一株凝结芽孢杆菌及使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成工艺

摘要

一株凝结芽孢杆菌及其使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成方法，属于生物化工领域。本发明使用从土壤中分离得到的一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635生物转化木质纤维素生产乳酸。本发明方法的优点在于此菌株具备高温发酵特性，对木质纤维素水解液中发酵抑制物耐受能力强，并且能高效利用己糖、戊糖和纤维二糖生产乳酸。该发明工艺，以凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635为菌种，可以将原料预处理、木质纤维素酸解液发酵和纤维素糖化发酵工艺集成，省去了固液分离、料液脱毒步骤。该方法能简化操作工艺、节省设备投资、提高发酵效率，实现木质纤维素高值化应用，具有重要的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种以木质纤维素为原料同步糖化共发酵生产乳酸的集成工艺，实现木质纤维素资源的高值化利用，降低乳酸生产成本。 

背景技术

乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工、酿造及纺织等领域。近年来，以乳酸为单体合成的聚乳酸塑料因具有可生物降解特性，被认为是石化塑料的最佳替代品之一。乳酸主要是由发酵法生产，目前文献报道的产乳酸的微生物主要有真菌的根霉菌属（Rhizopus）和细菌的乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和芽孢杆菌属（Bacillus）。乳杆菌属(Lactobacillus)细菌是广泛应用的工业生产菌株，葡萄糖是发酵生产乳酸的常用碳源，但是由于不同微生物胞内酶系的差异，葡萄糖被转运到细胞内后的代谢途径也有所不同，其代谢过程主要可以分为两类，即同型乳酸发酵途径、异型乳酸发酵途径。同型乳酸发酵是葡萄糖经糖酵解途径（EMP）分解为丙酮酸，理论转化率可达100%。异型乳酸发酵是菌体利用磷酸己糖途径（HMP），发酵产物除乳酸外还有乙醇、乙酸，乳酸转化率只有60％。 

近年来，利用可再生生物质资源为原料生产乳酸成为研究热点。木质纤维素是地球上丰富而廉价的可再生资源，用木质纤维素原料代替粮食生产乳酸，不仅能促进可再生资源的转化与利用，而且可有效控制环境污染，意义重大。木质纤维素的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素。木质纤维素生物转化乳酸目前还处于研究阶段，商业化应用存在成本偏高等一系列问题。目前，主要有以下三个方面因素限制了木质纤维素乳酸的工业生产。 

首先，原料预处理阶段会产生对微生物生长有抑制作用的化合物，如弱酸类物质（甲酸、乙酸等）、呋喃类物质（糠醛、5-羟甲基糠醛等）和酚类化合物（香草醛等）。因此，发酵前需要使用脱毒工艺对原料进行处理。脱毒工艺包括物理方法（旋转蒸发、吸附、萃取等）、化学方法（氢氧化钙沉淀法）和生物方法（酶及微生物降解法）。尽管脱毒工艺得到了深入研究，但是其工业化应用还存在成本偏高的问题。筛选具有抑制物耐受性的微生物，实现木质纤维素预处理后不经脱毒直接发酵，是最理想的解决方法，可以显著降低整体生产成本。 

其次，纤维素的酶解过程是制约纤维素乳酸工业化应用的另一个技术难点。纤维素酶为能降解纤维素生产葡萄糖的一组酶，纤维素酶至少由三种酶组分：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。葡萄糖和纤维二糖作为酶水解的末端产物，能抑制酶的活力，特别是纤维二糖的抑制作用更强，这样会严重降低酶解效率。将酶解过程与发酵过程集成，即同步糖化与发酵（Simultaneous saccharification and fermentation,SSF）技术受到广泛关注，该技术能将反应过程中形成的酶解产物及时去除，是提高纤维素水解得率的关键措施。但是，目前乳酸生产菌种大多为中温菌，其最适的发酵温度为37～45℃，与商品纤维素酶最佳酶 解温度（48～50℃）不一致，如果使用SSF工艺，会导致酶解效率偏低，从而影响整体发酵过程。 

最后，木质纤维素降解得到的是由己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖等）和戊糖（木糖、阿拉伯糖等）组成的混合糖。乳酸杆菌（Lactobacillus）普遍具有很高的葡萄糖发酵能力，但是对于木糖等戊糖的利用能力十分有限。在木质纤维素资源中，木糖含量仅次于葡萄糖，对木糖的利用不容忽视。因此，筛选戊糖高效转化菌株，是实现木质纤维素的高效利用的另一技术关键。 

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种乳酸发酵新菌种，该菌株普遍具有较高的发酵温度（45～60℃），且培养基不需灭菌，发酵过程不必无菌操作，极大的降低生产成本。同时，凝结芽孢杆菌能通过磷酸戊糖（Pentose-Phosphate Pathway,PP）途径代谢木糖，3摩尔木糖产生5摩尔乳酸，乳酸理论得率为100%，是理想的木糖发酵菌种。经过对现有技术的检索发现，中国专利CN200710176060.9、CN200910028930.7、CN201010137769.X、CN02806664.2、CN201010176868.9都报道了凝结芽孢杆菌发酵生产乳酸，但均为利用葡萄糖或者淀粉发酵生产乳酸的工艺。在专利“用于制备L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法”（CN201010176868.9）中，描述了利用凝结芽孢杆菌发酵木糖醇副产物中的五碳糖和六碳糖生产乳酸，但没有涉及到木质纤维素利用和SSF发酵工艺。PCT专利PCT/US2005/006774公布了使用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）36D1发酵经脱毒处理的甘蔗渣稀酸水解液中木糖和葡萄糖发酵，并报到了使用该菌株对商品微晶纤维素的SSF过程，并报道了使用脱毒处理的甘蔗渣稀酸水解液和微晶纤维素进行通过糖化共发酵工艺（Simultaneous saccharification and co-fermentation,SSCF），但是脱毒工艺使发酵过程成本提高，工业化应用受到一定限制。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，优选乳酸发酵菌种，筛选到一株乳酸生产菌，鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），该菌株已于2013年5月23日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（简称CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.7635。本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635能在最高58℃条件下发酵生产乳酸，发酵底物包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖及纤维二糖，且乳酸转化率达到95%以上。本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635对木质纤维素预处理后产生的发酵抑制物具有很好的耐受性，对糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛、乙酸盐的最大耐受浓度分别为2g/L、2g/L、3g/L、30g/L。 

基于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635的以上特性，发明了一种同步糖化共发酵木质纤维素发酵生产乳酸的集成工艺，该工艺将原料预处理、木质纤维素预处理水解液发酵和纤维素同步糖化发酵三个操作单元整合。原料预处理后不需要经过固液分离和脱毒工艺，直接进行木质纤维素预处理水解液发酵和纤维素同步糖化发酵。该工艺的主要步骤包括： 

（1）木质纤维素的预处理 

将木质纤维素原料粉碎，采用稀碱液、稀酸液或者蒸汽爆破方法处理，得到木质纤维素预处理料液，其中液体中含有可发酵的还原糖，固形物主要为纤维素。 

（2）同步糖化共发酵产乳酸 

以嗜热乳酸生产菌为菌种实现木质纤维素同步糖化共发酵生产乳酸。将步骤（1）得到的木质纤维素原料液调节pH为5.0～7.5之间，接入发酵菌种和氮源启动发酵，发酵过程分为阶段I和阶段II。发酵阶段I培养条件为45～58℃之间，搅拌速度为100～300rpm范围之间，pH值不予控制。待发酵液的pH值降到4.5～5.5后进入发酵阶段II，此时向发酵体系加入纤维素酶，培养条件调整为：温度48～52℃，搅拌速度50～200rpm，pH值自动控制为4.5～5.5之间。发酵时间控制在50～100小时。 

本发明中所述的木质纤维素可以是玉米秸秆、稻草秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、草类以及阔叶树或针叶树的木屑。本发明所使用的pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾或者氨水。本发明所使用的氮源是指：酵母粉5～15g/L，胰蛋白胨5～15g/L和玉米浆干粉10～20g/L中的一种或其任意重量比例组合至总浓度5～30g/L。本发明所使用的纤维素酶用量为10～20FPU/g纤维素。 

与现有技术相比，本发明的优势在于： 

(1)本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635菌种发酵产乳酸的温度为50～58℃，发酵培养基不需灭菌，发酵过程不需无菌操作。该菌株可发酵纤维二糖生产乳酸，且发酵类型为同型乳酸发酵。该菌株用于同步糖化发酵工艺制备乳酸优势明显：发酵温度与商业纤维素酶一致，且发酵过程能快速消耗纤维素酶产物——葡萄糖和纤维二糖，有效解除了酶解底物的抑制现象，节省纤维素酶使用量，降低生产成本。 

(2)本发明菌株具备良好的戊糖利用性能，且发酵过程为同型乳酸发酵。木质纤维素生物转化乳酸工艺大多围绕葡萄糖转化进行研究，本发明同时涉及木质纤维素中己糖和戊糖，实现生物质原料的高效利用。 

(3)本发明的菌株对木质纤维素预处理过程产生的抑制物耐受能力强，从而可以发酵未经脱毒的纤维素水解液，避免脱毒工艺带来的能耗损失和大量洗涤水需求，从而使木质纤维素乳酸的工业化生产更经济可行。 

(4)针对本发明的菌株，开发了一种利用木质纤维素同步糖化共发酵集成工艺，将原料预处理、木质纤维素预处理水解液发酵和纤维素同步糖化发酵整合在同一反应器中进行。使用该工艺生产纤维素乳酸，设备投资少，无需固液分离，节省了脱毒步骤中的能耗和洗涤用水，并且能得到更高浓度的乳酸，降低了后续分离纯化成本。 

（5）整个操作过程为开放式，发酵培养基和设备无需灭菌，极大地降低了能耗，发酵工艺简单，易于工业化。 

附图说明

图1是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635同步糖化共发酵小麦秸秆生产乳酸过程图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635的分离鉴定及其发酵性能考察 

该实验中所用的培养基如下： 

MRS培养基：胰蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L。固体培养基，MRS培养基中添加1.5%的琼脂粉，依需要添加2%葡萄糖或木糖；筛选培养基，固体培养基添加0.015%溴甲酚紫；种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，余量为水。发酵培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，碳源依不同试验不同，具体为葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖或纤维二糖中的一种，碳源浓度为20g/L，余量为水。 

发酵方法：将在固体培养基上培养24h的菌落接种于种子培养基，45℃、100rpm振荡培养6h，即为一级种子液。一级种子再次转接种子培养基，接种量为5%（v/v），50℃、100rpm振荡培养6h作为二级种子液。发酵时，将二级种子液接种于发酵培养基中，接种量5%（v/v），全自动发酵罐控制培养温度52℃、搅拌速度100rpm、pH6.0。 

分析方法：发酵液中糖、乳酸以及副产物组分使用高效液相色谱法（HPLC）检测。使用Bio-rad HPX-87H型色谱柱，柱温50℃，流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，检测器为岛津RID-10A型示差折光检测器检测和岛津SPD-20A型紫外检测器。生物量用细胞干重表示。 

菌种筛选及鉴定：采集北京市海淀区某试验田土壤，将样品与MRS液体培养基混合，在45℃厌氧培养12h，富集菌种。培养液使用生理盐水适当稀释，涂布于含有2%葡萄糖或2%木糖的筛选培养基平板上。挑选生长速度快，培养基变色范围大的菌落进行反复筛选，初筛得到的菌种通过摇瓶试验进一步复筛，以考察乳酸产量。筛选得到的乳酸产生菌参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，并对其16S rRNA序列扩增测序，测序结果提交至Genebank数据库比对。具体结果如下： 

从环境样品中分离得到了96株乳酸产生菌，其中一株产芽孢细菌，具备52℃发酵木糖和葡萄糖生产乳酸的能力。细菌革兰氏染色呈阳性，在一定条件下可产生芽孢，为兼性厌氧菌。光学显微镜观察，菌体杆状，少数稍弯曲，单个排列，宽约0.6～1μm，长约3.0～5.0μm。该菌株过氧化氢酶和接触酶试验为阳性，V-P试验及硫化氢试验为阳性，能水解酪素、明胶和淀粉，能利用柠檬酸盐和硝酸盐，不能利用丙酸盐，吲哚试验为阴性。该菌株能在2%氯化钠中生长，最高生长温度60℃。该菌株能够利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖及淀粉，不能利用鼠李糖。对菌株16S rRNA进行测序，测序结果提交Genebank，登录号为JX193760。经过序列比对分析，该菌株与数据库中凝结芽孢杆菌36D1（Bacillus coagulans36D1）同源性达99%以上。生理生化试验结果和16S rRNA测序分析结果均显示，该 菌株为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7635。 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635对木质纤维素来源的碳源发酵能力如表1所示。 

表1利用不同碳源发酵生产乳酸 

注：发酵使用碳源浓度为20g/L，发酵温度52℃，pH6.0，ND（没有检测到）。 

考察凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635对木质纤维素水解液中常见的抑制物的耐受能力。具体试验方法为：菌种接种于的MRS液体培养基中45℃，100rpm培养6h，然后以1%（v/v）量接种于添加有不同浓度抑制物的MRS液体培养基中，50℃，100rpm培养24h，通过生物量变化以检测菌体对抑制物的耐受能力。结果表明，菌种对糠醛、5-甲基糠醛（5-HMF）、甲酸盐、乙酸盐、香草醛的最大耐受浓度为2g/L、2g/L、1g/L、30g/L和3g/L，对硫酸盐的耐受浓度为60g/L。与已有报道的乳酸生产菌种相比，该菌株对抑制物耐受能力强，具备发酵未经脱毒木质纤维素水解液能力。 

实施例2 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635同步糖化共发酵小麦秸秆生产乳酸集成工艺 

小麦秸秆洗净、烘干，粉碎成平均大小40目的粉末。取100g干重小麦秸秆粉末，在发酵罐中使用2%(w/v)硫酸121℃处理90min，固液比1:10（质量体积比）。预处理后，使用氢氧化钠调整pH为6.0后，加入10g/L玉米浆干粉，将制备得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635二级种子液（制备方法同实施例1）以5%（v/v）接种量接种于上述得到的小麦秸秆预处理料液，开始同步糖化共发酵集成工艺。发酵过程分为阶段I和阶段II。阶段I培养条件为：300rpm、55℃，不控制pH值。随着发酵的进行，菌种利用发酵液中葡萄糖产乳酸，pH开始下降。等到pH降到5.0，进入发酵阶段II，即同步糖化发酵阶段。此时开启发酵罐的pH自控系统，同时加入纤维素酶，加酶量为每克纤维素加入15个滤纸酶活单位（FPU）。发酵阶段II培养条件为：50℃、pH4.8、200rpm。发酵过程持续100h，最终得到38.42g/L乳酸，小麦秸秆乳酸转化率为0.46g/g，发酵过程曲线如图1所示。 

实施例3 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635同步糖化共发酵玉米秸秆生产乳酸集成工艺 

玉米秸秆洗净、烘干，粉碎成平均大小40目的粉末，使用加氨水蒸汽爆破方法预处理。玉米秸秆粉末使用氨水蒸汽爆破处理，汽爆操作条件为：压力1.5MPa，维持10min，固液比1:8（质量体积比），添 加氨水用量为5%。预处理后，使用硫酸调整pH为7.5，然后加入10g/L玉米浆干粉，并将制备得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635二级种子（制备方法同实施例1）以5%（v/v）接种量接种开始发酵。发酵过程分为阶段I和阶段II。阶段I培养条件为：300rpm、58℃，pH暂时不控制。随着发酵的进行，菌种利用发酵液中葡萄糖产乳酸，pH开始下降。等到pH降到4.5，进入发酵阶段II。此时开启发酵罐的pH自控系统，同时加入纤维素酶，加酶量为每克纤维素加入20个滤纸酶活单位（FPU）。发酵阶段II培养条件为：50℃、pH4.8、200rpm。发酵过程持续110h，最终得到49.39g/L乳酸，玉米秸秆乳酸转化率为0.52g/g。 

实施例4 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635同步糖化共发酵甘蔗渣生产乳酸集成工艺 

将苷蔗渣烘干、粉碎，使用蒸汽爆破方法预处理。以1%硫酸(质量体积比)作为溶剂溶解粉碎后的甘蔗渣，固液比1:8（质量体积比），升压至1.0MPa，维持10min，卸压。预处理后，使用氨水调整pH为7.0，然后加入15g/L玉米浆干粉，并将制备得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635二级种子（制备方法同实施例1）以5%（v/v）接种量接种开始发酵。发酵过程分为阶段I和阶段II。阶段I培养条件为：200rpm、55℃，pH暂时不控制。随着发酵的进行，pH开始下降。等到pH降到5.0，进入发酵阶段II。此时开启发酵罐的pH自控系统，同时加入纤维素酶，加酶量为每克纤维素加入15个滤纸酶活单位（FPU）。发酵阶段II培养条件为：48℃、pH4.8、100rpm。发酵过程持续110h，最终得到56.72g/L乳酸，甘蔗渣乳酸转化率为0.59g/g。 

实施例5 

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635同步糖化共发酵柳枝稷生产乳酸集成工艺 

柳枝稷烘干，粉碎成平均大小40目的粉末。柳枝稷粉末使用稀酸预处理，条件为：压力135℃，10min，2%（w/v）硫酸，固液比1:8（质量体积比）。预处理结束后，使用氨水调整pH为6.5，然后加入15g/L玉米浆干粉，并将制备得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC No.7635二级种子（制备方法同实施例1）以5%（v/v）接种量接种开始发酵。发酵过程分为阶段I和阶段II。阶段I培养条件为：200rpm、50℃，pH暂时不控制。随着发酵的进行，pH开始下降。等到pH降到4.8，进入发酵阶段II。此时开启发酵罐的pH自控系统，同时加入纤维素酶，加酶量为每克纤维素加入15个滤纸酶活单位（FPU）。发酵阶段II培养条件为：48℃、pH4.8、150rpm。发酵过程持续80h，最终得到43.83g/L乳酸，柳枝稷乳酸转化率为0.49g/g。