶颈所在。造成丁醇发酵成本高的主要原因是传统丁醇发酵产量、产率低，以及丁醇对菌体的毒害作用。因此，目前世界各国正在投入大量资金和技术用于提高丁醇发酵生产的产量和产率，以降低丁醇规模化生产的成本。

大多数微生物通过3种途径来应对有毒物质胁迫，第一种方法是通过改变细胞膜的组份来缓解有毒物质的伤害；第二种方法为泵出有毒物质，一旦前两种失效，细菌还可以在细胞内直接降解有毒物质。细菌在长期进化过程中，发展了一套针对有毒物质的应答系统，一旦接触有毒物质，就能诱导一些基因的表达，热激蛋白（HSPs）就是最常见的诱导蛋白。热激蛋白作为分子伴侣，在蛋白的合成、转运和折叠上均起重要作用。家族I热激蛋白在外来胁迫下，可以保护蛋白，使之能够正常折叠（俞峻1998，生物化学与生物物理进展）。

HSP属于应急反应性蛋白，高温应激可诱导该蛋白质形成。HSP是分子伴侣的一种，在蛋白质翻译后修饰过程中，起到促进需要折叠的多肽链折叠为天然空间构象的蛋白质。对大肠杆菌中蛋白质折叠的研究发现，在大肠杆菌中参与蛋白质折叠的HSP包括HSP70，HSP40和GreE三族。其中HSP70有基因dna K编码，故HSP70又被称为Dna K。它有两个主要功能域：一个是存在于N-端的高度保守的ATP酶结构域，能结合和水解ATP；另一个是存在于C-端的多肽链结合域。蛋白质的折叠需要这两个结构域的相互作用。

HSP促进蛋白质折叠的基本过程是HSP70反应循环，在大肠杆菌中，Dna J首先与未折叠或部分折叠的多肽链结合，将多肽链导向Dna K-ATP复合物，并与Dna K结合。Dna J激活Dna K的ATP酶，使其水解ATP生成ADP，产生稳定的Dna J-Dna K-ADP-多肽复合物。在Grp E的作用下，ATP与复合物中的ADP交换，使复合物变为不稳定而迅速解离，释放出被完全折叠或完成部分折叠的蛋白质，其中尚未完成折叠的蛋白质既可以进入新一轮HSP70反应循环，又可以进入Gro EL反应循环，最后完成折叠过程（张玉秀1999，生物化学与生物物理进展）。

热应激蛋白（HSPs）普遍存在于从细菌到高等真核生物包括人的整个生物界，可以被氨基酸类似物、重金属离子、病毒感染等多种逆境因素诱导。HSPs赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力，并保护它们免遭逆境因素的损害。其中表现最为明显的是热耐受能力的形成，即当细胞或生物接触非致死温度后，表现对致死温度的存活率明显提高。利用这点，我们可以开发出原来不够耐受热的生物使它更加耐受热源。同样可以使不够耐受低温的生物更加耐受低温。

由于丁醇分子的极性性质，其与梭菌的细胞膜相互作用抑制了梭菌的跨膜运输系统及其酶活，最终导致细胞溶解，正是由于丁醇的这种毒性严重抑制了发酵的顺利进行。因此，导致发酵总溶剂量得不到提高，丁醇产量更是不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于强烈火焰菌的小热激蛋白HSP基因（PfHSPS）、表达载体及其构建和应用，以弥补现有技术中的不足。

本发明在不改变氨基酸序列的前提下，按照梭菌的偏爱密码合成来自强烈火焰菌（Pyrococcus furiosus）的小热激蛋白HSP基因（Genbank AF256212），并设计引物，利用PTDS方法（Xiong2004，Nucleic Acids Res）人工合成并克隆该基因，经序列测定，其碱基序列如SEQ ID NO1所示，命名为PfHSPS基因。

然后，本发明又构建了包含上述PfHSPS基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pPFHSP，从而利用该表达载体中的来自梭菌CAC2546基因（NC_003030）的启动子控制PfHSPS基因的表达，利用来自枯草杆菌168（ATCC）的PYK基因（NC_000964）终止子终止该PfHSPS的转录。

所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体是以pSOS94载体（Desai1999，Appl EnvironMicrobiol）为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC2546基因（NC_003030）启动子，PfHSPS基因的开放阅读框和枯草杆菌pyruvate kinase（PYK，NC_000964）基因终止子（PYK）连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元构建而成的，该载体约6720bp。具体构建方法如下：

从pXYP251（GenBank登录号AY178046，含有中等强度原核PGm启动子和终止子为T1T2）载体中扩增氯霉素表达单元。引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’；cm2:5’-TCTAGATATA CGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。

从梭菌C.acetobutylicum ATCC824（美国典型培养物保藏中心，US7432090）中扩增CAC2546基因启动子。引物为cac1:5’-TCTAGAAAAGGAAAATATGATAAAAAATTTCA-3’；cac2:5’-GGATCCTAATATCGAAAATAG CTTAAAC-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

从枯草杆菌Bacillus subtilis 168（ATCC）基因中扩增PYK终止子。引物为pyk1:5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’；pyk2:5’-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACA GGCGCCG-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

将上述三个PCR扩增片断回收后，平端连接，克隆并测序。获得测序正确的基因，将氯霉素表达单元用HindIII和XbaI双酶切；CAC2546基因启动子用BamHI和Xba I双酶切；本发明的PfHSPS基因BamHI和Sac I双酶切；枯草杆菌Bacillus subtilis168（ATCC）的PYK基因终止子Nde I和Sac I双酶切后依次克隆到pCAMBIA1301载体（http://www.cambia.org）。

克隆后将获得的氯霉素表达单元、CAC2546基因启动子、PfHSPS基因和枯草杆菌PYK基因终止子整体替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元，即获得含有本发明的PfHSPS基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pPFHSP。

利用电击法将上述含有PfHSPS基因的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体导入梭菌中，通过红霉素筛选转化子，利用含丁醇培养基验证了本发明合成的PfHSPS基因能够在梭菌中稳定高效表达，提高了梭菌对丁醇的耐受性。

同时，本发明还利用厌氧发酵，验证了所述PfHSPS基因对梭菌提高丁醇发酵产量的能力。试验结果证明，本发明的PfHSPS基因能够大幅度提高梭菌的产丁醇能力，较原始菌种提高了29.2%。

附图说明

图1为含有PfHSPS基因的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建图谱。

图2为HSP转化子和原始菌种丁醇耐受性比较。

图3和图4为HSP转化子和原始菌种发酵后产物和生长情况比较。

具体实施方式

实施例1来自强烈火焰菌（Pyrococcus furiosus）的小热激蛋白HSP基因的合成

在不改变氨基酸序列的前提下，按照梭菌偏爱密码子合成来自强烈火焰菌（Pyrococcusfuriosus）的HSP基因（Genbank AF256212），设计引物，并人工合成。引物如下，引物长度为50-60bp。

Pfhsp1:GGATCCATGGTTAGAAGAATTAGAAGATGGGATATTTGGGACCCATTTGATCTTATTAGA

Pfhsp2:AAAATTCATCAAACATTGCATCAATTTCCTCTTGAATTTCTCTAATAAGATCAAATGGGT

Pfhsp3:TGCAATGTTTGATGAATTTTTTAGTAGACCAAGACTTTGGACTTATAGAAGATGGAGTGA

Pfhsp4:TCTCCAAACTTCTCCAACTCTCTCTTCATACATTGCTGGTTCACTCCATCTTCTATAAGT

Pfhsp5:GAGTTGGAGAAGTTTGGAGAGAACCATTTGTTGATATTTTTGATAATGGAGATGAGTTTG

Pfhsp6:ATATCTTCTTTTCTAACTCCTGGAAGTTCTGCTGTAATAACAAACTCATCTCCATTATCA

Pfhsp7:GGAGTTAGAAAAGAAGATATTAAAGTTAGAGTTACTGAGGATACTGTTTATATTGAGGCA

Pfhsp8:CTGCTCCTTCTCTTTCAAGTTCTTTCTCTCTCTTAACAGTTGCCTCAATATAAACAGTAT

Pfhsp9:ACTTGAAAGAGAAGGAGCAGTTAGAATTGAGAGATATTTTACTGGTTATAGAAGAGCTAT

pfhsp10:TGCCTTTGCCTTCTCTGGAATAACTTCTTCTGGAAGTCTAATAGCTCTTCTATAACCAGT

pfhsp11:TTCCAGAAGAAGTTATTCCAGAGAAGGCAAAGGCAAAGTATAATAATGGAGTTCTTGAGA

pfhsp12:TCACTCTCCTTCTTAGTTGGATGCTTCTTTGGAACTCTAATCTCAAGAACTCCATTATTA

pfhsp13:GAGCTCTTATTCAACTTTAACTTCAAATCCTTCACTCTCCTTCTTAGTTGG

利用PCR进行强烈火焰菌HSP扩增，在100μl反应体系中，pfhsp2~pfhsp12共11个引物的添加量为2ng，外侧引物pfhsp1和pfhsp13添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共25个循环后，72℃延伸10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本）。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与Sma I酶切的pUC18载体平端相连。16℃连接1h，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，并进行序列测定，其碱基序列如SEQ IDNO 1所示，该阳性克隆即为本发明的小热激蛋白HSP基因，命名为PfHSPS基因。

实施例2含有PfHSPS基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体的构建

以pSOS94载体（Desai1999，Appl Environ Microbiol）为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC2546基因（NC_003030）启动子，实施例1得到的PfHSPS基因的开放阅读框和枯草杆菌pyruvate kinase（PYK，NC_000964）基因终止子（PYK）连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元，构建由强启动子控制的含有PfHSPS基因表达单元的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体pPFHSP（参看图1），该载体约6720bp。具体构建步骤如下：

从pXYP251（GenBank登录号AY178046，含有中等强度原核PGm启动子和终止子为T1T2）载体中扩增氯霉素表达单元。引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’；cm2:5’-TCTAGATATA CGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。

从梭菌C.acetobutylicum ATCC824（美国典型培养物保藏中心，US7432090）中扩增CAC2546基因启动子。引物为cac1:5’-TCTAGAAAAGGAAAATATGATAAAAAATTTCA-3’；cac2:5’-GGATCCTAATATCGAAAATAG CTTAAAC-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

从枯草杆菌Bacillus subtilis168（ATCC）基因中扩增PYK终止子。引物为pyk1:5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’；pyk2:5’-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACA GGCGCCG-3’。扩增条件：94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

将上述三个PCR扩增片断回收后，平端连接，克隆并测序。获得测序正确的基因，将氯霉素表达单元用HindIII和XbaI双酶切；CAC2546基因启动子用BamHI和Xba I双酶切；实施例1得到的PfHSPS基因BamHI和Sac I双酶切；枯草杆菌Bacillus subtilis168（ATCC）的PYK基因终止子Nde I和Sac I双酶切后依次克隆到pCAMBIA1301载体（http://www.cambia.org）。

克隆后将获得的氯霉素表达单元、CAC2546基因启动子、PfHSPS基因和枯草杆菌PYK基因终止子整体替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元，即获得本发明的含有PfHSPS基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pPFHSP。

实施例3转化质粒处理及转化方法

上述实施例2构建的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pPFHSP含有氨苄青霉素和红霉素抗性，可以在大肠杆菌中复制，又可以通过红霉素筛选转化的梭菌。将该穿梭表达载体利用pAN1质粒上（Mermelstein1993，Appl Environ Microbiol）的甲基化酶甲基化，其含有来自枯草杆菌的δ3T甲基转移酶基因，可以实现梭菌载体的甲基化保护，从而避免质粒在梭菌中被Cac824I限制性内切酶切段，因为该酶切位点在梭菌中广泛存在。

用于质粒扩增的大肠杆菌必须要采用甲基化酶缺失的菌种，因为当将某些胞嘧啶甲基化的DNA转化到常见的E.coli菌株中时，转化效率会明显降低。原因可能来自于E.coli自身的限制系统。本发明利用了甲基化酶mcrBC缺失的菌种（TOP10，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）作为质粒扩增的大肠杆菌菌种。

将pAN1和上述构建的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体共同转化到TOP10菌种中，利用抗氯霉素（CM）和抗氨苄青霉素（AP）双抗生素筛选这两个质粒同时转化成功的转化子，碱法小量抽提质粒DNA。

转化方法如下：梭菌C.acetobutylicum824利用60mL CGM培养基培养至OD₆₀₀=0.5，冰置10分钟，7000g4℃离心10分钟；用预冷的电击缓冲液（270mM葡萄糖和686mM NaH₂PO₄，pH=7.4）洗三次；最后一次用1mL预冷的电击缓冲液悬浮沉淀；分装制备的梭菌感受态细胞，每80ul感受态加入1ug的质粒DNA；混匀后转入4mm的电击杯中；电击条件：（2.5kV，电阻无穷大，25uF）；电击结束后立即加入1mL预冷的2YTG培养基（16g/L蛋白胨，10g/L酵母膏，4g/L NaCl，和5g/L葡萄糖）；混匀转入1.5mL eppendorf管，放置厌氧环境中37℃培养4h；将转化细胞涂布在含有40ug/mL红霉素的2YTG固体平板上进行转化子筛选。厌氧培养2天后，获得大量HSP转化子，转化效率为5×10⁵/ug DNA。

实施例4转化子丁醇耐性检测

在平板上挑取梭菌C.acetobutylicum824及获得的HSP转化子，分别接种到10mL液体RCM培养基中，并在75℃水浴中热激10min，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD₆₀₀=0.8时，将菌体转接至40mL液体CGM培养基中，37℃厌氧培养；当菌体生长至指数生长期OD₆₀₀=1.0±0.05时（大约12h）；培养物被均分成4等份（10mL/份），分别用0、6、12和18g/L丁醇进行胁迫处理，对梭菌在不同丁醇浓度胁迫下的生长状态进行监测。

试验结果参看图2（824--原始菌种，HSP--本发明PfHSPS基因的转化菌种），可以看出：原始菌种--梭菌C.acetobutylicum824能在6g/L和12g/L丁醇中生长，但在18g/L丁醇中几乎不能生长；HSP转化菌种能在6g/L，12g/L和18g/L丁醇稳定生长，虽能生长也受到了部分抑制，但是总体生长情况优于原始菌种。这些结果清晰地展示出HSP转化到梭菌后能够耐受更高浓度的丁醇，有效地提高菌种在丁醇胁迫下的生长表现。

实施例5梭菌的中试发酵

为了获得HSP转化菌种更多的生理学特征，我们进行控制pH（pH＜5.0）分批发酵实验。分别进行了两次生物学重复试验取平均作为最终结果，小规模发酵实验在BioStat B发酵罐（德国贝朗公司）中进行。首先在平板上挑取梭菌及HSP转化子单克隆分别接种到10mL液体RCM培养基中，HSP转化梭菌的培养基中补加20ug/l红霉素，37℃厌氧培养；当菌体生长至OD₆₀₀=0.8时，将菌体转接至液体CGM培养基中厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD₆₀₀=0.2时，按10%的接种量接种到含有4L液体CGM（80g/L葡萄糖）培养基的发酵罐中进行发酵实验；通过充氮气（流速50mL/min）维持发酵罐中厌氧环境；发酵起始pH大约是6.5，通过补加6mol氨水来控制菌体发酵pH维持在5.0。当葡萄糖量降至初始量一半时，添加葡萄糖至初始浓度。

实施例6发酵后代谢产物的检测

用Agilent6890气相色谱仪测定发酵后代谢产物。

色谱条件：色谱柱：phenomen ZB--WAXplus，检测器：FID（220℃）进样量0.2txL，进样口压力：16.92psi，柱箱温度：100℃，氢气流量：30mL/min，正丙醇作为内标进行定量分析。

试验结果参看图3和图4，可以看出：1）HSP转化菌种在发酵过程中丁醇的最高产量达到230mM，而原始菌种丁醇的产量最高仅为178mM，提高了29.2%；HSP转化菌种在发酵过程中丙酮的最高产量是139mM，原始菌种丙酮的产量最高仅为94mM，提高了47.8%；发酵过程中HSP转化菌种乙醇的最高产量是24.2mM，与原始菌种产量相当；HSP转化菌种溶剂总产量达到393.2mM，相对于原始菌株提高了32.6%。两个菌种的丁酸最高产量只有很小的差异，HSP菌种为71mM，稍微低于原始菌株的75.2mM。

2）原始菌株能够快速利用葡萄糖，30个小时后生长量达到最高（OD₆₀₀达到8.4），然而，随着丁醇的产生，菌种在50小时后，生长密度急剧下降（OD₆₀₀为6.2），丁醇产量慢慢减少，直到达到一定平衡，此时发酵液中的丁醇浓度对菌种的危害较小。而HSP转化子在发酵过程中，从30-70小时内菌种都处于高密度生长状态，丁醇产量在该段时间内持续增加，直到接近原始菌种最高产量水平，此后，丁醇产量维持一段低增长的时期，从80-110小时丁醇的产量又快速增长，直到最高值，后期由于丁醇产量较高，对菌种有一定的毒害作用，造成菌体生长密度急剧下降。

从上述发酵结果可以看出，由于HSP转化菌能够耐受更高浓度的丁醇，菌种能够保持很长时间的高密度生长，从而保证丁醇产量的不断增加。丙酮的产生规律和丁醇相似，HSP转化菌种丙酮产量在110小时内均在稳定的增长。