P97-抗体缀合物和使用方法

摘要

本发明提供了p97-抗体缀合物以及相关的组合物和方法，这些缀合物、组合物和方法可以用于多种治疗方法中的任何一种，包括用于治疗癌症如表达Her2/neu的癌症和表达Her1/EGFR的癌症的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年6月11日递交的第 61/658,217号美国申请和2011年7月5日递交的第61/504,646号美国申 请的权益，两个申请都通过引用整体并入本文。

序列表的申明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质拷贝提供，并且在此通 过引用并入到说明书中。含有序列表的文本文档的名称为 BIOA_003_02WO_ST25.txt。该文本文档为约41KB，于2012年7月5 日建立，并且通过EFS-Web电子递交。

发明背景

技术领域

本发明总体涉及p97-抗体缀合物、相关的组合物及使用该缀合物和 组合物的方法。某些实施方案更具体涉及包含p97多肽序列和抗体或其 抗原结合片段的缀合物，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合细胞表 面受体、或细胞表面蛋白、或癌症相关的抗原，如人Her2/neu蛋白或 Her1/EGF受体。此类抗体缀合物可用于，例如，治疗多种疾病，包括肿 瘤疾病如表达Her2/neu的和表达Her1/EGFR的癌症的方法中。

相关技术的描述

克服将治疗剂递送至脑的特定区域的困难代表了治疗大多数脑病症 的主要挑战。在血脑屏障(BBB)的神经保护作用中，其发挥功能来阻碍 许多潜在的重要脑诊断剂和治疗剂的递送。治疗分子和基因不能以足够 的量穿透BBB，否则它们可能在诊断和治疗中发挥效力。据报导，所有 治疗分子中95%以上不能穿透血脑屏障。

曲妥珠单抗(商标名)，一种获得许可的对人Her2/neu蛋白 具有特异性的单克隆抗体，对于治疗约30%的对该蛋白呈现阳性的人乳 腺癌是一种重要的治疗选择。尽管曲妥珠单抗已被证明在全身性疾病的 治疗和控制中具有价值，由于曲妥珠单抗不能穿透血脑屏障这一事实， 其不能解决在中枢神经系统(CNS)中频繁观察到的表达Her2/neu的转移 性癌症细胞的扩散。

存在重要的对提高抗体治疗潜能的未满足需求，包括对Her2/neu或 Her1/EGFR具有特异性的那些抗体。例如，存在对相对于常规抗体具有 增加的活性和/或其他性能的抗-Her2/neu或抗-Her1/EGFR抗体及抗原结 合片段的需求。另外，为了有效治疗Her2/neu+或Her1/EGFR+癌症，尤 其是已转移至CNS的那些癌症，存在对可促进递送抗-Her2/neu或抗 -Her1/EGFR抗体穿透血脑屏障的组合物和方法的需求。这些需求同样适 用于其他癌症抗原特异性抗体，包括对Her3、A33抗原、CD5、CD19、 CD20、CD22、CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内 皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)等具有特异性的抗体。

本发明解决这些需求并提供其他相关的优势。

发明概述

根据一个通用的方面，本发明提供包含p97多肽序列和抗体或其抗 原结合片段的治疗性组合物。在一些实施方案中，抗体或其片段特异性 结合细胞表面蛋白，如细胞表面受体。在具体的实施方案中，所述抗体 特异性结合癌症相关的抗原或癌症抗原。某些癌症抗原包括细胞表面蛋 白及其各自的配体。在具体的实施方案中，抗体或其片段特异性结合人 Her2/neu蛋白或人Her1/EGF受体。

在某些方面，p97多肽序列和抗体或其片段各自结合或封装在颗粒 内，例如，纳米颗粒、珠、脂质制剂、脂质颗粒或脂质体，例如，免疫 脂质体。在特定的实施方案中，p97多肽序列存在于颗粒的表面上，并且 抗体或其片段存在于颗粒表面上和/或封装在颗粒内。

在相关通用的方面，本发明还提供了包含共价连接至抗体或其抗原 结合片段上的p97多肽序列的治疗缀合物。在具体的实施方案中，抗体 或其片段特异性结合人Her2/neu蛋白。如本文中所描述，此类组合物和 缀合物在治疗表达Her2/neu的癌症，包括已移至CNS的那些癌症中具有 特别的价值。

用于本发明的缀合物中的p97多肽序列基本上可以为来源于p97蛋 白的任何氨基酸序列。在具体的实施方案中，用于本发明的缀合物中的 p97多肽序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在另一具体的实施 方案中，p97多肽序列为与SEQ ID NO:1的序列具有至少80%同一性的 序列。在又一具体的实施方案中，p97多肽序列是人p97蛋白序列的片段， 其具有SEQ ID NO:1所示序列的至少约20、30、40、50、60、70、80、 90或100个或更多个连续的氨基酸残基。在另一具体的实施方案中，p97 多肽序列为可溶的p97多肽序列。在又一具体的实施方案中，p97多肽序 列是能有效促进运输其所连接的抗体穿透血脑屏障的序列。

可以使用多种已知的和既定的方法中的任何一种将p97多肽序列缀 合至任何治疗性抗体或抗原结合片段(例如，抗-Her2/neu抗体或抗原结合 片段)上，其示例性实例在本文中有描述。这些技术包括化学缀合技术。 在其他实施方案中，该技术依赖于标准重组DNA技术(例如，用于制备 融合多肽)。

在本发明的某些更具体的实施方案中，p97多肽序列利用连接子共价 连接至抗体或抗原结合片段上。在更具体的实施方案中，p97多肽序列： (a)利用聚合交联连接子共价连接至抗体或抗原结合片段上，(b)通过纳米 颗粒共价连接至抗体或抗原结合片段上，或(c)通过脂质体可操作地连接 至抗体或其抗原结合片段上。在另一具体的实施方案中，p97多肽序列利 用包含聚乙二醇的聚合交联连接子共价连接至抗体或抗原结合片段上。 在另一具体的实施方案中，p97多肽序列利用包含硫醚连接的聚合交联连 接子共价连接至抗体或抗原结合片段上。

根据本发明使用的抗-Her2/neu抗体或其抗原结合片段通常能特异性 结合具有SEQ ID NO:2所示序列的人Her2/neu蛋白。

在更具体的实施方案中，抗-Her2/neu抗体为曲妥珠单抗或者其抗原 结合片段或衍生物。

p97抗体缀合物还可以为包含p97多肽序列和Her2/neu特异性抗体 或抗原结合序列的融合多肽。可以使用常规重组DNA方法有利地共表达 所述融合多肽来制备本发明的期望的缀合物。

因此，在另一个方面，本发明提供了分离的融合多核苷酸和含有该 融合多核苷酸的宿主细胞，其中所述融合多核苷酸编码包含p97多肽序 列和治疗性抗体或其抗原结合片段例如，Her2/neu特异性抗体或抗原结 合片段的融合多肽。

根据又一个方面，本发明提供了包含p97抗体缀合物或编码p97缀 合物的多核苷酸和药学可接受的赋形剂的药物组合物。

根据又一个方面，本发明提供了通过将包含本发明的p97-抗体缀合 物的药物组合物对个体给药来治疗患有表达Her2/neu的癌症的个体的方 法。在某些实施方案中，待治疗的表达Her2/neu的癌症为转移性癌症， 尤其是以CNS进展表征的转移性癌症。

还包括包含共价连接至单克隆抗体或其抗原结合片段的p97多肽序 列的缀合物。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合真 核细胞表面蛋白。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结 合哺乳动物细胞表面蛋白，任选地为人细胞表面蛋白。在特定的实施方 案中，抗体或抗原其结合片段特异性结合癌症相关的抗原。

在某些实施方案中，癌症相关的抗原与以下的一种或多种相关：乳 腺癌、转移性脑癌、前列腺癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈 癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、鳞状细胞癌、CNS或脑癌、 黑色素瘤、非黑色素瘤癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、上皮性肿瘤、骨癌 或造血系统癌症。

在一些实施方案中，癌症相关的抗原选自以下的一种或多种： Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD20、 CD22、CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长 因子VEGF(例如，VEGF-A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、 CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、 CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、 胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、整合素αvβ3、整合素α5β1、 叶酸盐受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白、α(FAP)、糖蛋 白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺 特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体 超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7 (SLAMF7)、EGP40泛癌(pancarcinoma)抗原、B-细胞活化因子(BAFF)、 血小板来源的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、 蛋白二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸磷酸酶、 Lewis-Y抗原、GD2(一种表达于神经外胚层起源的肿瘤上的双唾液酸神 经节苷酯)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。

在某些实施方案中，单克隆抗体选自以下的一种或多种：曲妥珠单 抗、3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫 土珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab (pegol))、阿麦妥昔(amatuximab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、巴维昔单抗 (bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐 单抗(bevacizumab)、莫-比伐珠单抗(bivatuzumab(mertansine))、贝伦妥单 抗-维多汀(brentuximab vedotin)、莫-坎妥珠单抗(cantuzumab (mertansine))、拉-坎妥珠单抗(cantuzumab(ravtansine))、卡罗单抗-喷地肽 (capromab(pendetide))、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗 (cetuximab)、泊-西他珠单抗(citatuzumab(bogatox))、西妥木单抗 (cixutumumab)、clivatuzumab(tetraxetan)、可那木单抗(conatumumab)、达 西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、地莫单抗、drozitumab、 依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依洛珠单抗 (elotuzumab)、enavatuzumab、恩司昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗 (epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、 法勒珠单抗(farletuzumab)、FBTA05、芬妥木单抗(figitumumab)、 flanvotumab、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、 ganitumab、吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumab(ozogamicin))、吉瑞昔单 抗(girentuximab)、格莱木单抗-维多汀(glembatumumab(vedotin))、替-伊 莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、icrucumab、伊戈伏单抗(igovomab)、拉-英 达西单抗(indatuximab ravtansine)、英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗- 奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)(MDX-101)、 伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗 (lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、莫-洛伏珠单抗(lorvotuzumab (mertansine))、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕 木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗 (milatuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、 moxetumomab(pasudotox)、他那可单抗(nacolomab(tafenatox))、他那莫单 抗(naptumomab(estafenatox))、narnatumab、奈昔木单抗(necitumumab)、 尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nivolumab、(具有或没有放射 性碘)、NR-LU-10、奥法木单抗(ofatumumab)、olaratumab、奥纳珠单抗 (onartuzumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab(monatox))、奥戈伏单抗 (oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕曲土单抗(patritumab)、 pemtumomab、培妥珠单抗(pertuzumab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥 莫单抗(racotumomab)、radretumab、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥木单 抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、奥 马珠单抗(samalizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗 (siltuximab)、tabalumab、帕-他莫单抗(taplitumomab(paptox))、替妥莫单 抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、TGN1412、替西木单抗 (ticilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、 TNX-650、托西莫单抗(tositumomab)、TRBS07、西莫白介素单抗 (tucotuzumab(celmoleukin))、ublituximab、乌瑞鲁单抗(urelumab)、维妥 珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥昔单抗(votumumab) 和扎芦木单抗(zalutumumab)，包括以上抗体的抗原结合片段。

在具体的实施方案中，单克隆抗体为人源化的或嵌合的单克隆抗体。

还包括包含本文中描述的p97-抗体缀合物和药学可接受的载体或赋 形剂的药物组合物。

某些实施方案涉及治疗患癌个体的方法，包括将本文中描述的药物 组合物对个体进行给药。在一些实施方案中，所述个体患有选自以下的 一种或多种癌症：乳腺癌、转移性脑癌、前列腺癌、胃肠癌、肺癌、卵 巢癌、睾丸癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、鳞状细 胞癌、CNS或脑癌、黑色素瘤、非黑色素瘤癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、 上皮性肿瘤、骨癌或造血系统癌症。

在特定的实施方案中，所述癌症与以下至少一种的表达相关： Her2/neu、Her1/EGFR、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD20、CD22、 CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF (例如，VEGF-A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、 CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、 CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样 生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碳 酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、整合素α_vβ₃、整合素α₅β₁、叶酸盐 受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白、α(FAP)、糖蛋白75、 TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜 抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成 员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40 泛癌抗原、B-细胞活化因子(BAFF)、血小板来源的生长因子受体、糖蛋 白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷 酸酶3(PRL-3)、前列腺酸磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(一种表达于神经 外胚层起源的肿瘤上的双唾液酸神经节苷酯)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3) 或间皮素。在某些实施方案中，p97-抗体缀合物的单克隆抗体部分特异 性结合癌症相关的抗原。

在某些实施方案中，所述癌症为转移性结肠直肠癌或头颈癌，并且 所述单克隆抗体特异性结合Her1/EGFR且为EGFR拮抗剂。在特定的实 施方案中，单克隆抗体特异性结合SEQ ID NO:15(Her1/EGFR)(例如，其 一个或多个连续的或不连续的表位)。在某些实施方案中，所述癌症为表 达EGFR的转移性结肠直肠癌。在具体的实施方案中，结肠直肠癌为KRAS 野生型。在某些实施方案中，所述缀合物在基于伊立替康和基于奥沙利 铂的方案都失败后给予。在一些实施方案中，个体不能耐受基于伊立替 康的方案，或使用基于伊立替康的化疗难以治疗。在其他的方面，所述 癌症为头颈局部或区域性晚期鳞状细胞癌、头颈复发性局部区域性疾病 或转移性鳞状细胞癌，或者基于铂的治疗后发展的头颈复发性或转移性 鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述缀合物联合放射治疗、基于铂的 治疗或基于铂的采用5-FU的治疗给予。在这些和相关的实施方案的某些 中，所述抗体为西妥昔单抗或其抗原结合片段。

某些缀合物包含共价连接至根据以下结构中一种的抗体(Ab)上的 p97多肽：

p97(FGly)-R₁-Ab或p97-R₁-(FGly)Ab

其中R₁为至少一个醛反应性连接；并且FGly为包含以下结构的异 源硫酸酯酶模体内的甲酰甘氨酸残基：

X₁(FGly)X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:5)

其中Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或缺失，并且当存在时为任 何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于p97多肽的N端时，X₁任选地 存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨基酸。

在一些实施方案中，R₁包含席夫碱。在特定的实施方案中，R₁为肟 连接、肼连接或肼硫代酰胺(hydrazine carbothiamide)连接。

还包括分离的包含至少一个异源硫酸酯酶模体的p97多肽，所述模 体包含以下结构：

X₁Z₁X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:6)

其中Z₁为半胱氨酸或丝氨酸；Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或 缺失，并且当存在时为任何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于醛标 记的多肽的N端时，X₁任选地存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨 基酸。

某些分离的p97多肽包含至少一个异源硫酸酯酶模体，其包含以下 结构：

X₁(FGly)X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:5)

其中FGly为甲酰甘氨酸残基；Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或 缺失，并且当存在时为任何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于p97 多肽的N端时，X₁任选地存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨基酸。

在一些实施方案中，分离的p97多肽共价连接至包含至少一个异源 硫酸酯酶模体的抗体(Ab)上，其中所述模体包含以下结构：

X₁(FGly)X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:5)

其中FGly为甲酰甘氨酸残基；Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或 缺失，并且当存在时为任何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于抗体 的N端时，X₁任选地存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨基酸，其 中p97多肽和抗体通过它们各自的FGly残基共价连接以形成p97-抗体缀 合物。在一些实施方案中，分离的p97-抗体缀合物包含以下结构：

p97(FGly)-R₁-L-R₂-(FGly)Ab

其中R₁和R₂为相同的或不同的醛反应性连接；并且L为连接子部 分。

在一些实施方案中，至少一个异源硫酸酯酶模体处于p97多肽的C 端和抗体的N端。在某些实施方案中，至少一个异源硫酸酯酶模体处于 p97多肽的N端和抗体的C端。在特定的实施方案中，至少一个异源硫 酸酯酶模体处于p97多肽的N端和抗体的N端。在一些实施方案中，至 少一个异源硫酸酯酶模体处于p97多肽的C端和抗体的C端。在具体的 实施方案中，R₁和R₂独立地包含席夫碱。在某些情形下，R₁和R₂独立 地为肟连接、酰肼连接或肼硫代酰胺连接。在一些情形下，L为肽、水溶 性聚合物、可检测的标签或聚糖。

还包括制备p97多肽的方法，包括：a)培养表达引入的多核苷酸的宿 主细胞，其中所述引入的多核苷酸编码权利要求20所述的p97多肽，并 且其中所述宿主细胞表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE)，该酶转化Z₁为甲酰 甘氨酸(FGly)残基；和b)从所述细胞分离97多肽。在一些实施方案中， p97多肽包含：(i)至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨基酸，或(ii)至 少一个带有炔烃侧链的非天然氨基酸。

某些实施方案涉及缀合物，其包含结构(I)或(II)：

其中R为p97多肽，并且R′为抗体或其抗原结合片段；或者其中R 为抗体或其抗原结合片段，并且R′为p97多肽。在一些实施方案中，所 述抗体特异性结合人Her2/neu蛋白、或本文描述的其他细胞表面蛋白或 癌症相关的抗原。具体实例包括：Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗 原、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、 IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)VEGFR-1、 VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、 CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、 NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲 胎蛋白、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原 (CEA)、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸盐受体1、跨膜糖蛋白NMB、成 纤维细胞活化蛋白、α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或 CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、 TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或 TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B-细胞活 化因子(BAFF)、血小板来源的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、 程序性死亡-1、蛋白二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列 腺酸磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(一种表达于神经外胚层起源的肿瘤上 的双唾液酸神经节苷酯)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。

在具体的实施方案中，抗体为曲妥珠单抗、3F8、阿巴伏单抗、阿德 木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔、阿泊珠 单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、莫-比伐珠单 抗、贝伦妥单抗-维多汀、莫-坎妥珠单抗、拉-坎妥珠单抗、卡罗单抗-喷 地肽、卡妥索单抗、西妥昔单抗、泊-西他珠单抗、西妥木单抗、clivatuzumab (tetraxetan)、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠单抗、地莫单抗、drozitumab、 依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、enavatuzumab、恩司昔单抗、依 帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法勒珠单抗、FBTA05、芬妥木单 抗、flanvotumab、加利昔单抗、吉妥珠单抗、ganitumab、吉妥珠单抗- 奥佐米星、吉瑞昔单抗、格莱木单抗-维多汀、替-伊莫单抗、icrucumab、 伊戈伏单抗、拉-英达西单抗、英妥木单抗、伊珠单抗-奥佐米星、伊匹木 单抗(MDX-101)、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、 莫-洛伏珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米 拉珠单抗、米妥莫单抗、莫加珠单抗、moxetumomab(pasudotox)、他那 可单抗、他那莫单抗、narnatumab、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、nivolumab、 (具有或没有放射性碘)、NR-LU-10、奥法木单抗、 olaratumab、奥纳珠单抗、莫奥珠单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、帕曲土 单抗、pemtumomab、培妥珠单抗、普立木单抗、雷妥莫单抗、radretumab、 雷莫芦单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、奥马珠单抗、西 罗珠单抗、司妥昔单抗、tabalumab、帕-他莫单抗、替妥莫单抗、替妥木 单抗、TGN1412、替西木单抗、曲美木单抗、替加珠单抗、TNX-650、 托西莫单抗、TRBS07、西莫白介素单抗、ublituximab、乌瑞鲁单抗、维 妥珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥昔单抗或扎芦木单抗或其抗原结合片段。

还包括制备p97-抗体缀合物的方法，包括：(a)在以下物质间进行叠 氮化物-炔烃环加成反应：(i)包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨 基酸的p97多肽与包含至少一个带有炔烃侧链的非天然氨基酸的抗体或 其抗原结合片段；或(ii)包含至少一个带有炔烃侧链的非天然氨基酸的p97 多肽与包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨基酸的抗体或其抗原 结合片段；和(b)从反应物分离p97-抗体缀合物，从而制得p97-抗体缀合 物。

参考以下详细说明和附图后本发明的这些和其他方面将会变得明 显。本文中公开的所有参考文献在此都通过引用整体并入本文，就像每 篇单独并入一样。

附图说明

图1A-1D显示了人乳腺癌细胞系BT474的细胞活力检测的结果。

图2A-2D显示了人乳腺癌细胞系MCF7-HER2的细胞活力检测的结 果。

图3A-3D显示了人乳腺癌细胞系MCF7-载体的细胞活力检测的结 果。

图4A-4D显示了人乳腺癌细胞系SKBR3的细胞活力检测的结果。

图5A-5D显示了小鼠脑组织中若丹明(rhod)标记的蛋白的生物分布。 在这些图中，“MTF”为p97，“BTA”为曲妥珠单抗，并且“MTF-BTA”为 p97-曲妥珠单抗缀合物。

图6A-6F显示了静脉内给予后24小时小鼠脑内¹²⁵I标记的曲妥珠单 抗的分布。图6A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转移，并且图6B 显示了所述转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图6C显示了¹²⁵I标记的曲妥 珠单抗的放射自显影图，并指示相对于周围的正常脑组织，抗体内的倍 数增加。如图6F中所显示，正常脑组织中曲妥珠单抗单独的K_in值为约 1.46x10^-7mL/sec/g，而脑转移中约3.8x10^-7mL/sec/g。

图7A-7E显示了静脉内给予后24小时小鼠脑和其他组织中¹²⁵I标记 的曲妥珠单抗的分布。图7A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转移， 并且图7B显示了所述转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图7C显示了¹²⁵I 标记的曲妥珠单抗的放射自显影图，并指示相对于周围的正常脑组织， 抗体内的倍数增加。图7D显示了不同组织中¹²⁵I标记的曲妥珠单抗的组 织与血液比率，并且图7E显示了正常脑组织和脑转移(Mets)中的分布。

图8A-8F显示了静脉内给予后2小时小鼠脑和其他组织中¹²⁵I标记 的p97-曲妥珠单抗的分布。图8A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转 移，并且图8B显示了所述转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图8C显示了 ¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的放射自显影图，并且图8C的左侧指 示了每个转移中发现的缀合物的量(ng/g)。图8B的左侧显示了相对于图 8A中显示的脑部远离肿瘤(BDT)区，每个转移中发现的p97-曲妥珠单抗 缀合物的倍数增加。图8D显示了多种组织的p97-曲妥珠单抗缀合物的组 织/血液比率。图8E显示了正常脑/血液和脑转移/血液中p97-曲妥珠单抗 缀合物的比率。图8F概述了单个脑转移中发现的¹²⁵I标记的p97-曲妥珠 单抗缀合物的浓度。

图9A-9F显示了静脉内给予后8小时小鼠脑和其他组织中¹²⁵I标记 的p97-曲妥珠单抗的分布。图9A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转 移，并且图9B显示了所述转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图9C显示了 ¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的放射自显影图，并且图9C的左侧指 示每个转移中发现的缀合物的量(ng/g)。图9B的左侧显示了相对于图9A 中显示的脑部远离肿瘤(BDT)区，每个转移中发现的p97-曲妥珠单抗缀合 物的倍数增加。图9D显示了多种组织的p97-曲妥珠单抗缀合物的组织/ 血液比率。图9E显示了正常脑/血液和脑转移/血液中p97-曲妥珠单抗缀 合物的比率。图9F概述了单个脑转移中发现的¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单 抗缀合物的浓度。

图10A-10E概述了静脉内给予¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物后2 小时和8小时的数据。图10A显示了多种组织的p97-曲妥珠单抗缀合物 的组织/血液比率。图10B表明在8小时的时间点正常脑组织中缀合物的 水平稍微偏高(相对于2小时的时间点)，并且在相同时间点脑转移中缀合 物的水平显著偏高。图10C显示了正常脑组织(1.1x10^-4mL/sec/g)和脑转 移(4.9x10^-4mL/sec/g)中测得的p97-曲妥珠单抗缀合物的K_in值。图10D显 示了在2小时和8小时的时间点脑组织中注射剂量的百分比，并且图10E 概述了给予后2小时和8小时单个脑转移中¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀 合物的浓度。

图11A和11B显示了p97-西妥昔单抗缀合物的HPLC分析。图11A 显示了粗制反应混合物在室温下反应24小时后的HPLC谱图，并且图11B 显示了纯化的1:1p97-西妥昔单抗缀合物(>96%纯度，220nm下HPLC检 测)的大小排阻HPLC谱图。

图12显示了相对于粗制反应混合物和单独的p97和西妥昔单抗，纯 化的p97-西妥昔单抗缀合物的SDS-PAGE分析。

序列表说明

SEQ ID NO:1为人p97黑素转铁蛋白(melanotransferrin) (NP_005920.2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2为人Her2/neu蛋白(NP_004439.2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3为编码SEQ ID NO:1的多肽序列的核酸序列。

SEQ ID NO:4为编码SEQ ID NO:2的多肽序列的核酸序列。

SEQ ID NOS:5和6为肽硫酸酯酶模体。

SEQ ID NOS:8-14为肽连接子。

SEQ ID NO:15为人Her1/表皮生长因子受体(EGFR)的氨基酸序列。

发明详述

本发明总体涉及包含连接至抗体或其抗原结合片段的p97多肽序列 的缀合物分子。还包括包含p97多肽序列和抗体或其抗原结合片段的组 合物，如基于颗粒的组合物，例如，脂质体。本发明的p97多肽序列可 以缀合至或由任何抗体或其抗原结合片段组成，包括治疗性和诊断性抗 体。某些治疗性和/或诊断性抗体或其抗原结合片段特异性结合细胞表面 蛋白，如细胞表面受体。

在特定的实施方案中，抗体或片段特异性结合人Her2/neu蛋白。如 本文中所示，曲妥珠单抗(商品名)，一种临床上应用于治疗 HER2+乳腺癌的人源化单克隆抗体，被化学连接至p97多肽序列上以产 生p97-抗体缀合物。出乎意料地，相比单独的曲妥珠单抗，p97-抗体缀 合物展现显著改进的癌症杀伤活性。此外，正如期望的，结果确认曲妥 珠单抗在培养中不进入人脑内皮(HBE)细胞。然而，在p97-抗体缀合物的 情形下，存在显著的缀合物被运输进入HBE细胞，表明缀合物具有进入 脑组织的潜力。相对于仅递送p97和仅递送曲妥珠单抗，p97和曲妥珠单 抗组合为蛋白缀合物还协同增加了穿透血脑屏障到达脑实质组织的递 送。基于这些意想不到的发现，本发明提供了用于改进表达Her-2/neu的 癌症，包括那些与至CNS的转移相关的癌症的治疗的组合物和方法。本 发明还提供了用于改进其他类型的癌症，尤其是与可被抗体治疗靶向的 至少一种抗原相关的那些癌症的治疗的p97-抗体缀合物、组合物和相关 的方法。

除非明确指出与之相反，本发明的实施将会采用本领域技术内的病 毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其 中许多在下文中都有描述以用于说明目的。此类技术在文献中有充分的 解释。见，例如，Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols  in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009);Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995; Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd  Edition,2001);Maniatis et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1982);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.); Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B. Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames &S.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986); Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)，以及其他类似参考 文献。

如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个(a)”、“一个 (an)”和“所述(the)”包括复数指称，除非上下文另有明确说明。

在本说明书通篇中，除非上下文另有要求，单词“包括(comprise)”或 者变形如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应当理解为意指包括陈 述的要素或整数或者要素或整数的组，但不排除任何其他要素或整数或 者要素或整数的组。

除非另有明确说明，本说明书中的每个实施方案加上必要的修改即 可用于所有其他实施方案。

可以将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例 如，电穿孔、脂质转染)。可以根据制造商的说明书或者按本领域通常完 成的或本文所描述的进行酶促反应和纯化技术。通常可以根据本领域熟 知的常规方法和本说明书通篇中引用和讨论的各种通用的和更具体的参 考文献中描述的方法进行这些和相关的技术和方案。除非提供了具体的 定义，与本文描述的分子生物学、分析化学、合成有机化学和医疗及药 物化学相关而使用的术语及其实验方案和技术是本领域熟知并通常使用 的那些。可以将标准技术用于重组技术、分子生物合成、微生物合成、 化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，以及患者治疗。

可以利用技术人员已知的多种方法，包括例如，亲和/结合测定(例如， 表面等离子体共振、竞争性抑制测定)；利用体外或体内模型的细胞毒性 测定、细胞活力检测、细胞增殖或分化测定、癌症细胞和/或肿瘤生长抑 制，评估本文描述的p97-抗体缀合物的功能性特性。其他测定可以测试 本文描述的缀合物阻止正常Her2/neu介导的应答的能力。还可以测试本 文描述的缀合物对受体内化、体外和体内功效等的影响。可以利用技术 人员已知的早已确立的方案(见例如，Current Protocols in Molecular  Biology(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY); Current Protocols in Immunology(由John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek, David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober2001John Wiley& Sons编辑,NY,NY)或可商购的试剂盒进行此类测定。

P97多肽序列

如上所示，本发明的示例性缀合物分子和组合物包含p97多肽序列。 术语“多肽”用于其常规含义，即用作氨基酸序列。多肽不局限于特定长 度的产物；因此，除非另有明确说明，肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定 义内，并且此类术语在本文中可互换使用。该术语也不涉及或排除多肽 的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及天然存在的和 非天然存在的本领域已知的其他修饰。多肽可以为完整蛋白或其亚序列。

在某些具体的实施方案中，用于本发明的缀合物中的p97多肽序列 包含SEQ ID NO:1所示的人p97序列。

在其他具体的实施方案中，用于本发明的缀合物的p97多肽序列包 含沿其长度与SEQ ID NO:1所示人p97序列具有至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。

在进一步的其他具体实施方案中，用于本发明的缀合物的p97多肽 序列包含SEQ ID NO:1所示的人p97序列的片段，例如，其中所述片段 包含SEQ ID NO:1所示人p97序列的至少约10、20、30、40、50、60、 70、80、90或100个或更多个连续的氨基酸，包括所有中间长度。

在其他具体的实施方案中，用于本发明的缀合物的p97多肽序列包 含SEQ ID NO:1所示人p97序列的片段，其中所述片段由SEQ ID NO:1 所示人p97序列的不多于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 个或更多个连续的氨基酸组成，包括所有中间长度。

在进一步的其他具体实施方案中，用于本发明的缀合物的p97多肽 序列包含SEQ ID NO:1所示人p97序列的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:1所示人p97序列的约20-500、20-400、20-300、20-200、20-100 或20-50个连续的氨基酸。

在某些其他的实施方案中，目标p97多肽序列为可有效运输抗 -Her2/neu抗体穿透血脑屏障的p97的氨基酸亚序列和变体。

在其他具体的实施方案中，用于缀合物中的p97多肽序列为p97多 肽的可溶形式(例如，Yang et al.,Prot Exp Purif.34:28-48,2004)，或者其 片段或变体。在一些方面，所述p97多肽具有疏水结构域(SEQ ID NO:1 的残基710-738)的全部或部分缺失，该缺失单独存在或与信号肽(SEQ ID  NO:1的残基1-19)的全部或部分缺失联合。在具体的方面，所述p97多 肽包含或由SEQ ID NO:1的残基20-711组成，包括其变体和片段。

在某些其他实施方案中，用于本发明的缀合物的p97片段或变体为 能结合p97受体、LRP1受体和/或LRP1B受体的片段或变体。

应当理解，缀合物还可以包含与p97和存在的抗-Her2/neu抗体序列 不相关的其他氨基酸。

p97多肽序列还可以为p97多肽序列变体。如本文使用的术语p97多 肽“变体”，为通常与本文中具体公开的p97多肽以一个或多个取代、缺 失、添加和/或插入而不同的多肽。此类变体可以为天然存在的或可以为 合成产生的，例如，通过修饰一种或多种本发明的上述多肽序列，并按 本文所述评估它们的活性和/或使用本领域熟知的多种技术中的任何一 种。

在许多情形下，变体含有保守取代。“保守取代”为其中一个氨基酸 被取代为具有相似性能的另一氨基酸的取代，从而肽化学领域技术人员 可以预测到多肽的二级结构和亲水性质基本未变。如上所述，可以在本 发明的多核苷酸和多肽结构内进行修饰，并仍然获得编码具有所期望特 性的多肽变体或衍生物的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列来产 生本发明多肽的等价物或者甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员 通常改变根据表1的编码DNA序列的一个或多个密码子。

例如，可以在蛋白结构中将某些氨基酸取代为其他氨基酸，而不明 显失去与诸如抗体的抗原结合区域或基质分子上的结合位点的结构进行 互作(interactive)结合的能力。由于蛋白的互作能力和性质限定了蛋白的 生物功能活性，可以在蛋白序列以及，当然，其潜在的DNA编码序列中 进行某些氨基酸序列取代，并仍然得到具有相似性能的蛋白。因此预测， 可以在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中进行不 同的改变，而明显失去它们的效力。

表1

在进行此类改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数 在赋予蛋白互作的生物功能中的重要性通常为本领域所理解(Kyte& Doolittle,1982,通过引用并入本文)。公认氨基酸的相对亲水特性有助于 所得蛋白的二级结构，其反过来限定了蛋白与其他分子，例如，酶、基 质、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。每种氨基酸基于其疏水性 和电荷特性都被赋予一个亲水指数(Kyte&Doolittle,1982)。这些值为： 异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨 酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸 (–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨 酸(–3.2)；谷氨酸盐(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸盐(–3.5)；天冬酰胺 (–3.5)；赖氨酸(–3.9)和精氨酸(–4.5)。

本领域已知，某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或评分的其他氨 基酸取代，并仍然产生具有类似生物活性的蛋白，即仍然得到生物功能 等价的蛋白。在进行此类改变中，亲水指数位于±2内的氨基酸取代是优 选的，位于±1内的氨基酸取代是特别优选的，并且位于±0.5内的氨基酸 取代是甚至更特别优选的。本领域还理解，可以基于亲水性有效进行相 似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(特别通过引用整体并入本文)，陈 述了受其邻近氨基酸亲水性支配的蛋白的最大局部平均亲水性，与该蛋 白的生物性质相关。

如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值被赋予氨基酸残基： 精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)； 丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(–0.4)； 脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；组氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨 酸(–1.3)；缬氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；异亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)； 苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。应当理解，可以将氨基酸取代为具有类似 亲水性值的另一氨基酸，并仍然得到生物等价且具体而言免疫学上等价 的蛋白。在此类改变中，亲水性值位于±2内的氨基酸取代是优选的，位 于±1内的氨基酸取代是特别优选的，并且位于±0.5内的氨基酸取代是甚 至更特别优选的。

如上文所概述，因此氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对 相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。将各种前述特 性考虑在内的示例性取代为本领域技术人员熟知，并且包括：精氨酸与 赖氨酸；谷氨酸盐与天冬氨酸盐；丝氨酸与苏氨酸；谷氨酰胺与天冬酰 胺；以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。

还可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲 性的相似性进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和 谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似的亲水性值 的带有不带电荷极性头基团的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸； 甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨 酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其他氨基酸群组包括：(1)ala、pro、 gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、 leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还 可以，或可选地，含有非保守改变。在优选的实施方案中，变体多肽通 过取代、缺失或添加5个氨基酸或更少氨基酸不同于天然序列。还可以(或 可选地)通过，例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质影响最小的 氨基酸的缺失或添加来修饰变体。

如上所示，蛋白N末端的多肽可以包含信号(或前导)序列，其通过 共翻译或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以缀合至连接子或其他序 列上，以便于多肽(例如，聚-His)的合成、纯化或鉴定，或者用来增加多 肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以缀合至免疫球蛋白Fc区。

可以利用多种熟知的合成和/或重组技术中的任何一种制备本发明的 多肽，其中后者在下文有进一步描述。可以通过合成方式，利用本领域 技术人员熟知的技术产生通常少于约150个氨基酸的多肽、部分或其他 变体。在一个示例性实例中，利用任何可商购的固相技术，如Merrifield 固相合成法合成此类多肽，在所述Merrifield固相合成法中，氨基酸被顺 序加至生长的氨基酸链上。见Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-46 (1963)。用于多肽自动合成的设备可从供应商如Perkin Elmer/Applied  BioSystems Division(Foster City,CA)购得，并且可以根据制造商的说明书 操作。

一般来说，本发明的多肽组合物(包括融合多肽)为分离的。“分离的” 多肽是被从其原始环境去除的多肽。例如，如果其从天然系统中一些或 所有共存的材料中分离，则天然存在的蛋白或多肽为分离的。优选地， 此类多肽还是纯化的，例如，为至少约90%纯的，更优选至少约95%纯 的，并且更优选至少约99%纯的。

当比较多肽或多核苷酸序列时，如果两条序列中的核苷酸或氨基酸 序列在按下文所述比对最大一致性时是相同的，则两条序列被说成是“相 同的”。通常通过在比较窗(comparison window)上比较序列来进行两条序 列间的比较，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。如本文使用的“比较 窗”是指至少约20个连续位置，通常30至约75个、40至约50个连续位 置的片段，其中可以在将两条序列最优比对后将序列与具有相同数目的 连续位置的参考序列比较。

可以利用生物信息学软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)的 Lasergene软件包中的Megalign程序，使用默认参数进行用于比较的序列 的最优比对。该程序包含几种描述于以下参考文献中的比对方案：Dayhoff, M.O.,A model of evolutionary change in proteins–Matrices for detecting  distant relationships(1978).Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5, supp.3,pp.345-58(Dayhoff,M.O.,ed.);Hein J.,Methods in Enzymology 183:626-45(1990);Higgins et al.,CABIOS5:151-53(1989);Myers et al., CABIOS4:11-17(1988);Robinson,E.D.,Comb.Theor11:105(1971);Saitou  et al.,Mol.Biol.Evol.4:406-25(1987);Sneath et al.,Numerical Taxonomy– the Principles and Practice of Numerical Taxonomy(1973);Wilbur et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-30(1983)。

可选地，可以通过Smith et al.,Add.APL.Math2:482(1981)的局部同 一性算法、通过Needleman et al.,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对 算法、通过Pearson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似 性搜索法，通过计算机运行这些算法(Wisconsin Genetics Software Package 中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer  Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)或通过目测，进行用于比较的 序列最优比对。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例 为BLAST和BLAST2.0算法，其分别被描述于Altschul et al.,Nucl.Acids  Res.25:3389-3402(1977)和Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990) 中。例如可利用本文描述的参数使用BLAST和BLAST2.0确定本发明的 多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。进行BLAST分析的软件可通过美 国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnolgoy Informationis) 公开获取。对于氨基酸序列，可以利用打分矩阵来计算累积得分。在以 下情况时停止每个方向的字符匹配(word hits)延伸：当累积比对得分从其 最大达到的值下降了量X时；由于一个或多个负分残基比对的累积而使 累积评分趋于0或低于0时；或达到任一序列的末端时。BLAST算法参 数W、T和X决定了所述比对的灵敏度和速度。

在一种优选的方法中，通过在具有至少20个位置的比较窗上比较两 条最优比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中，相比用于两条序 列的最优比对的参照序列(其不包含添加或缺失)，在比较窗中的多肽或多 核苷酸序列部分可以包含20%或更少的、通常为5%至15%、或10%至 12%的添加或缺失(即，空位)。通过以下来计算百分比：确定在两个序列 中都存在的相同氨基酸或核酸残基的位置数量来产生匹配位置数，将匹 配位置数除以参照序列中的总位置数(即窗的大小)，并且将结果乘以100 以产生序列同一性百分比。

抗体

用于本发明的缀合物或组合物中的抗体或抗原结合片段基本上可以 为任何类型。具体实例包括治疗性和诊断性抗体。如本领域所熟知，抗 体是能通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个表位识别位点而特异 性结合靶标(如碳水化合物、多肽、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如 本文中所使用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其 片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然 存在的变体、包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋 白、人源化的抗体、嵌合的抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合 位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。通 过基因融合构建的“双抗体”、多价或多特异性片段(WO94/13804;P. Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993)也是本文中 包括的(contemplated)抗体的特定形式。包含结合至CH3结构域的scFv 的小抗体也包括在本文中(S.Hu et al.,Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。 见例如，Ward,E.S.et al.,Nature341,544-546(1989);Bird et al.,Science, 242,423-426,1988;Huston et al.,PNAS USA,85,5879-5883,1988); PCT/US92/09965;WO94/13804;P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA906444-6448,1993;Y.Reiter et al.,Nature Biotech,14,1239-1245, 1996;S.Hu et al.,Cancer Res.,56,3055-3061,1996。

如本文中使用的术语“抗原结合片段”是指含有结合目标抗原例如人 Her2/neu蛋白的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。 就这一点而言，本文中描述的抗体的抗原结合片段可以包含来自结合治 疗性或诊断性靶标如人Her2/neu的抗体的VH和VL序列的1、2、3、4、 5或所有6个CDRs。

术语“抗原”是指能被选择性结合剂如抗体结合的分子或分子部分， 且还能用于动物中以制备能结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一 个或多个表位。

术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何决定 子，优选多肽决定子。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案 中，表位决定子包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基分子的化学 活性表面组群，并且在某些实施方案中可以具有特定三维结构特性和/或 特定电荷特性。在某些实施方案中，当其在蛋白和/或大分子复合混合物 中优先识别其靶抗原时，抗体被说成特异性结合抗原。当平衡解离常数 为≤10^-7或10^-8M时，抗体被说成特异性结合抗原。在一些实施方案中， 平衡解离常数可为≤10^-9M或≤10^-10M。

在某些实施方案中，如本文描述的抗体及其抗原结合片段包括重链 和轻链CDR集合，它们分别插入为CDRs提供支持并确定CDRs相对于 彼此的空间关系的重链和轻链骨架区(FR)集合之间。如本文中所使用， 术语“CDR集合”是指重链或轻链V区的3个高变区。从重链或轻链的N 端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原 结合位点包含6个CDRs，包括来自每个重链和轻链V区的CDR集合。 包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分 子识别单位”。众多抗原-抗体复合物的晶体学分析证明，CDRs的氨基酸 残基与所结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链 CDR3。因此，分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。

如本文中所使用，术语“FR集合”是指构成重链或轻链V区的CDR 集合的CDRs的4条侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触所结合的抗 原；然而，FRs主要负责将V区折叠成抗原结合位点，尤其是直接邻近 CDRs的FR残基。在FRs中，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度 保守的。就这一点而言，所有V区序列都含有约90个氨基酸残基的内部 二硫环。当V区折叠成结合位点时，CDRs展现为突出的环模体，其形 成抗原结合表面。通常认为存在FRs的保守结构区域，其影响CDR环折 叠成某些“典型”结构的形状—与CDR的精确氨基酸序列无关。另外，已 知某些FR残基参与非共价结构域间的接触，其稳定了抗体重链和轻链的 相互作用。

可以通过参考Kabat,E.A.et al.,Sequences s of Proteins of  Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human  Services.1987及其更新(现在可在因特网(immuno.bme.nwu.edu)上获得)确 定免疫球蛋白可变区的结构和位置。

“单克隆抗体”是指这样的均质抗体群，其中单克隆抗体由涉及表位 的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体是 高度特异性的，其针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单 克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、 单链(ScFv)、其变体、包含抗原结合部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗 体、嵌合的单克隆抗体以及包含具有所需特异性和结合表位能力的抗原 结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。其不试 图限制为关于抗体来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体挑选、 重组表达、转基因动物等)。该术语包括在“抗体”定义下的上述完整免疫 球蛋白以及片段等。

蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子而产生几个片段，其中两 个(F(ab)片段)各自包含含有完整的抗原结合位点的共价异质二聚体。胃蛋 白酶能切割IgG分子而提供几个片段，包括包含两种抗原结合位点的 F(ab')₂片段。可以通过蛋白水解优先切割IgM，极少情况下优先切割IgG 或IgA免疫球蛋白分子，以制备用于根据本发明的某些实施方案的Fv片 段。然而，Fv片段更通常源自利用本领域已知的重组技术。Fv片段包含 非共价V_H::V_L异质二聚体，其包含保留了天然抗体分子的大部分抗原识 别和结合能力的抗原结合位点。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci. USA69:2659-2662;Hochman et al.(1976)Biochem15:2706-2710;和 Ehrlich et al.(1980)Biochem19:4091-4096。

在某些实施方案中，包括单链Fv或scFV抗体。例如，可以利用标 准分子生物学技术，根据本申请关于挑选具有所需特异性的抗体的教导 制备κ抗体(III et al.,Prot.Eng.10:949-57(1997)；小抗体(Martin et al., EMBO J13:5305-9(1994)；双抗体(Holliger et al.,PNAS90:6444-8(1993)； 或Janusins(Traunecker et al.,EMBO J10:3655-59(1991)和Traunecker et  al.,Int.J.Cancer Suppl.7:51-52(1992)。

单链Fv(sFv)多肽是共价连接的V_H::V_L异质二聚体，其从包含通过 编码肽的连接子连接的V_H-和V_L-编码基因的基因融合物表达而来。 Huston et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16):5879-5883。已经描述 了多种识别用于将来自抗体V区的天然聚积(但化学分离)的轻和重多肽 链转化为sFv分子的化学结构的方法，所述sFv分子将折叠成与抗原结 合位点的结构基本上类似的三维结构。见，例如，Huston et al.的第 5,091,513号和第5,132,405号美国专利；以及Ladner et al的第4,946,778 号美国专利。

在某些实施方案中，如本文描述的抗体为双抗体形式。双抗体为多 肽的多聚体，每种多肽都包含含有免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域 和含有免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，这两个结构域(例如通过 肽连接子)被连接但不能与彼此结合来形成抗原结合位点：抗原结合位点 是通过将多聚体内一种多肽的第一结构域与多聚体内另一多肽的第二结 构域结合形成(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH结构域构成(Ward,E. S.et al.,Nature341,544-546(1989))。

如果要使用双特异性抗体，则这些可以为常规双特异性抗体，其可 以通过多种方式制得(Holliger,P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol. 4,446-449(1993))，例如化学制备或从杂交的杂交瘤制备，或可以为任何 以上提及的双特异性抗体片段。可以仅使用可变区构建不含Fc区的双抗 体和scFv，潜在地减少抗独特型反应(anti-idiotypic reaction)的效应。

双特异性双抗体，与双特异性全抗体相反，也可能是特别有用的， 因为它们可以在大肠杆菌(E.coli.)中容易地构建和表达。可以使用噬菌体 展示(WO94/13804)从文库容易地挑选具有合适结合特异性的双抗体(及 许多其他多肽如抗体片段)。如果双抗体的一只臂要保持恒定，例如，具 有针对抗原X的特异性，则可以制备另一只臂为变化的并且具有所选的 合适特异性的抗体的文库。可以通过杵臼结构(knobs-into-holes)改造制备 双特异性全抗体(J.B.B.Ridgeway et al.,Protein Eng.,9,616-621,1996)。

在某些实施方案中，可以用的形式提供本文描述的抗体。 是去除了铰链区的IgG4抗体(见GenMab Utrecht,The  Netherlands;还见，例如，US20090226421)。该抗体技术制备稳定、较小 的抗体形式，其具有比当前小抗体形式预期更长的治疗窗。IgG4抗体被 认为是惰性的，因此不与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体铰链区 修饰全人IgG4抗体来得到相对于相应的完整IgG4(GenMab,Utrecht)具 有不同稳定性的半分子片段。将IgG4分子二等分使得在上仅 留有一个可以结合同源抗原(例如，疾病靶标)的区域，因此使得单价结合靶细胞上的仅一个位点。对于某些癌症细胞表面抗原，该单价 结合不会如使用具有相同抗原特异性的二价抗体可以见到的那样刺激癌 症细胞生长，因此技术可为用常规抗体可能难以治疗的一些类 型癌症提供治疗选择。在治疗一些形式的癌症时，小型可以带 来极大的好处，其允许所述分子更好地分布于整个较大实体瘤，从而潜 在地增加功效。

在某些实施方案中，本公开的抗体可以采用纳米抗体形式。纳米抗 体由单基因编码，并可在几乎所有的原核和真核宿主中有效制备，例如， 大肠杆菌(见例如第6,765,087号美国专利)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus) 或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母 属(Kluyvermyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)(见例如 第6,838,254号美国专利)。所述制备方法是可扩展的，并且已经制备了数 千克量的纳米抗体。可以将纳米抗体制成具有长保质期的即用型溶液。 所述纳米克隆方法(见，例如，WO06/079372)是用于基于自动化高通量筛 选B-细胞产生针对期望靶标的纳米抗体的专利方法。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指通 常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来源于来自非人物种的免疫球 蛋白的抗原结合位点，并且该分子的其余免疫球蛋白结构基于人免疫球 蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定区上的完整可 变区或仅包含可变区内接枝到合适骨架区上的CDRs。表位结合位点可以 为野生型或通过一种或多种氨基酸取代修饰。这消除了作为人个体内的 免疫原的恒定区，但保留了对外来可变区起免疫反应的可能性(LoBuglio, A.F.et al.,(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:4220-4224;Queen et al., PNAS(1988)86:10029-10033;Riechmann et al.,Nature(1988) 332:323-327)。抗体人源化的示例性方法包括第7,462,697号美国专利中 描述的方法。

另一方法不仅专注于提供源自人的恒定区，还专注于修饰可变区以 便将它们改造为尽可能接近人形式。已知重链和轻链的可变区都含有3 个互补性决定区(CDRs)，其对考虑中的表位的响应不同并决定结合能力， 其侧接有在给定物种中相对保守并推测为CDRs提供支架的4个骨架区 (FRs)。当针对特定表位制备非人抗体时，可以通过接枝源自存在于待修 饰的人抗体中FRs上的非人抗体的CDRs来“改造”或“人源化”可变区。 Sato,K.,et al.,(1993)Cancer Res53:851-856.Riechmann,L.,et al.,(1988) Nature332:323-327;Verhoeyen,M.,et al.,(1988)Science239:1534-1536; Kettleborough,C.A.,et al.,(1991)Protein Engineering4:773-3783;Maeda, H.,et al.,(1991)Human Antibodies Hybridoma2:124-134;Gorman,S.D.,et  al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:4181-4185;Tempest,P.R.,et al., (1991)Bio/Technology9:266-271;Co,M.S.,et al.,(1991)Proc Natl Acad  Sci USA88:2869-2873;Carter,P.,et al.,(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289;和Co,M.S.et al.,(1992)J Immunol148:1149-1154报导了 将该方法应用于不同抗体。在一些实施方案中，人源化的抗体保留了所 有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有6个CDRs的人源化小鼠抗 体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有一个或多个CDRs(1、2、3、4、 5、6个)，其针对原始抗体进行了改造，其也称为“来源于”一个或多个来 自原始抗体的CDRs的一个或多个CDRs。

在某些实施方案中，本发明的抗体可以为嵌合的抗体。就这一点而 言，嵌合的抗体由抗体的抗原结合片段组成，所述抗原结合片段可操作 地连接或以其他方式融合至不同抗体的异源Fc部分。在某些实施方案中， 异源Fc结构域为人源的。在其他实施方案中，异源Fc结构域可以源自 来自亲本抗体的不同Ig类，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、 IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)及IgM。在其他实施方案中， 异源Fc结构域可以由来自一种或多种不同Ig类的CH2和CH3结构域组 成。如上关于人源化抗体所示，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包含本 文描述的抗体的一个或多个CDRs(例如，本文描述的抗体的1、2、3、4、 5或6个CDRs)，或可以包含整个可变域(VL、VH或两者)。

“特异性结合”或“优先结合”(本文中可互换使用)抗体或多肽的表位 是本领域熟知的术语，并且测定此类特异性或优先结合的方法也为本领 域所熟知。

如果相比与替代性细胞或物质的反应或结合，其与特定细胞或物质 的反应或结合更频繁、更快速且具有更长的持续时间和/或更大的亲和力， 则将该分子说成是展现“特异性结合”或“优先结合”。如果相比其结合其 他物质，抗体以更大的亲和力、亲和性、更容易地，和/或以较长的持续 时间结合，则抗体“特异性结合”或“优先结合”靶标。例如，特异性或优先 结合特定表位的抗体为，相比其结合其他表位，以更大的亲和力、亲和 性、更容易地，和/或以更长的持续时间结合该特定表位的抗体。通过阅 读该定义也可以理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分 或表位)可以或不可以特异性或优先结合第二靶标。鉴于此，“特异性结合” 或“优先结合”不一定要求(尽管其可以包括)专一性结合。通常，但不一定， 提及结合就指优先结合。

免疫结合通常指在免疫球蛋白分子和对该免疫球蛋白具有特异性的 抗原之间发生的非共价相互作用类型，例如通过示例性但非限制性的方 式来说，由于静电、离子、亲水和/或疏水吸引或排斥、空间力、氢键、 范德瓦耳斯力和其他相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以 用相互作用的解离常数(K_d)的形式表达，其中较小的K_d表示较大的亲和 力。可以使用本领域熟知的方法定量所选多肽的免疫结合性能。一种此 类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些 速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向上同等 影响所述速率的几何参数。因此，可以通过计算结合和解离的浓度和实 际速率测定“结合速率常数”(K_on)和“解离速率常数”(K_off)。K_off/K_on比率 使得能够消除所有与亲和力不相关的参数，并因此等于解离常数K_d。通 常参见Davies et al.(1990)Annual Rev.Biochem.59:439-473。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合癌症相关的 抗原或癌症抗原。示例性癌症抗原包括细胞表面蛋白如细胞表面受体。 癌症相关的抗原还包括结合此类细胞表面蛋白或受体的配体。在具体的 实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合细胞内癌症抗原。

在一些实施方案中，与癌症抗原相关的癌症为以下的一种或多种： 乳腺癌、转移性脑癌、前列腺癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、头 颈癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、鳞状细胞癌、CNS或脑癌、 黑色素瘤、非黑色素瘤癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、上皮性肿瘤、骨癌 或造血系统癌症。

在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合选自以下的 至少一种：癌症抗原人Her2/neu、Her1/EGF受体、Her3、A33抗原、CD5、 CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、 血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、 CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、 CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波 形蛋白、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因 子-1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、整合素α_vβ₃、整合 素α₅β₁、叶酸盐受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、 糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前 列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子 受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7 (SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B-细胞活化因子(BAFF)、血小板来源的生 长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白二硫键异构 酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2 (一种表达于神经外胚层起源的肿瘤上的双唾液酸神经节苷酯)、磷脂酰肌 醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。

在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人 Her2/neu蛋白。基本上任何抗-Her2/neu抗体、抗原结合片段或其他 Her2/neu-特异性结合剂都可以用于制备本发明的p97-抗体缀合物。示例 性抗-Her2/neu抗体描述于，例如，第5,677,171号；第5,720,937号；第 5,720,954号；第5,725,856号；第5,770,195号；第5,772,997号；第6,165,464 号；第6,387,371号；及第6,399,063号美国专利中，其内容通过引用整 体并入本文。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合人 Her1/EGFR(表皮生长因子受体)。基本上任何抗-Her1/EGFR抗体、抗原 结合片段或其他Her1-EGFR-特异性结合剂都可以用于制备本发明的p97- 抗体缀合物。示例性抗-Her1/EGFR抗体描述于，例如，第5,844,093号； 第7,132,511号；第7,247,301号；第7,595,378号；第7,723,484号；第 7,939,072号；及第7,960,516号美国专利中，其内容通过引用整体并入本 文。

在某些实施方案中，抗体为抗癌治疗抗体，包括示例性抗体如：3F8、 阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、 阿麦妥昔、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐 单抗、莫-比伐珠单抗、贝伦妥单抗-维多汀、莫-坎妥珠单抗、拉-坎妥珠 单抗、卡罗单抗-喷地肽、卡妥索单抗、西妥昔单抗、泊-西他珠单抗、西 妥木单抗、clivatuzumab(tetraxetan)、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠 单抗、地莫单抗、drozitumab、依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、 enavatuzumab、恩司昔单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法 勒珠单抗、FBTA05、芬妥木单抗、flanvotumab、加利昔单抗、吉妥珠单 抗、ganitumab、吉妥珠单抗-奥佐米星、吉瑞昔单抗、格莱木单抗-维多 汀、替-伊莫单抗、icrucumab、伊戈伏单抗、拉-英达西单抗、英妥木单 抗、伊珠单抗-奥佐米星、伊匹木单抗(MDX-101)、伊妥木单抗、拉贝珠 单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、莫-洛伏珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单 抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、米妥莫单抗、莫加珠单抗、 moxetumomab(pasudotox)、他那可单抗、他那莫单抗、narnatumab、奈昔 木单抗、尼妥珠单抗、nivolumab、(具有或没有放射性碘)、 NR-LU-10、奥法木单抗、olaratumab、奥纳珠单抗、莫奥珠单抗、奥戈 伏单抗、帕尼单抗、帕曲土单抗、pemtumomab、培妥珠单抗、普立木单 抗、雷妥莫单抗、radretumab、雷莫芦单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、 罗妥木单抗、奥马珠单抗、西罗珠单抗、司妥昔单抗、tabalumab、帕-他 莫单抗、替妥莫单抗、替妥木单抗、TGN1412、替西木单抗、曲美木单 抗、替加珠单抗、TNX-650、托西莫单抗、TRBS07、曲妥珠单抗、西莫 白介素单抗、ublituximab、乌瑞鲁单抗、维妥珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥 昔单抗和扎芦木单抗。还包括这些抗体的片段、变体和衍生物。

在具体的实施方案中，用于本发明的缀合物中的抗-Her2/neu抗体为 曲妥珠单抗()或其片段或衍生物。曲妥珠单抗是获得许可用于 治疗人乳腺癌的Her2/neu特异性单克隆抗体。如本文所示，相比单独使 用曲妥珠单抗抗体，将p97氨基酸序列缀合至曲妥珠单抗抗体出人意料 地引起了较大水平的癌症细胞杀伤。此外，存在p97-抗体缀合物进入HBE 细胞的明显运输，表明该缀合物对递送穿透血脑屏障有效。进一步的数 据有力地表明治疗上有效浓度的p97-曲妥珠单抗缀合物可以在脑组织转 移中得到，甚至是通过全身(例如，经静脉内)给予此类缀合物。这些数据 还表明p97和曲妥珠单抗一起协同作用来将p97-曲妥珠单抗缀合物相对 于正常脑组织而选择性靶向脑转移，并且以相比仅曲妥珠单抗明显更大 的速率(～1000倍)靶向。因此缀合至p97不仅增加了曲妥珠单抗穿透血脑 屏障的运输，还增加了穿透血液-肿瘤屏障的运输。另外，由于相对于其 他组织到心脏组织的分布减少，这些数据表明缀合至p97可以减少如曲 妥珠单抗抗体的心脏毒效应。因此，在某些实施方案中，本发明的p97- 抗体缀合物将在表达Her2/neu的癌症，包括但不限于已转移至CNS的那 些癌症的治疗中产生特定优势。

在一些实施方案中，抗-Her2/neu结合片段包含Her2/neu抗体的一个 或多个CDRs。就这一点而言，一些情况下已经表明可以仅进行抗体的 VHCDR3的转移，同时仍然保留期望的特异性结合(Barbas et al.,PNAS (1995)92:2529-2533)。还见，McLane et al.,PNAS(1995)92:5214-5218, Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2161-2162。

在具体的实施方案中，用于本发明的缀合物中的抗-Her1/EGFR抗体 为西妥昔单抗()，或其片段或衍生物。在某些实施方案中，抗 -Her1/EGFR结合片段包含Her1/EGFR抗体如西妥昔单抗的一个或多个 CDRs。西妥昔单抗被许可用于治疗头颈癌和结肠直肠癌。西妥昔单抗由 225鼠EGFR单克隆抗体的Fv(可变的，抗原结合)区组成，所述抗体对 带有人IgG1重链和κ轻链恒定(骨架)区的人EGFR的N端部分具有特异 性。

可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种制备抗体。 见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring  Harbor Laboratory,1988。可以制备对目标多肽具有特异性的单克隆抗体， 例如，使用Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技术及 其改进。还包括利用转基因动物如小鼠表达人抗体的方法。见，例如， Neuberger et al.,Neuberger et al.,Nature Biotechnology14:826,1996; Lonberg et al.,Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101,1994; 和Lonberg et al.,Internal Review of Immunology13:65-93,1995。具体实例 包括的平台(见，例如，第6,596,541 号美国专利)。

还可以通过使用噬菌体展示文库或酵母展示文库产生或鉴定抗体 (见，例如，第7,244,592号美国专利;Chao et al.,Nature Protocols. 1:755-768,2006)。可用文库的非限制性实例包括克隆的或合成的文库， 如人组合抗体文库(HuCAL)，其中人抗体部件库的结构多样性以7个重 链和7个轻链可变区基因表示。这些基因的组合在主库中产生出49个骨 架。通过在这些骨架上叠加高变异基因盒(CDRs=互补性决定区)，巨大的 人抗体部件库可以得到复制。还包括用人供体来源的编码轻链可变区的 片段、重链CDR-3、编码重链CDR-1中多样性的合成DNA和编码重链 CDR-2中多样性的合成DNA来设计的人文库。适合使用的其他文库对本 领域技术人员显而易见。本文描述的和本领域已知的p97多肽可以用于 纯化过程，例如，亲和层析步骤中。

鉴于此，这些刚刚描述的技术自身和在本领域中是已知的。然而， 技术人员能够使用此类技术来得到抗体或其抗原结合片段，并能够根据 本文中描述的本发明的几种实施方案将它们与p97多肽序列共价偶联。

P97-抗体缀合物

可以利用标准化学、生物化学和/或分子技术进行p97多肽序列与抗 体或其结合片段的缀合。确实，基于本公开并利用可用的本领域认可的 方法，如何制备p97-抗体缀合物是显而易见的。当然，通常在连接本发 明的缀合物的主要组分时，优选采用的缀合技术和产生的连接化学性质 基本上不妨碍缀合物单个组分的期望的功能或活性。

在某些实施方案中，本发明的缀合物可以采用本领域已知的任何合 适连接基团或类型来将异源多肽序列结合至抗体或抗原结合序列。优选 地，抗原(例如，人Her-2/neu蛋白、人Her1/EGFR)结合能力和/或缀合物 活性基本上不会由于所采用的缀合技术而减少，例如，相比未缀合的抗 体，如未缀合的抗-Her2/neu抗体。

在某些实施方案中，可以直接或间接(例如，通过连接子基团)将p97 多肽序列偶联(例如，共价连接)至合适的抗体或其结合片段(例如，抗 -Her2/neu单克隆抗体)。当各自具有能与彼此反应的取代基时，p97多肽 序列和抗体间的直接反应是可能的。例如，在一个上的亲核基团如氨基 或巯基可能能够与含羰基基团如酸酐或酰基卤反应，或与在另一个上的 含有良好离去基团(例如，卤化物)的烷基反应。

可选地，通过连接子基团偶联p97多肽序列和抗体或其结合片段(例 如，抗-Her2/neu抗体或其结合片段)可能是可取的。连接子基团还可以用 作为将p97多肽序列与抗体隔离的间隔物，以防止干扰结合能力、寻靶 能力或其他功能。连接子基团还可以用来增加试剂或抗体上取代基的化 学反应性，从而增加偶联效率。化学反应性的增加还可以促进试剂或试 剂上功能基团的使用，其以其他方式难以实现。

在一些实施方案中，将多于一条p97多肽序列偶联至抗体(例如，抗 -Her2/neu抗体)上可能是可取的，或反之亦然。例如，在某些实施方案中， 多条p97多肽序列被偶联至一个抗体分子或其结合片段上。在一个实施 方案中，多条p97多肽序列被偶联至一个抗-Her2/neu抗体分子或其结合 片段上。p97多肽序列可以为相同的或不同的。与具体的实施方案无关， 可以用多种方式制备含有多条p97多肽序列的缀合物。例如，可以将多 于一个多肽直接偶联至抗体分子上，或者可以使用提供多个结合位点的 连接子。可以采用多种已知的异质双功能交联策略中的任何一种制备本 发明的缀合物。应当理解，这些实施方案中的许多可以通过在缀合/交联 过程中控制所用材料的化学计量得到。

在本发明的更具体实施方案中，将氨基至巯基交联连接子用于制备 缀合物。在一个优选的实施方案中，例如，交联连接子为琥珀酰亚胺基 -4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(Thermo Scientific)，其为 在中间长度的环己烷稳定间隔臂(8.3埃)的相对端含有NHS-酯和马来酰 亚胺反应基团的巯基交联连接子。SMCC是不可切割的膜通透性交联连 接子，其可以用来制备巯基反应性的、马来酰亚胺活化的抗-Her2/neu抗 体或抗原结合片段，以用于随后与p97多肽序列的反应。NHS酯在pH7-9 下与伯胺反应来形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺在pH6.5-7.5下与巯基基 团反应以形成稳定的硫醚键。因此，SMCC的氨基反应性NHS酯与抗 -Her2/neu抗体的伯胺快速交联，所得巯基反应性马来酰亚胺基随后可以 用来与p97的半胱氨酸残基反应以产生目标特异性缀合物。

在某些具体的实施方案中，对p97多肽序列进行了修饰来包含暴露 巯基基团以促进交联，例如，促进交联至马来酰亚胺活化的抗体，如抗 -Her2/neu抗体。在更具体的实施方案中，用修饰伯胺的试剂修饰p97多 肽序列来加入受保护的硫醇基巯基。在甚至更具体的实施方案中，将试 剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)(Thermo Scientific)用来 制备硫醇化的p97多肽。

在其他具体的实施方案中，将马来酰亚胺活化的抗体在合适的条件 下与硫醇化的p97多肽反应来制备本发明的缀合物。应当理解，通过操 控SMCC、SATA、抗体(例如，抗-Her2/neu抗体)和p97多肽在这些反应 中的比率，制备具有不同化学计量、分子量和性能的缀合物是可能的。

上述(和以下例示的)特异性交联策略仅是可以用于制备本发明缀合 物的众多合适缀合策略实例中的一个。对本领域技术人员显而易见的是 多种其他的双功能或多功能试剂，包括同功能和异功能(诸如Pierce  Chemical Co.,Rockford,IL目录中所描述的那些)试剂，可以用作连接子基 团。例如，可通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基产生偶联。 存在数篇描述此类方法的参考文献，例如，Rodwell et al.的第4,671,958 号美国专利。

在其他示例性实施方案中，缀合物包括连接基团，如美国专利第 5,208,020号或欧洲专利0425235B1和Chari et al.,Cancer Research52: 127-131(1992)中描述的那些。示例性连接基团包括，例如，二硫基、硫 醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基 团。

在进一步的其他示例性实施方案中，使用以下化合物制备缀合物： 双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、 琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚胺基硫烷 (iminothiolane,IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸 盐(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛 (如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮 化物衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异 氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。具体的偶联剂包括 用来提供二硫键连接的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP) (Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2- 吡啶基硫)戊酸酯(SPP)。该连接子可以为促进一种或多种可切割组分释放 的“可切割连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子(Cancer Research52: 127-131(1992);第5,208,020号美国专利)。

在其他实施方案中，将非蛋白聚合物用于连接子中，用于将p97多 肽序列偶联至抗体，如Her2/neu抗体。这些可以包括例如，聚乙二醇、 聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物等。

如果缀合物的一种组分在脱离缀合物时可能是更有效的，则使用在 内化进入细胞期间或之后可切割的连接子基团可能是可取的。已经描述 了多种不同的可切割连接子基团。从这些连接子基团细胞内释放试剂的 机制包括通过以下方式的切割：还原二硫键(例如，Spitler的第4,489,710 号美国专利)、辐照光不稳定键(例如，Senter et al.的第4,625,014号美国 专利)、衍生化氨基酸侧链的水解(例如，Kohn et al.的第4,638,045号美国 专利)、血清互补介导的水解(例如，Rodwell et al.的第4,671,958号美国专 利)和酸催化水解(例如，Blattler et al.的第4,569,789号美国专利)。

某些实施方案可以采用一种或多种醛标签来促进p97多肽和抗体或 其抗原结合片段间的缀合(见第8,097,701号和第7,985,783号美国专利， 通过引用并入本文)。因此，通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)作用在醛标签 的硫酸酯酶模体处进行酶修饰产生甲酰甘氨酸(FGly)残基。随后可以将 FGly残基的醛部分用作将目标部分位点特异性结合至多肽的化学柄。在 一些方面，目标部分为另一多肽如抗体。

因此具体实施方案包括包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或 更多个异源硫酸酯酶模体的p97多肽或抗体或抗原结合片段(例如，抗 -Her2/neu抗体)，其中所述模体包含以下结构：

X₁Z₁X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:6)

其中Z₁为半胱氨酸或丝氨酸；Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或 缺失，并且当存在时为任何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于醛标 记的多肽的N端时，X₁优选存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨基 酸。

可以通过FGE酶修饰带有上述模体的多肽来产生具有FGly残基的 模体，如上所示，其随后可以用于第二多肽的位点特异性结合，例如， 通过连接子部分。例如，可通过在表达FGE酶的哺乳动物、酵母或细菌 细胞内表达含有硫酸酯酶模体的多肽(例如，p97、抗体)，或者通过用分 离的FGE酶体外修饰分离的多肽进行此类修饰(见Wu et al.,PNAS. 106:3000-3005,2009;Rush and Bertozzi,J.Am Chem Soc.130:12240-1, 2008;和Carlson et al.,J Biol Chem.283:20117-25,2008)。

因此，一些实施方案包括包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个 或更多个具有甲酰甘氨酸残基的异源硫酸酯酶模体的p97多肽或抗体(或 抗原结合片段)，其中所述模体包含以下结构：

X₁(FGly)X₂Z₂X₃(SEQ ID NO:5)

其中FGly为甲酰甘氨酸残基；Z₂为脯氨酸或丙氨酸残基；X₁存在或 缺失，并且当存在时为任何氨基酸，其中当异源硫酸酯酶模体处于醛标 记的多肽的N端时，X₁优选存在；并且X₂和X₃各自独立地为任何氨基 酸。

在特定的实施方案中，X₁、X₂和X₃各自独立地为脂肪族氨基酸、含 硫氨基酸或极性、不带电荷的氨基酸。例如，X₁可以为L、M、V、S或 T；并且X₂和/或X₃可以独立地为S、T、A、V、G或C。

在一些实施方案中，异源硫酸酯酶模体可以：(a)少于16个氨基酸残 基长度，包括约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个残基 长度，(b)位于多肽N端，(c)位于多肽C端，(d)位于源自所述多肽的氨基 酸序列的内部位点，(e)位于多肽的末端环内，(f)位于多肽的翻译后修饰 位点(例如，糖基化位点)，或它们的任何组合。在具体的实施方案中，包 含一个或多个异源硫酸酯酶模体的抗体特异性结合人Her2/neu(例如，曲 妥珠单抗)。

一些实施方案涉及以下物质的缀合物：(i)含有硫酸酯酶模体(或醛标 签)的p97多肽，和(ii)用醛反应基团功能化的抗体或其抗原结合片段，或 者反之亦然，其中(i)和(ii)通过硫酸酯酶模体的FGly残基和醛反应基团共 价连接。此类缀合物可以具有一种以下通用结构：

p97(FGly)-R₁-Ab或p97-R₁-(FGly)Ab

其中R₁为至少一个醛反应连接；并且FGly为异源硫酸酯酶内的甲 酰甘氨酸残基。

可以用一种或多种醛反应基团如氨基氧、酰肼和氨基硫脲功能化含 有非醛标签的蛋白(例如，抗体、p97多肽)，随后通过至少一个FGly残 基共价连接至含有醛标签的多肽，以形成醛反应性连接。氨基氧功能化 蛋白的结合在FGly残基和功能化蛋白之间产生肟连接；酰肼功能化蛋白 的结合在FGly残基和功能化蛋白之间产生肼连接；并且氨基硫脲功能化 蛋白的结合在FGly残基和功能化蛋白之间产生肼硫代酰胺连接。

某些实施方案包括以下物质的缀合物：(i)含硫酸酯酶模体(或醛标签) 的p97多肽和(ii)含硫酸酯酶模体(或醛标签)的抗体，其中(i)和(ii)通过它 们各自的FGly残基共价连接，任选地通过双功能化的连接子部分。例如， 某些p97-抗体缀合物可以包含以下结构：

p97(FGly)-R₁-L-R₂-(FGly)Ab

其中R₁和R₂为相同的或不同的醛反应连接；L为连接子部分， p97(FGly)为含醛标签的p97多肽，并且(FGly)Ab为含醛标签的抗体，如 特异性结合人Her2/neu的抗体(例如，曲妥珠单抗)。仅以说明的方式， 在一些实施方案中，至少一个异源硫酸酯酶模体可以处于p97多肽的C 端和抗体的N端。在其他实施方案中，至少一个异源硫酸酯酶模体可以 处于p97多肽的N端和抗体的C端。在进一步的其他实施方案中，至少 一个异源硫酸酯酶模体可以处于p97多肽的N端和抗体的N端。在其他 实施方案中，至少一个异源硫酸酯酶模体可以处于p97多肽的C端和抗 体的C端。如上所示，至少一个异源模体可以处于p97多肽和/或抗体的 内部位置。本领域技术人员应理解，其他组合是可能的。

通过可在以下物质间形成共价键的任何醛反应基团能够独立地形成 R₁和R₂的醛反应性连接：(i)醛标签的甲酰甘氨酸(FGly)残基和(ii)用所述 醛反应基团功能化的连接子部分(例如，带有两个醛反应基团的双功能化 连接子，其可以为相同的或不同的)。醛反应基团的实例包括氨基氧、酰 肼和氨基硫脲基，其与FGly残基形成包含席夫碱的连接，分别包括肟连 接、肼连接和肼硫代酰胺连接。因此，R₁和R₂可以独立地为包含席夫碱 的连接，如肟连接、肼连接或肼硫代酰胺连接。

在一些实施方案中，含醛标签的p97多肽和含醛标签的抗体通过多 功能化的连接子(例如，双功能化的连接子)连接(例如，共价连接)，后者 用相同或不同的醛反应基团功能化。在这些和相关的实施方案中，醛反 应基团允许连接子通过它们各自的FGly残基在p97多肽和抗体间形成共 价桥。连接子部分包括可以用一种或多种醛反应基团功能化并且优选双 功能化或多功能化的任何部分或化学制品。具体实例包括肽、水溶性聚 合物、可检测的标签、其他治疗性化合物(例如，细胞毒素化合物)、生物 素/链霉亲和素部分和聚糖(见Hudak et al.,J Am Chem Soc.133:16127-35, 2011)。聚糖(或糖苷)的具体实例包括氨基氧聚糖，如由糖基N-戊烯酰基 异羟肟酸中间体(同上)组成的高阶聚糖。

肽连接子(或间隔物)以下有描述。可以用醛反应基团根据本领域常规 技术来功能化肽连接子(见，例如，Carrico et al.,Nat Chem Biol.3:321-322, 2007)。

“水溶性聚合物”是指在水中可溶的聚合物，并且通常为基本上无免 疫原性的，并且通常具有大于约1,000道尔顿的原子分子量。通过水溶性 聚合物结合两个多肽可能是可取的，因为此类修饰可以通过增加血清半 衰期，例如，通过增加蛋白水解稳定性和/或减少肾清除而增加治疗指数。 另外，通过一种或多种聚合物结合可以减少蛋白药物的免疫原性。

在一些实施方案中，水溶性聚合物具有大于约10,000Da、大于约 20,000至500,000Da、大于约40,000Da至300,000Da、大于约50,000Da 至70,000Da，通常大于约60,000Da的有效的水动力学分子量。“有效的 水动力学分子量”是指如通过基于水的体积排阻色谱(SEC)测定的聚合物 链的有效水溶剂化大小。当水溶性聚合物含有具有聚亚烷基氧化物重复 单元如环氧乙烷重复单位的聚合物链时，每条链可以具有约200Da至约 80,000Da，或约1,500Da至约42,000Da的原子分子量，其中2,000至约 20,000Da是特别期望的。也包括直链、支链和末端带电荷的水溶性聚合 物。

用作醛标记的多肽间的连接子的聚合物可以具有广范围的分子量以 及聚合物亚基。这些亚基可以包括生物聚合物、合成聚合物或它们的组 合物。此类水溶性聚合物的实例包括：葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括葡 聚糖硫酸盐、P-氨基交联葡聚糖和羧甲基葡聚糖；纤维素和纤维素衍生 物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素、淀粉和糊精；以及淀粉的衍生物 和hydroylactes、聚亚烷基乙二醇及其衍生物，包括聚乙二醇(PEG)、甲 氧基聚乙二醇、聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、丙二醇和乙二醇的 共聚物，其中所述均聚物和共聚合物为未取代的，或在一端被烷基、肝 素和肝素片段、聚乙烯醇和聚乙烯乙醚、聚乙烯吡咯烷酮、天冬酰胺和 聚乙氧化的多元醇取代，被葡聚糖和葡聚糖衍生物、糊精和糊精衍生物 取代。应当了解，还包括具体描述的水溶性聚合物的不同衍生物。

水溶性聚合物为本领域已知，尤其是基于聚亚烷基氧化物的聚合物 如聚乙二醇“PEG”(见Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and  Biomedical Applications,J.M.Harris,Ed.,Plenum Press,New York,N.Y. (1992);和Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications,J.M. Harris and S.Zalipsky,Eds.,ACS(1997);和国际专利申请:WO90/13540, WO92/00748,WO92/16555,WO94/04193,WO94/14758,WO94/17039, WO94/18247,WO94/28937,WO95/11924,WO96/00080,WO96/23794, WO98/07713,WO98/41562,WO98/48837,WO99/30727,WO99/32134, WO99/33483,WO99/53951,WO01/26692,WO95/13312,WO96/21469, WO97/03106,WO99/45964,和美国专利第4,179,337号;第5,075,046号; 第5,089,261号;第5,100,992号;第5,134,192号;第5,166,309号;第 5,171,264号;第第5,213,891号;第5,219,564号;第5,275,838号;第 5,281,698号;第5,298,643号;第5,312,808号;第5,321,095号;第 5,324,844号;第5,349,001号;第5,352,756号;第5,405,877号;第 5,455,027号;第5,446,090号;第5,470,829号;第5,478,805号;第 5,567,422号;第5,605,976号;第5,612,460号;第5,614,549号;第 5,618,528号;第5,672,662号;第5,637,749号;第5,643,575号;第 5,650,388号;第5,681,567号;第5,686,110号;第5,730,990号;第 5,739,208号;第5,756,593号;第5,808,096号;第5,824,778号;第 5,824,784号;第5,840,900号;第5,874,500号;第5,880,131号;第 5,900,461号;第5,902,588号;第5,919,442号;第5,919,455号;第 5,932,462号;第5,965,119号;第5,965,566号;第5,985,263号;第 5,990,237号;第6,011,042号;第6,013,283号;第6,077,939号;第 6,113,906号;第6,127,355号;第6,177,087号;第6,180,095号;第 6,194,580号;第6,214,966号,其通过引用并入本文)。

示例性目标聚合物包括含有聚亚烷基氧化物、聚酰胺亚烷基氧化物 或其衍生物的那些聚合物，包括包含式--(CH₂--CH₂--O)—的环氧乙烷重复 单元的聚亚烷基氧化物和聚酰胺亚烷基氧化物。其他示例性目标聚合物 包括具有分子量大于约1000道尔顿的式 --[C(O)--X--C(O)--NH--Y--NH]_n-或--[NH--Y--NH--C(O)--X--C(O)]_n—的聚 酰胺，其中X和Y可以为相同或不同且可以为支链或直链的二价基，并 且n为2-100，通常为2-50的离散整数，并且其中X和Y两者或其中之 一包含生物相容的、基本上非抗原性的水溶性重复单元，其可为直链或 支链的。

其他示例性水溶性重复单元包含式--(CH₂--CH₂--O)—或 --(CH₂--CH₂--O)—的环氧乙烷。此类水溶性重复单元的数目可以存在明显 差异，其中此类单元的通常数目为2-500、2-400、2-300、2-200、2-100， 并且最通常为2-50。示例性实施方案为其中X和Y中一个或两个选自： --((CH₂)_n1--(CH₂--CH₂--O)_n2--(CH₂)—或 --((CH₂)_n1--(O--CH₂--CH₂)_n2--(CH₂)_n1--)，其中n1为1至6、1至5、1至4， 并且最通常为1至3，并且其中n2为2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，并 且最通常为2-5。其他示例性实施方案为其中X为--(CH₂--CH₂)--，并且 其中Y为--(CH₂--(CH₂--CH₂--O)₃--CH₂--CH₂--CH₂)---或 --(CH₂--CH₂--CH₂--(O--CH₂--CH₂)₃--CH₂)--，以及其他变型。

对于生物素/链霉亲和素(或亲和素)部分，含醛标签的p97多肽可以 通过FGly残基共价结合至用醛反应基团功能化的生物素分子上，并且含 醛标签的抗体可以通过FGly残基共价结合至用醛反应基团功能化的链霉 亲和素分子上，或反之亦然。p97-生物素(或链霉亲和素)随后可以与抗体 -链霉亲和素(或生物素)混合，以通过生物素和链霉亲和素间的强相互作 用形成p97-抗体缀合物。

还可以通过不同的“点击化学”技术制备p97-抗体缀合物，包括模块 化、范围广、给出非常高产量的反应，其主要产生无害的可以通过非色 谱法去除且可以为立体特异性但不必为对映选择性的副产品(见Kolb et  al.,Angew Chem Int Ed Engl.40:2004-2021,2001)。具体实例包括用叠氮化 物和炔烃进行Huisgen1,3-偶极环加成，也称作“叠氮化物-炔烃环加成” 反应的缀合技术(见Hein et al.,Pharm Res.25:2216-2230,2008)。叠氮化物 -炔烃环加成反应的非限制性实例包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成 (CuAAC)反应，以及钌催化的叠氮化物-炔烃环加成(RuAAC)反应。

CuAAC在宽温度范围内起作用，其对含水条件和超过4至12的pH 范围敏感，并且耐受宽范围的功能基团(见Himo et al,J Am Chem Soc. 127:210-216,2005)。例如，可使用抗坏血酸钠作为还原剂从Cu(I)盐或 Cu(II)盐产生活性Cu(I)催化剂。该反应形成1,4-取代产物，使得其为区域 特异性的(见Hein et al.,同上)。

RuAAC利用五甲基环戊二烯基氯化钌[Cp^*RuCl]复合物，其能催化叠 氮化物环加成形成末端炔烃，区域选择性地产生1,5-二取代1,2,3-三唑(见 Rasmussen et al.,Org.Lett.9:5337-5339,2007)。另外，与CuAAC相反， 还可以将RuAAC与内部炔烃一起使用来提供全取代1,2,3-三唑。

因此，某些实施方案包括包含至少一个带有叠氮化物侧链或炔烃侧 链的非天然氨基酸的p97多肽，所述非天然氨基酸包括内部和末端非天 然氨基酸(例如，N端、C端)。可以通过体内或体外(例如，无细胞系统) 并入含有叠氮化物侧链或炔烃侧链的非天然氨基酸形成这些p97多肽中 的某些。示例性体内技术包括细胞培养技术，例如，使用改性的大肠杆 菌(见Travis and Schultz,The Journal of Biological Chemistry.285:11039-44, 2010;和Deiters and Schultz,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters. 15:1521-1524,2005)，并且示例性体外技术包括无细胞系统(见Bundy, Bioconjug Chem.21:255-63,2010)。

在一些实施方案中，包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨基 酸的p97多肽，通过叠氮化物-炔烃环加成被缀合至包含至少一个带有炔 烃侧链的非天然氨基酸的抗体上。在其他实施方案中，包含至少一个带 有炔烃侧链的非天然氨基酸的p97多肽，通过叠氮化物-炔烃环加成被缀 合至包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨基酸的抗体上。因此， 某些实施方案包括包含通过1,2,3-三唑连接共价连接至抗体上的p97多肽 的缀合物。在具体的实施方案中，所述抗体为抗-Her2/neu抗体如曲妥珠 单抗。

可以通过以下基于CuAAC的或基于RuAAC的反应形成特异性p97- 抗体缀合物，以包含下列分别的结构(I)或(II)：

其中R为p97多肽，并且R′为抗体或其抗原结合片段；或者其中R 为抗体或其抗原结合片段，并且R′为p97多肽。

如上所示，在一些实施方案中，带有叠氮化物侧链的非天然氨基酸 和/或带有炔烃侧链的非天然氨基酸为末端氨基酸(N端、C端)。在某些实 施方案中，一种或多种非天然氨基酸为内部的。具体的实施方案包括包 含带有叠氮化物侧链的N端非天然氨基酸的p97多肽，其缀合至包含带 有炔烃侧链的N端非天然氨基酸的抗体上。其他实施方案包括包含带有 叠氮化物侧链的C端非天然氨基酸的p97多肽，其缀合至包含带有炔烃 侧链的C端非天然氨基酸的抗体上。其他实施方案包括包含带有叠氮化 物侧链的N端非天然氨基酸的p97多肽，其缀合至包含带有炔烃侧链的 C端非天然氨基酸的抗体上。其他实施方案包括包含带有叠氮化物侧链 的C端非天然氨基酸的p97多肽，其缀合至包含带有炔烃侧链的N端非 天然氨基酸的抗体上。

其他实施方案包括包含带有炔烃侧链的N端非天然氨基酸的p97多 肽，其缀合至包含带有叠氮化物侧链的N端非天然氨基酸的抗体上。进 一步的其他实施方案包括包含带有炔烃侧链的C端非天然氨基酸的p97 多肽，其缀合至包含带有叠氮化物侧链的C端非天然氨基酸的抗体上。 其他实施方案包括包含带有炔烃侧链的N端非天然氨基酸的p97多肽， 其缀合至包含带有叠氮化物侧链的C端非天然氨基酸的抗体上。进一步 的其他实施方案包括包含带有炔烃侧链的C端非天然氨基酸的p97多肽， 其缀合至包含带有叠氮化物侧链的N端非天然氨基酸的抗体上。

还包括制备p97-抗体缀合物的方法，包括：(a)进行以下物质间的叠 氮化物-炔烃环加成反应：(i)包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨 基酸的p97多肽与包含至少一个带有炔烃侧链的非天然氨基酸的抗体或 其抗原结合片段；或者(ii)包含至少一个带有炔烃侧链的非天然氨基酸的 p97多肽与包含至少一个带有叠氮化物侧链的非天然氨基酸的抗体或其 抗原结合片段；和(b)从反应物中分离p97-抗体缀合物，从而制备p97-抗 体缀合物。

在p97-抗体缀合物为融合多肽的情形下，融合多肽通常可以使用标 准技术包括化学缀合制得。然而如下所述，优选地，融合多肽在表达系 统中被表达为重组多肽。本发明的融合多肽可以含有p97多肽序列的一 个或多个拷贝，并且可以含有抗体或其抗原结合片段的一个或多个拷贝 (例如，抗-Her2/neu抗体或其抗原结合片段)，这些拷贝以任何期望的布 置存在。

可使用肽连接子序列来以足以确保每一多肽折叠为其二级和三级结 构的距离隔开第一和第二多肽组分。可以使用本领域熟知的标准技术将 此类肽连接子序列整合到融合多肽中。可以基于以下因素挑选合适的肽 连接子序列：(1)它们采用柔性延伸构型的能力；(2)它们采用可以与第一 和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力；和(3)可以与多肽 功能表位反应的疏水或带电荷残基的缺乏。可以有效用作连接子的氨基 酸序列包括，Maratea et al.,Gene40:39-46,1985;Murphy et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA83:8258-8262,1986；第4,935,233号美国专利和第4,751,180 号美国专利中公开的那些。连接子序列通常可以为1至约50个氨基酸长 度。当第一和第二多肽具有可以用来隔开功能结构域并阻止空间干扰的 非必需N端氨基酸区域时，不需要连接子序列。

在某些示例性实施方案中，肽间隔为1-5个氨基酸、5-10个氨基酸、 5-25个氨基酸、5-50个氨基酸、10-25个氨基酸、10-50个氨基酸、10-100 个氨基酸或任何中间范围的氨基酸。在其他示例性实施方案中，肽间隔 包含约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸 长度。特定连接子可具有的总氨基酸长度为约1-200个氨基酸、1-150个 氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、 1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个 氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。

肽连接子可以采用任何一种或多种如本文其他地方描述的和本领域 已知的天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨 基酸模拟物。某些可用作连接子的氨基酸序列包括Maratea et al.,Gene 40:39-46,1985;Murphy et al.,PNAS USA.83:8258-8262,1986;第4,935,233 号美国专利和第4,751,180号美国专利中公开的那些。特定肽连接子序列 含有Gly、Ser和/或Asn残基。如需要，其他近中性的氨基酸如Thr和 Ala也可以用于肽连接子序列中。

某些示例性连接子包括含Gly、Ser和/或Asn的连接子，如下：[G]_x、 [S]_x、[N]_x、[GS]_x、[GGS]_x、[GSS]_x、[GSGS]_x(SEQ ID NO:7)、[GGSG]_x(SEQ ID NO:8)、[GGGS]_x(SEQ ID NO:9)、[GGGGS]_x(SEQ ID NO:10)、[GN]_x、 [GGN]_x、[GNN]_x、[GNGN]_x(SEQ ID NO:11)、[GGNG]_x(SEQ ID NO:12)、 [GGGN]_x(SEQ ID NO:13)、[GGGGN]_x(SEQ ID NO:14)连接子，其中_x为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20或更多。这些和相关氨基酸的其他组合对本领域技术人员显而易 见。

在具体的实施方案中，连接子序列包含Gly3连接子序列，其包含3 个甘氨酸残基。在特定的实施方案中，可以使用能对DNA-结合位点和肽 本身建模的计算机程序(Desjarlais&Berg,PNAS.90:2256-2260,1993;和 PNAS.91:11099-11103,1994)或通过噬菌体展示方法合理设计柔性连接 子。

肽连接子可以为生理学合适的，或可以包括可释放的连接子如生理 学可降解的或可酶促切割的连接子(例如，可蛋白水解切割连接子)。在某 些实施方案中，一种或多种可释放的连接子可以导致缀合物的较短半衰 期和更快速的清除。这些和相关的实施方案可以用来，例如，提高p97- 抗体缀合物在血流中的溶解性和血液循环寿命，同时还将抗体递送至血 流(或穿透BBB)，其在连接子降解后，基本上无p97序列。这些方面在 那些情形下特别有用，其中当抗体永久缀合至p97序列上时展现减少的 活性。通过使用如本文中提供的连接子，此类抗体可以在为缀合形式时 维持它们的治疗活性。以这些和其他方式，可以更有效地调整p97-抗体 缀合物的性能来平衡抗体随时间的生物活性和循环半衰期。

在特定的实施方案中，可释放的连接子在pH7.4、25℃，例如，生 理pH、人体温(例如，在体内、在血清中、在给定组织中)下，具有约30 分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小 时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72 小时或约96小时或更长的半衰期或任何中间的半衰期。本领域技术人员 应当理解，可以通过使用特定的可释放连接子精确调整p97-抗体缀合物 的半衰期。

然而，在某些实施方案中，任何一种或多种的肽连接子都是任选的。 例如，当第一和第二多肽具有可以用来隔开功能结构域并阻止空间干扰 的非必需N端和/或C端氨基酸区域时，可以不需要连接子序列。

在其他实施方案中，如本文所述的p97抗体缀合物可以进一步缀合 至或可操作地连接至另一治疗性化合物上。该缀合物可以包含，例如， 细胞毒素剂、化疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、 毒素、放射性同位素或其他治疗活性剂。

融合多肽、宿主细胞和重组制备

本发明在某些实施方案中还提供了分离的编码本发明p97多肽和97- 抗体缀合物的多肽，如包含抗-Her2/neu抗体或抗原结合片段和p97多肽 序列或其片段或衍生物的融合多肽。还包括分离的或重组的编码含醛标 签的p97多肽和抗体的多核苷酸，和包含至少一个非天然氨基酸如带有 叠氮化物侧链或炔烃侧链的非天然氨基酸的p97多肽和抗体，以及相关 的宿主细胞。这些和相关的实施方案可以用于重组制备本文描述的p97- 抗体融合蛋白和非融合缀合物。

对于融合蛋白，可以单独组装编码p97和抗体(例如，抗-Her2/neu抗 体)组分的DNA序列，随后连接至合适的表达载体内。使用或不用肽连 接子将编码一个多肽组分的DNA序列的3'端连接至编码第二多肽组分的 DNA序列的5'端，以便序列的阅读框同相。将连接的DNA序列可操作 地连接至合适的转录或翻译调控元件。负责DNA表达的调控元件仅位于 编码第一多肽的DNA序列的5'端。类似地，终止翻译所需的终止密码子 和转录终止信号仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3'端。这允许翻译 为保留两种组分多肽生物活性的单一融合多肽。

类似的技术，主要为调控元件如启动子、终止密码子和转录终止信 号的布置，可以用来重组制备非融合蛋白，例如，用于制备非融合缀合 物的p97多肽和抗体。

本发明的多肽和融合多肽可以含有编码p97多肽序列的核酸的一个 或多个拷贝，和/或可以含有编码抗体或其抗原结合片段的核酸的一个或 多个拷贝。

在一些实施方案中，将编码个体p97多肽、抗体和/或p97-抗体融合 物的核酸直接引入到宿主细胞内，并在足以诱导编码的多肽表达的条件 下孵育细胞。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术结合本文中提供 的多肽和核酸序列制备本公开的多肽序列。

因此，根据某些相关的实施方案，提供了包含如本文描述的多肽或 融合多肽的重组宿主细胞。可以通过在合适的条件下培养含有该多肽的 重组宿主细胞方便地实现在宿主细胞内表达p97多肽、抗体或p97-抗体 融合物。通过表达制备后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化该多 肽，随后用作期望目的。

用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。合适 的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可 用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa 细胞、幼仓鼠肾细胞、HEK-293细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞和许多其 他细胞。通常优选的细菌宿主为大肠杆菌。

抗体和抗原结合片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达在本领域早已 建立。关于综述，见例如Pluckthun,A.Bio/Technology.9:545-551(1991)。 在培养的真核细胞中表达也可作为本领域技术人员制备抗体或其抗原结 合片段的一个选择，见最近的综述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.Opinion  Biotech.4:573-576;Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech6: 553-560。

可以挑选或构建合适的载体，其含有合适的调控序列，包括合适的 启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和 其他序列。载体可以为合适的质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。关于其 他详细信息见，例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸， 例如制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋 白分析的许多已知技术和方案，被详细描述于Current Protocols in  Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons, 1992，或其随后的更新中。

术语“宿主细胞”用来指这样的细胞，其已经被引入或能引入编码一 种或多种本文描述的多肽的核酸序列，并进一步表达或能表达所选目标 基因，如编码任何本文描述的多肽的基因。该术语包括亲本细胞的后代， 无论后代是否与原始亲本为形态学相同或为基因组成相同，只要所选基 因存在。可以针对宿主细胞的某些特性进行挑选以促进缀合，例如，甲 酰甘氨酸生成酶(FGE)的表达以将硫酸酯酶模体内的半胱氨酸或丝氨酸 残基转化为甲酰甘氨酸(FGly)残基，或能将非天然氨基酸整合到多肽内的 氨酰基tRNA合成酶的表达，所述非天然氨基酸包括带有叠氮化物侧链、 炔烃侧链或其他期望的侧链的非天然氨基酸。

因此，还包括将此类核酸引入宿主细胞的方法。可采用任何可用的 技术进行引入。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE- 葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒如牛 痘，或对于昆虫细胞使用杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术 可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用细菌噬菌体的转染。引入后可以造 成或允许来自核酸的表达，例如通过在用于表达基因的条件下培养宿主 细胞。在一个实施方案中，核酸被整合到宿主细胞的基因组(例如染色体) 中。根据标准技术，可以通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。

在某些实施方案中本发明还提供了包括在表达系统中使用如上所述 的构建物的方法，以便表达特定多肽如本文描述的p97多肽、抗体或p97- 抗体融合蛋白。

示例性地，如需要，肽连接子/间隔序列可以用来以足以确保每种多 肽都折叠成其二级和/或三级结构的距离，将p97-抗体融合蛋白的组分隔 开。可以使用本领域熟知的标准技术将此类肽连接子序列整合到融合多 肽中。

组合物和使用方法

本公开还提供了包含p97-抗体缀合物的组合物和本发明的组合物， 以及给予此类组合物用于治疗目的。

可以通过任何用于提供类似效用的已接受的给予试剂模式，进行以 纯化形式或以合适的药物组合物给予本文描述的缀合物。可以通过将缀 合物或含缀合物的组合物与合适的生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂 组合以制备所述药物组合物，并且可以制成固体、半固体、液体或气体 形式的制剂，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、 注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气溶胶。另外，其他药学活性成分(包 括如本文其他地方描述的其他抗癌剂)和/或合适的赋形剂如盐、缓冲剂和 稳定剂，可以但不必需存在于组合物中。可以通过多种不同的途径，包 括经口、肠胃外、经鼻、静脉内、皮内、皮下或局部给予来实现给予。 给予的优选模式取决于待治疗或预防病症的性质。给予后，减少、抑制、 阻止或延迟癌症进展和/或转移的量被认为是有效的量。

载体可以包括，例如，在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或 哺乳动物无毒的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常生理上可接 受的载体为pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括：缓冲剂如 磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗环血酸；低分子量(少 于约10个残基)多肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合 物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸 或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂如EDTA；糖醇类如甘露醇或山梨醇；盐形成的抗衡离子如钠； 和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20(TWEEN^TM)聚乙二醇(PEG)和泊 洛沙姆(PLURONICS^TM)等。

本发明提供了包含p97多肽序列和任何治疗性和/或诊断性抗体或其 抗原结合片段(例如，特异性结合人Her2/neu蛋白的抗体或抗体片段或本 文描述的其他抗体)的治疗性组合物。

在某些方面，p97多肽序列和抗体或其片段各自单独或作为先已存在 的缀合物结合或封装在颗粒，例如，纳米颗粒、珠、脂质制剂、脂质颗 粒或脂质体，例如，免疫脂质体内。例如，在特定的实施方案中，p97多 肽序列结合至颗粒表面，并且抗体或其片段结合至颗粒表面和/或封装在 颗粒内。在这些和相关实施方案中的某些中，p97多肽和抗体仅通过颗粒 自身(例如，纳米颗粒、脂质体)共价或可操作地彼此连接，并且不以任何 其他方式共价彼此连接；即，它们单独地结合至相同的颗粒。在其他实 施方案中，p97多肽和抗体首先共价地彼此缀合，如本文所述(例如，通 过连接子分子)，随后结合或封装在颗粒(例如，免疫脂质体、纳米颗粒) 内。在具体的实施方案中，颗粒为脂质体，并且所述组合物包含一种或 多种p97多肽、一种或多种抗体或其抗原结合片段，以及脂质的混合物 以形成脂质体(例如，磷脂，具有表面活性剂性能的混合脂质链)。在一些 方面，p97多肽和抗体(或抗原结合片段)单独与脂质/脂质体混合物混合， 以便脂质体结构的形成物可操作地连接p97多肽和抗体，而不需要共价 缀合。在其他方面，p97多肽和抗体(或抗原结合片段)首先共价地彼此缀 合，如本文中所描述，随后与脂质混合以形成脂质体。p97多肽、抗体或 p97抗体-缀合物可以包埋在制备的微囊内，例如，通过凝聚技术或通过 界面聚合作用(例如，分别通过羟基甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯 酸甲酯)微囊)、在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微 乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术公开于 Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)中。 颗粒或脂质体还可以包含其他细胞毒素剂。

治疗的精确剂量和持续时间是接受治疗的疾病的函数，并且可以使 用已知测试方案根据经验确定或通过在本领域已知的模型系统中测试组 合物并从中外推测获得。还可以进行受控临床试验。剂量还可以随待缓 解的病症的严重性而改变。通常配制并给予药物组合物来发挥治疗上有 用的效应同时将不良副作用减至最小。可以一次给予组合物，或可以分 成多个较小剂量按时间间隔给予。对于任何特定个体，可以根据个体需 要随时间调整特定的剂量方案。

可将含缀合物的组合物单独给予或与其他已知癌症治疗如放射治 疗、化疗、移植、免疫治疗、激素治疗、光力学治疗等组合给予。所述 组合物还可以与抗生素组合给予。

因此，给予这些和相关药物组合物的典型途径包括但不限于：经口、 局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、经直肠、经阴道和鼻内给予。 本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或 输注技术。配制了根据本发明的某些实施方案的药物组合物，以便在将 组合物给予到患者后允许其中所含活性成分为生物相容的。给予个体或 患者的组合物可以采用一种或多种剂量单元的形式，其中例如，片剂可 以为单一剂量单元，并且本文描述的气溶胶形式的缀合物的容器可以容 纳多个剂量单元。制备此类剂量形式的实际方法为本领域技术人员已知， 或对本领域技术人员显而易见；例如，见Remington:The Science and  Practice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and  Science,2000)。给予的组合物在任何情况下都含有治疗有效量的本公开 的缀合物，用于根据本文的教导治疗目标疾病或病症。

药物组合物可以为固体或液体形式。在一个实施方案中，载体为颗 粒，以便组合物为例如片剂或粉剂形式。载体可以为液体，其中组合物 为例如口服的油、可注射的液体，或例如用于吸入给予的气溶胶。当希 望用作经口给予时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、 半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文考虑的形式内，作为固体或液体。

作为用于经口给予的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉剂、 颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊剂、口香糖、糯米纸囊剂(wafer)等。此 类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，一 种或多种以下物质可以存在：粘结剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微 晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂如藻酸、 藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂 如胶质二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；增味剂如薄荷、甲基水杨酸酯 或橙香精；以及着色剂。当药物组合物为胶囊形式时，例如，明胶胶囊， 除了上述类型的材料，其还可以含有液体载体如聚乙二醇或油。

药物组合物可以为液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬 浮液。作为两个实例，液体可以用于经口给予或用于通过注射递送。当 希望用于经口给予时，优选的组合物除了含有本化合物外，还含有一种 或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增香剂。在期望通过注射给予的 组合物中，可以包含一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、 悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。

液体药物组合物，不论它们为溶液、悬浮液或其他类似形式，都可 以包含一种或多种下述佐剂：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液，优选生 理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油如可以用作溶剂或悬浮介质 的合成单甘酯或双甘酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂 如苄醇或尼泊金甲酯；氧化剂如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合剂如乙二 胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节紧张性的试剂 如氯化钠或葡萄糖。可以将肠胃外制剂封装在安瓶、一次性注射器或由 玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水为优选的佐剂。可注射药物 组合物优选为无菌的。

希望用于肠胃外或经口给予的液体药物组合物应当含有一定量如本 文公开的缀合物，以便得到合适的剂量。通常，该量为组合物中至少0.01% 的抗体。当希望经口给予时，该量可在组合物重量的0.1%至约70%之间 变化。某些经口药物组合物含有约4%至约75%的抗体。在某些实施方案 中，制备了根据本发明的药物组合物和制备物，以便肠胃外剂量单元在 稀释前含有0.01-10%重量的抗体。

药物组合物可以用于局部给予，在这种情形下载体可以合适地包括 溶液、乳剂、药膏或凝胶基质。基质，例如，可以包含以下中一种或多 种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和乙醇，以 及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于药物组合物中用于局部给予。如 果希望用于经皮给予，组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗装置。药物 组合物可以用例如在直肠中溶化并释放药物的栓剂形式用于直肠给予。 用于直肠给予的组合物可以含有油质基质作为合适的无刺激性赋形剂。 此类基质包括但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。

药物组合物可以包含更改固体或液体剂量单元的物理形式的不同材 料。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包被壳的材料。形成包 被壳的材料通常为惰性的，并且可以选自，例如，糖、虫胶和其他肠溶 衣剂。可选地，可以将活性成分包装在明胶胶囊内。固体或液体形式的 药物组合物可以包含结合本发明的抗体从而有助于递送化合物的试剂。 可以发挥该能力的合适试剂包括其他单克隆或多克隆抗体、一种或多种 蛋白或脂质体。药物组合物可以基本上由可以作为气溶胶给予的剂量单 位组成。术语气溶胶用来表示从具有胶体性质的那些系统到由加压包装 组成的系统的多种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分 的合适泵系统来递送。为了递送活性成分，可以用单相、双相或三相系 统递送气溶胶。气溶胶的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、副容器 等，其可以一起构成试剂盒。本领域技术人员不需要过多的经验即可以 确定优选的气溶胶。

可以通过药物领域熟知的方法制备药物组合物。例如，可以通过将 包含如本文描述的缀合物和任选地一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂的 组合物与无菌、蒸馏水组合以便形成溶液来制备希望通过注射给予的药 物组合物。可以加入表面活性剂来促进均质溶液或悬浮液的形成。表面 活性剂是与抗体组合物非共价相互作用以便促进抗体在含水递送系统中 分解或均质悬浮的化合物。

可以按治疗有效量给予组合物，这取决于多种因素，包括所用特定 化合物(例如，缀合物)的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患 者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给予模式和时间；排泄 速率；药物组合；特定病症或疾病状况的严重性；以及接受治疗的个体。 一般来说，治疗有效的每日剂量(对70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即 0.07mg)至约100mg/kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对70kg哺乳 动物)为约0.01mg/kg(即0.7mg)至约50mg/kg(即3.5g)；更优选地，治 疗有效剂量(对70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即70mg)至约25mg/kg(即 1.75g)。

还可以在给予一种或多种其他治疗剂同时、之前或之后给予包含本 公开的缀合物的组合物。此类组合治疗可以包括给予含有本发明的化合 物和一种或多种其他活性剂的单一药物剂量制剂，以及给予包含本发明 的缀合物并且每种活性剂以其自身单独的药物剂量制剂存在的组合物。 例如，如本文描述的缀合物和其他活性剂可以一起在单一经口剂量组合 物如片剂或胶囊中给予患者，或者每种试剂在单独的经口剂量制剂中给 予。类似地，如本文描述的缀合物和其他活性剂可以一起在单一肠胃外 剂量组合物如盐水溶液或其他生理上可接受的溶液中给予患者，或者每 种试剂在单独的肠胃外剂量制剂中给予。如果使用单独的剂量制剂，则 包含缀合物的组合物和一种或多种其他活性剂可以在基本上相同的时 间，即同时地，或分别在错开的时间，即连续地以及以任何顺序给予， 组合治疗被理解为包括所有这些方案。

因此，在某些实施方案中，还包括结合一种或多种其他治疗剂给予 本公开的缀合物组合物。此类治疗剂在本领域可以接受为用于本文描述 的特定疾病状态如风湿性关节炎、炎症或癌症的标准治疗。所考虑的示 例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAIDs、DMARDs、抗 炎剂、化疗剂、放射治疗剂或其他活性剂和辅助剂。

在某些实施方案中，本文公开的缀合物可以连同任何数目的化疗剂 或细胞毒素剂给予。化疗剂或细胞毒素剂的实例包括烷化剂如噻替哌 (thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphamide,CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消 安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶 (aziridines)如苯并多巴(benaodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌 (meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类 (methylamelamines)包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚胺嗪 (triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲 基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥、萘 氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺 (ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥 (melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松 龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲 (nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫 司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀 (ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、 重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素 (calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌素 (carzinophilin)、色霉素、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素 (daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素 (doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星 (idarubicin)、发波霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素 (nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、波非罗霉 素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星 (rodorubicin)、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美 司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨 甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶 呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、 6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧 尿苷、去氟氧尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU； 雄激素类如二甲睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone  propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄氨(mepitiostane)、睾内酯 (testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦 (mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋 葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙 酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)； 比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙 胺；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium  acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯 尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)； 莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮 芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基 酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.；雷佐生(razoxane)；西索菲兰 (sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2’’- 三氯三乙胺(2,2’,2’’-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺； 达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫 矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰 胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉化合物，例如紫杉醇(Bristol-Myers  Squibb Oncology,Princeton,NJ)和紫杉萜(Rhne-Poulenc  Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌 呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依 托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新 碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸 盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸 (DMFO)；维甲酸衍生物如Targretin^TM(蓓萨罗丁(bexarotene))、Panretin^TM(阿利维甲酸(alitretinoin))；ONTAK^TM(地尼白介素)；埃斯培拉霉素 (esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及前述任何物质的药学可接受 的盐、酸或衍生物。该定义中还包括发挥作用以调控或抑制激素作用于 肿瘤的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香 化酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷诺昔 芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)和托瑞米芬(Fareston)； 以及抗雄激素剂如氟他胺、尼鲁特米(nilutamide)、比卡鲁胺、亮丙瑞林 和戈舍瑞林；以及任何前述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。

多种其他的治疗剂可以连同本文描述的缀合物使用。在一个实施方 案中，所述缀合物与抗炎剂一起给予。抗炎剂或药物包括但不限于：类 固醇和糖皮质激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的 松、氢化可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、强的松、去 炎松)、非类固醇抗盐药物(NSAIDS)包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、氨 甲喋呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、抗-TNF药、环磷酰胺和霉酚酸酯。

可以将组合物对患有如本文中所描述疾病的个体给药，所述疾病包 括但限于肿瘤病、代谢病、神经疾病、感染、心血管疾病、炎性疾病、 自身免疫疾病以及与异常血管生成相关的疾病。具体疾病包括表达 Her2/neu的病症，如表达Her2/neu的癌症。

某些实施方案包括治疗个体内癌症的方法，包括将本文描述的p97- 抗体缀合物，或包含p97-抗体缀合物和药学可接受的载体或赋形剂的组 合物对个体给药。“癌症”通常涉及此类疾病或病症，其中细胞组群展现 一种或多种不受控制的生长(即分裂超过正常限制)、侵入(即侵入并破坏 邻近组织)，和/或转移(即通过淋巴液或血液蔓延至身体内的其他位置)。 癌症的这些恶性性能将它们与自我限制并且通常不侵入或转移的良性癌 症区分开来。

“癌症细胞”或“肿瘤细胞”是指癌生长或组织的单个细胞。肿瘤通常指 由细胞异常生长形成的膨大或病变，其可为良性的、恶性前或恶性的。 多数癌症形成实体瘤，但一些，例如，白血病，不一定形成肿瘤。对于 形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。一般实 例包括原发性癌症和转移性癌症。原发性或转移性癌症的具体实例包括 但不限于：前列腺癌、乳腺癌、胃肠癌(例如，结肠癌、结肠直肠癌、直 肠癌)、肺癌(例如，小肺细胞癌、非小肺细胞癌)、卵巢癌、睾丸癌、头 颈癌、胃癌、膀胱癌(例如，泌尿膀胱癌)、胰腺癌、肝癌、肾癌(例如， 肾细胞癌)、鳞状细胞癌、原发性和转移性CNS癌或脑癌(例如，成神经 细胞瘤、成胶质细胞瘤)、黑色素瘤如恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、 甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌(MTCs))、子宫内膜癌、上皮性肿瘤骨癌， 以及造血系统癌症如淋巴瘤(例如，T-细胞淋巴瘤如皮肤T-细胞淋巴瘤 (CTCL)、B-细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、间变性大 细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤)、白血病(例如，慢性淋巴细胞性白 血病(CLL)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、髓细胞性白血病、 急性骨髓性或髓细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍 奇金氏淋巴瘤。因此，在某些实施方案中，个体患有一种或多种上述癌 症。

某些实施方案涉及治疗中枢神经系统(CNS)，任选地脑的癌症的方 法。在一些实施方案中，所述癌症是CNS的原发性癌症，如脑的原发性 癌症。例如，该方法可以用于治疗胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神 经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤或原发性神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)。 在一些实施方案中，胶质瘤为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜细 胞瘤或脉络丛乳头状瘤。在某些实施方案中，原发性CNS癌或脑癌为多 形性成胶质细胞瘤，如巨细胞成胶质细胞瘤或神经胶质肉瘤。

在特定的实施方案中，癌症为CNS的转移性癌症，例如，已转移至 脑的癌症。此类癌症的实例包括但不限于：乳腺癌、肺癌、泌尿生殖道 癌症、胃肠道癌症(例如，结肠直肠癌、胰腺癌)、骨肉瘤、黑色素瘤、头 颈癌、前列腺癌(例如，前列腺的腺癌)以及造血系统癌症如淋巴瘤。因此， 某些实施方案包括通过将治疗有效量本文描述的p97-抗体缀合物对患者 给药来治疗、抑制或预防癌症转移的方法(例如，以这样的量，其在给予 后，以统计上显著的方式，即相对于如本领域技术人员已知的适当对照， 抑制、阻止或延缓抗体耐受性癌症的转移)。在特定的实施方案中，个体 患有还没有转移至中枢神经系统的癌症，包括一种或多种上述癌症，以 及本领域已知的其他癌症。

在一些方面，癌症或癌症细胞与以下中至少一种的表达相关： Her2/neu、Her1/EGF受体、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD20、CD22、 CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF (例如，VEGF-A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、 CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、 CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样 生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碳 酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸盐 受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白、α(FAP)、糖蛋白75、 TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜 抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成 员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40 泛癌抗原、B-细胞活化因子(BAFF)、血小板来源的生长因子受体、糖蛋 白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷 酸酶3(PRL-3)、前列腺酸磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(一种表达于神经 外胚层起源的肿瘤上的双唾液酸神经节苷酯)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3) 或间皮素。在特定方面，p97-抗体缀合物的单克隆抗体部分特异性结合一 种或多种前述癌症相关的抗原或癌症抗原。

具体方面涉及与Her2/neu表达相关的癌症治疗。例如，本发明的一 个实施方案提供了通过将治疗有效量本文公开的缀合物对患者给药来治 疗、抑制或预防癌症的方法，所述癌症包括但不限于表达Her2/neu的乳 腺癌和转移性乳腺癌。给予后，以统计上显著的方式(即相对于如本领域 技术人员已知的适当对照)抑制、预防或延缓癌症的进展和/或转移的量被 认为是有效的。

另一实施方案提供了通过将治疗有效量本文公开的缀合物对患者给 药来治疗、抑制或预防表达Her2/neu的乳腺癌的转移的方法(例如，以这 样的量，其在给予后，以统计上显著的方式，即相对于如本领域技术人 员已知的适当对照，抑制、预防或延缓癌症的转移)。

具体方面包括将p97-曲妥珠单抗用于治疗患有转移性乳腺癌的患 者，所述患者的肿瘤过表达Her2蛋白且已接受过一种或多种针对其转移 性疾病的化疗方案。一些方面包括将p97-曲妥珠单抗联合紫杉醇用于治 疗患有转移性乳腺癌的患者，所述患者的肿瘤过表达Her2蛋白且已接受 过针对其转移性疾病的化疗。

具体方面涉及治疗与Her1/EGFR表达相关的癌症。例如，某些方面 包括治疗转移性结肠直肠癌或头颈癌，其中p97-抗体缀合物特异性结合 Her1/EGFR，并且为EGFR拮抗剂。在一些方面，所述癌症为表达EGFR 的转移性结肠直肠癌，并且任选地为KRAS野生型。在具体方面，在基 于伊立替康和基于奥沙利铂的方案都失败后，将p97-抗体缀合物对患有 表达EGFR的转移性结肠直肠癌的个体给药。在一些方面，患有转移性 结肠直肠癌的个体不能耐受基于伊立替康的方案，或使用基于伊立替康 的化疗难以治疗。在其他方面，所述癌症为头颈局部或区域性晚期鳞状 细胞癌、头颈复发性局部区域性疾病或转移性鳞状细胞癌，或者基于铂 的治疗后发展的头颈复发性或转移性鳞状细胞癌。在这些和相关实施方 案的某些中，p97-抗体缀合物的抗体部分为西妥昔单抗或其抗原结合片 段。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合人Her-2/neu 的抗体如曲妥珠单抗，并且所述个体任选地患有乳腺癌或转移性乳腺癌， 或者(转移性)CNS癌，如本文中所描述。在其他实施方案中，p97-抗体 缀合物包含特异性结合GD2的抗体如3F8，并且所述个体任选地患有成 神经细胞瘤。在某些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CA-125 的抗体如阿巴伏单抗，并且所述个体任选地患有卵巢癌。

在特定的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EpCAM的抗 体如阿德木单抗，并且所述个体任选地患有前列腺癌或乳腺癌。在具体 的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD20的抗体如阿夫土珠 单抗，并且所述个体任选地患有淋巴瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体 缀合物包含特异性结合CD52的抗体如阿仑单抗，并且所述个体任选地 患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或CTCL。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合VEGF-R2的 抗体如培化阿珠单抗。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性 结合HLA-DR的抗体如阿泊珠单抗，并且所述个体任选地患有血液癌症。 在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合BAFF的抗体如贝 利木单抗，并且所述个体任选地患有造血系统癌症如非霍奇金氏淋巴瘤。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合VEGF-A的 抗体如贝伐单抗，并且所述个体任选地患有转移性癌症或结肠直肠癌。 在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD44的抗体如莫 -比伐珠单抗，并且所述个体任选地患有鳞状细胞癌。在具体的实施方案 中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD30的抗体如贝伦妥单抗-维多汀， 并且所述个体任选地患有血液癌症如间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)或霍奇 金氏淋巴瘤。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合粘蛋白的抗体 如莫-坎妥珠单抗，并且所述个体任选地患有结肠直肠癌。在具体的实施 方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合PSMA的抗体如卡罗单抗，并 且所述个体任选地患有前列腺癌。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物 包含特异性结合EpCAM且任选地CD3的抗体如西妥昔单抗，并且所述 个体任选地患有(转移性)结肠直肠癌或头颈癌。

在某些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EpCAM的抗体 如泊-西他珠单抗，并且所述个体任选地患有实体瘤如卵巢癌。在特定的 实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合IGF-1受体的抗体如西妥木 单抗，并且所述个体任选地患有实体瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体 缀合物包含特异性结合MUC1的抗体如clivatuzumab(tetraxetan)，并且所 述个体任选地患有胰腺癌。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD40的抗体 如达西珠单抗，并且所述个体任选地患有血液癌症。在一些实施方案中， p97-抗体缀合物包含特异性结合GD3神经节苷脂的抗体如依美昔单抗， 并且所述个体任选地患有恶性黑色素瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体 缀合物包含特异性结合EpCAM的抗体如依决洛单抗，并且所述个体任 选地患有结肠直肠癌。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合SLAMF7的 抗体如依洛珠单抗，并且所述个体任选地患有多发性骨髓瘤。在具体的 实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合整合素αvβ3的抗体如埃达 珠单抗，并且所述个体任选地患有黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌或其他 实体瘤。在某些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合叶酸盐受体 1的抗体如法勒珠单抗，并且所述个体任选地患有卵巢癌。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合IGF-1受体的 抗体如芬妥木单抗，并且所述个体任选地患有肾上腺皮质癌或非小细胞 肺癌。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合糖蛋白75 的抗体如flanvotumab，并且所述个体任选地患有黑色素瘤。在具体的实 施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD80的抗体如加利昔单抗， 并且所述个体任选地患有B-细胞淋巴瘤。

在特定的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD33的抗体 如吉妥珠单抗-奥佐米星，并且所述个体任选地患有骨髓性白血病。在具 体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CA-IX的抗体如吉瑞 昔单抗，并且所述个体任选地患有肾细胞癌。在其他实施方案中，p97- 抗体缀合物包含特异性结合GPMNB的抗体如格莱木单抗-维多汀，并且 所述个体任选地患有黑色素瘤或乳腺癌。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD20的抗体 如替-伊莫单抗，并且所述个体任选地患有造血系统癌症如非霍奇金氏淋 巴瘤。在一些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CTLA-4的抗 体如伊匹木单抗(MDX-101)，并且所述个体任选地患有实体瘤如黑色素 瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD51的抗体 如英妥木单抗，并且所述个体任选地患有实体瘤如前列腺癌或黑色素瘤。

在特定的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD30的抗体 如伊妥木单抗，并且所述个体任选地患有造血系统癌症如霍奇金氏淋巴 瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CEA的抗体 如拉贝珠单抗，并且所述个体任选地患有结肠直肠癌。在具体的实施方 案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD40的抗体如鲁卡木单抗，并且 所述个体任选地患有造血系统癌症如多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 或霍奇金氏淋巴瘤。

在某些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD23的抗体如 鲁昔单抗，并且所述个体任选地患有CLL。在具体的实施方案中，p97- 抗体缀合物包含特异性结合EGFR的抗体如马妥珠单抗，并且所述个体 任选地患有结肠直肠癌、肺癌或胃癌。在具体的实施方案中，p97-抗体缀 合物包含特异性结合CD74的抗体如米拉珠单抗，并且所述个体任选地 患有造血系统癌症如多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合GD3神经节苷 脂的抗体如米妥莫单抗，并且所述个体任选地患有小细胞肺癌。在具体 的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合5T4的抗体如他那莫单 抗，并且所述个体任选地患有非小细胞肺癌或肾细胞癌。在具体的实施 方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EGFR的抗体如奈昔木单抗， 并且所述个体任选地患有非小细胞肺癌。

在特定的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EGFR的抗 体如尼妥珠单抗，并且所述个体任选地患有鳞状细胞癌、头颈癌、鼻咽 癌或胶质瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD20 的抗体如奥法木单抗，并且个体任选地患有造血系统癌症如CLL。在具 体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CA-125的抗体如奥戈 伏单抗，并且所述个体任选地患有卵巢癌。

在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EGFR的抗 体如帕尼单抗，并且所述个体任选地患有结肠直肠癌。在一些实施方案 中，p97-抗体缀合物包含特异性结合波形蛋白的抗体如普立木单抗，并且 所述个体任选地患有脑癌。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特 异性结合CD20的抗体如利妥昔单抗，并且所述个体任选地患有造血系 统癌症如淋巴瘤或白血病。

在某些实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合CD20的抗体如 托西莫单抗，并且所述个体任选地患有淋巴瘤如滤泡性淋巴瘤。在具体 的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合GD2的抗体如TRBS07， 并且所述个体任选地患有黑色素瘤。在具体的实施方案中，p97-抗体缀合 物包含特异性结合整合素α5β1的抗体如伏洛昔单抗，并且所述个体任选 地患有实体瘤。

在特定的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合肿瘤抗原 CTAA16.88的抗体如伏妥昔单抗，并且所述个体任选地患有结肠直肠瘤。 在具体的实施方案中，p97-抗体缀合物包含特异性结合EGFR的抗体如 扎芦木单抗，并且所述个体任选地患有头颈鳞状细胞癌。

如上所示，可以将p97-抗体缀合物用于治疗癌症的用途与其他治疗 形式联合。例如，可以在其他治疗介入，包括症状护理、放射治疗、手 术、移植、免疫治疗、激素治疗、光动力治疗、化疗、抗生素治疗或任 何它们的组合之前、期间或之后，将包含p97-抗体缀合物的组合物对个 体给药。症状护理包括给予皮质类固醇来减少脑水肿、头痛、认知紊乱 和呕吐，以及给予抗惊厥剂来减少癫痫。放射治疗包括全脑辐照、分级 放射治疗和放射外科如立体定向放射外科，其还可以与常规外科组合。

在具体组合疗法中，p97-抗体缀合物的抗体部分包含西妥昔单抗，并 且所述p97-西妥昔单抗缀合物用于结合放射疗法治疗患有头颈局部或区 域性晚期鳞状细胞癌的个体。在其他方面，p97-西妥昔单抗缀合物用于结 合基于铂的使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的疗法治疗患有头颈复发性局部区域 性疾病或转移性鳞状细胞癌的个体。在一些情形下，p97-西妥昔单抗缀合 物被共价连接至基于铂的试剂如5-氟尿嘧啶。在一些方面，p97-西妥昔 单抗缀合物结合伊立替康使用，用于治疗患有表达EGFR的结肠直肠癌 且使用基于伊立替康的化疗难以治疗的癌症的个体。在具体例子中，p97- 西妥昔单抗缀合物被共价连接至伊立替康。

鉴定患有一种或多种本文描述的疾病或病症的个体的方法为本领域 已知。

对于人疾病治疗的体内应用，本文描述的缀合物在给予前通常被掺 入到药物组合物中。药物组合物包含一种或多种本文描述的缀合物并组 合有本文其他地方描述的生理上可接受的载体或赋形剂。为了制备药物 组合物，将有效量的一种或多种化合物与本领域技术人员已知的适用于 具体给予模式的任何药物载体或赋形剂混合。药物载体可以为液体、半 液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以 包括，例如，无菌稀释剂(如水)、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、 丙二醇或其他合成溶剂；抗微生物剂(如苄醇和尼泊金甲酯)；抗氧化剂(如 抗坏血酸和重亚硫酸钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(如乙 酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果经静脉内给予，合适的载体包括生理盐 水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)和含有增稠剂和增溶剂如葡萄糖、聚乙二醇、 聚丙二醇的溶液以及它们的混合物。

可以用保护所述缀合物免被从体内快速清除的载体如延时释放制剂 或包被来制备包含如本文描述的缀合物的组合物。此类载体包括受控释 放制剂，诸如但不限于，植入物和微胶囊递送系统，以及可生物降解的 生物相容性聚合物如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚正酯、聚 乳酸和本领域技术人员已知的其他制剂。

通过说明而非限制方式提供以下实施例。

实施例

实施例1

P97与抗-HER2/NEU抗体的缀合

将曲妥珠单抗(对Her2/neu蛋白具有特异性的人源化单克隆抗体并且 临床上被用于治疗HER2+乳腺癌)化学连接至p97递送载体(Transcend; BiOasis)上，如下所述。

抗体的初始制备

1.将特异性结合人Her2/neu蛋白的约100mg(包括赋形剂等的配制 后重量)的“BTA”抗体(Roche)溶解在1.5ml的去离子水中，并在单根PD10 柱(GE170851-01)上使其经缓冲液交换进入pH7.5的0.1M磷酸钾缓冲液 中，产生18.10mg/ml浓度的3.0ml抗体溶液，所述浓度通过可见光分光 光度法在280nm处显示，并假定该波长处1mg/ml抗体(抗体A)溶液的 吸光度为1.40。

2.将约100mg(包括赋形剂等的配制后重量)的“BTA”抗体(Roche)溶 解在4.0ml的去离子水中，并在3根PD10柱(GE170851-01)上使其经缓 冲液交换进入pH7.5的0.1M磷酸钾缓冲液中，产生6.50mg/ml浓度的 8.1ml抗体溶液，所述浓度通过可见光分光光度法在280nm处显示，并 假定该波长处1mg/ml抗体(抗体B)溶液的吸光度为1.40。

抗体的Cy5.5标记

3.向53.4mg(2.95ml)的抗体B中，加入1.89mg(189ul)溶于DMSO 的10.0mg/ml Cy5.5NHS酯(Lumiprobe24020)溶液，等同于7:1的Cy5.5: 抗体过量。.

4.允许染料-抗体反应在20℃下持续60分钟。

5.使用体积排阻色谱在两根PD10柱上纯化粗制抗体-染料缀合物， 利用pH7.5的0.1M磷酸盐钾作为洗脱液来去除低分子量副产物。这产 生了9.45mg/ml抗体浓度且每个抗体分子明显结合2.01个染料分子的染 料标记抗体溶液，其如通过可见光分光光度法在280nm和673nm处所 显示，并且假定该波长处1mg/ml抗体溶液的吸光度为1.40，并且673nm 处Cy5.5(染料标记的抗体B)的摩尔消光系数为133,000M^-1cm^-1。

将马来酰亚胺整合到未标记的抗体

6.向40mg(6.15ml)抗体A中，加入0.31mg(62ul)溶于DMSO的 5.0mg/ml4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC,Thermo22360) 溶液，等同于3.5:1的SMCC:抗体过量。

7.允许抗体活化反应在20℃下持续60分钟。

8.使用体积排阻色谱在4根PD10柱上纯化粗制马来酰亚胺活化的 未标记抗体，以去除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯化 钠、5mM EDTA缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生3.34mg/ml 抗体浓度的马来酰亚胺活化的未标记抗体溶液，其中假定该波长处1 mg/ml抗体(马来酰亚胺活化的未标记抗体A1)溶液的吸光度为1.40。

9.向5mg(769ul)的抗体A中，加入0.17mg(33ul)溶于DMSO的 5.0mg/ml4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC,Thermo22360) 溶液，等同于15:1的SMCC:抗体过量。

10.允许抗体活化反应在20℃下持续60分钟。

11.使用体积排阻色谱在单根PD10柱上纯化粗制马来酰亚胺活化的 未标记抗体，以去除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯化 钠、5mM EDTA缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生2.36mg/ml 抗体浓度的马来酰亚胺活化的未标记抗体溶液，其中假定该波长处1 mg/ml抗体(马来酰亚胺活化的未标记抗体A2)溶液的吸光度为1.40。

将马来酰亚胺整合到Cy5.5标记的抗体

12.向40mg(4.23ml)染料标记的抗体B中，加入0.45mg(89ul)溶 于DMSO的5.0mg/ml4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC, Thermo22360)溶液，等同于5:1的SMCC:抗体过量。

13.允许抗体活化反应在20℃下持续60分钟。

14.使用体积排阻色谱在3根PD10柱上纯化粗制马来酰亚胺活化的 染料标记抗体，以去除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯 化钠、5mM EDTA缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生4.46mg/ml 抗体浓度且每个抗体分子明显结合1.05个染料分子的马来酰亚胺活化的 染料标记抗体溶液，其如可见光分光光度法在280nm和673nm处所显 示，并且假定该波长处1mg/ml抗体溶液的吸光度为1.40，并且673nm 处Cy5.5(马来酰亚胺活化的染料标记抗体B1)的摩尔消光系数为133,000 M^-1cm^-1。

15.向5mg(529ul)染料标记的抗体B中，加入0.20mg(40ul)溶于 DMSO的5.0mg/ml4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC, Thermo22360)溶液，等同于18:1的SMCC:抗体过量。

16.允许抗体活化反应在20℃下持续60分钟。

17.使用体积排阻色谱在单根PD10柱上纯化粗制马来酰亚胺活化的 染料标记抗体，以去除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯 化钠、5mM EDTA缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生了1.85mg/ml 抗体浓度且每个抗体分子明显结合0.66个染料分子的马来酰亚胺活化的 染料标记抗体溶液，其如可见光分光光度法在280nm和673nm处所显 示，并且假定该波长处1mg/ml抗体溶液的吸光度为1.40，并且673nm 处Cy5.5(马来酰亚胺活化的染料标记抗体B2)的摩尔消光系数为133,000 M^-1cm^-1。

p97的初始制备

18.平行于步骤1-17，将约70mg的p97(BiOasis)在3根PD10柱上 经缓冲液交换进入pH7.5的0.1M磷酸钾缓冲液中，产生6.37mg/ml浓 度的11.2ml的p97溶液，所述浓度通过可见光分光光度法在280nm处 显示，并且假定该波长处1mg/ml p97溶液的吸光度为1.19。

p97的硫醇化

19.向54mg(8.48ml)经缓冲液交换的p97中，加入溶于DMSO的 0.41mg(82ul)的5.0mg/ml S-乙酰基巯基乙酸、琥珀酰亚胺基酯(SATA, Thermo26102)溶液，等同于3.2:1的SATA:p97比。

20.允许S-乙酰基硫醇化反应在20℃下进行55分钟。

21.加入848ul(pH7.0)的0.05M EDTA二钠盐和2.5M羟胺盐酸盐水 溶液，以对硫醇去保护，允许去保护反应在20℃下进行17分钟。

22.使用体积排阻色谱在5根PD10柱上纯化粗制的硫醇化p97，以 去除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯化钠、5mM EDTA 缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生了3.65mg/ml p97浓度的硫醇 化p97溶液，所述浓度通过可见光分光光度法在280nm处显示，并且假 定该波长处1mg/ml p97溶液的吸光度为1.19。利用Ellman's试剂分析样 品的硫醇含量，显示每个p97分子(硫醇化的p97C1)结合0.9个硫醇基团。

23.向8mg(1.26ml)经缓冲液交换的p97中，加入0.29mg(57ul)溶 于DMSO的5.0mg/ml S-乙酰基巯基乙酸、琥珀酰亚胺基酯(SATA,Thermo 26102)溶液，等同于15:1的SATA:p97比。

24.允许S-乙酰基硫醇化反应在20℃下进行55分钟。

25.加入126ul(pH7.0)的0.05M EDTA二钠盐和2.5M羟胺盐酸盐水 溶液，以对硫醇去保护，允许去保护反应在20℃下进行17分钟。

26.使用体积排阻色谱在单根PD10柱上纯化粗制硫醇化p97，以去 除低分子量副产物，利用50mM磷酸钾、150mM氯化钠、5mM EDTA 缓冲液pH7.0缓冲液作为洗脱液。这产生了2.83mg/ml p97浓度的硫醇 化p97溶液，所述浓度通过可见光分光光度法在280nm处显示，并且假 定该波长处1mg/ml p97溶液的吸光度为1.19。利用Ellman's试剂分析样 品的硫醇含量，显示每个p97分子(硫醇化p97C2)结合3.8个硫醇基团。

p97-抗体缀合物

27.(BOA2/1)5.0mg(1.50ml)马来酰亚胺活化的未标记抗体A1与 12.93mg(3.55ml)硫醇化p97C1，等同于4.0:1的p97:抗体比，允许在 20℃下一起反应18小时。

28.(BOA2/2)5.0mg(1.12ml)马来酰亚胺活化的染料标记抗体B1与 12.93mg(3.55ml)硫醇化p97C1，等同于4.0:1的p97:抗体比，允许在 20℃下一起反应18小时。

29.(BOA2/3)2.5mg(1.06ml)马来酰亚胺活化的未标记抗体A2与 12.93mg(3.55ml)硫醇化p97C1，等同于8.0:1的p97:抗体比，允许在 20℃下一起反应18小时。

30.(BOA2/4)2.5mg(1.35ml)马来酰亚胺活化的染料标记抗体B2与 12.93mg(3.55ml)硫醇化p97C1，等同于8.0:1的p97:抗体比，允许在 20℃下一起反应18小时。

31.(BOA2/5)23.0mg(6.89ml)马来酰亚胺活化的未标记抗体A1与 2.47mg(0.87ml)硫醇化p97C2，等同于1:6.0的p97:抗体比，允许在 20℃下一起反应18小时。

32.(BOA2/6)23.0mg(5.16ml)马来酰亚胺活化的染料标记抗体B1 与2.47mg(0.87ml)硫醇化p97C2，等同于1:6.0的p97:抗体比，允许 在20℃下一起反应18小时。

33.利用Vivaspin6(30kDa阈值)旋转过滤器将来自步骤27-32的6 种粗制抗体-p97和抗体-Cy5.5-p97缀合物浓缩至1–1.5ml，并通过高分 辨率体积排阻色谱，利用1.6x36cm Superdex200PG柱在2.0ml/min下 纯化，用pH6.7的50mM磷酸钾缓冲液+150mM氯化钠作为洗脱液。

34.该产生的缀合物具有近似显示如下的p97:抗体比，所述比值通 过UV光谱光度测量和大小排阻色谱数据显示。

表2

缀合物 P97:抗体比 (BOA2/1) 1.3:1 (BOA2/2) 1.5:1 (BOA2/3) 3:1 (BOA2/4) 3:1 (BOA2/5) 1:2.5 (BOA2/6) 1:2.5

实施例2

P97-HER2/NEU抗体缀合物促进乳腺癌细胞的细胞死亡

本实施例证明，相比未与p97缀合的抗-Her2/neu抗体，本发明的 p97-Her2/neu抗体缀合物具有针对乳腺癌细胞的提高的活性。

针对乳腺癌细胞系MCF-7载体、MCF-7/Her2、BT474和SKBr3测 试了以下所示化合物，下文有进一步描述。载体为PBS，pH6.7。

表3

化合物# 分子量(g/mol) 曲妥珠单抗 145,531.50 BOA2/1 250,000.00 BOA2/3 760,000.00 BOA2/5 530,000.00 hMTF (p97) 76,000.00

材料&方法

细胞系

将MCF-7载体(人乳腺癌)细胞系维持在以下条件下：RPMI1640介 质、2mM L-谷氨酰胺、10%FBS、500μg/mL G418。将MCF-7HER2(人 乳腺癌，转染的)细胞系维持在以下条件下：RPMI1640介质、2mM L- 谷氨酰胺、10%FBS、500μg/mL G418。将SKBR3(人乳腺癌)细胞系维 持在以下条件下：McCoys5A介质、1.5mM L-谷氨酰胺、10%FBS。将 BT474(人乳腺癌)细胞系维持在以下条件下：DMEM介质、2mM L-谷氨 酰胺、10%FBS。

细胞生长优化

在药物筛选研究前进行了细胞生长优化研究。细胞生长研究的目的 是确定每种细胞系的最优接种密度，以确保96小时孵育(在低和高血清条 件下)后达到95-100%汇合(confluency)，并且确定Hoechst33342(H33342) 的最优染色条件。测定了以下细胞密度：正常血清条件(表4)下50μL中 500、1000、1500、2000、2500和3000细胞/孔，以及低(1%)血清条件(表 5)下50μL中2000、4000、6000、8000、10000和12000细胞/孔。基于 下述表格在2mL96-孔深块中将细胞稀释至不同浓度：

表4.正常血清条件

表5.低血清条件

*采用60,000/25mL的细胞储备溶液，旋转沉积并加入6.5mL介质

通过使用Hydra从96-孔深孔板转移至对应的Grenier Bio中的4象限 孔或使用多通道移液管进行接种。向384-孔板的每个孔加入50μL，重复 此操作。24小时后，吸取介质并用含有正常血清或没有血清的介质替代。 在吸取步骤中，去除了约45μL的介质，并用新的介质替代。在将得到 成像的1个平板上每天进行染色。比较每种细胞系随时间进程的图像来 确定最优接种密度。

Hoechst33342染色优化

Hoechst33342的优化对给出最强的信噪比而不沉淀染料或杀伤细胞 是重要的。Hoechst33342是标记细胞核以允许基于高效成像的分割和计 数的细胞通透性染料。测试了4种不同浓度的Hoechst33342(0.5、1、5、 10μM)的效力。EthD1是结合细胞膜已破坏(即死细胞)的细胞的核中DNA 的膜不通透性核酸染料。EthD1以1μM的终浓度使用。这两种染色剂提 供了鉴定活/死细胞以用于有效的细胞计数的系统化方法。使用1个平板， 在细胞培养介质中将Hoechst33342稀释至下表所示的工作浓度：

表6

将10μL的染色溶液加入到每个孔中，并在37℃、5%CO₂下孵育30分钟，以允许 染料摄取。在InCell Analyzer1000细胞分析仪上完成图像优化。

药物筛选方案：

第0天：细胞接种-384孔板：

收获细胞并基于细胞生长优化研究中的最优细胞数目将其接种在两 个384-孔Grenier Bio One TC处理过的μClear384平板中。根据分析平板 布局(120孔/细胞系)将50μL的储备细胞溶液加入到分析平板中。 第1天：药物处理：

在96-孔板中进行测试物品的系列稀释。在稀释测试物和对照物后， 根据以下显示的分析平板布局加入20μL/孔x2孔每药物浓度。

表7-示例性药物稀释库

下表显示了示例性稀释储备液来制备期望的工作溶液。

表8

稀释储备液来制备工作溶液。剂量基于Clin Cancer Res2004; 10:2512-2524。2004年4月8日在网上发表。

*这些为制备1mL材料的稀释。将其1份溶于10份的稀释制备10μg/mL等价物。

平板中使用的稀释方案为以上“示例性药物稀释库”中概述的方案。

表9

第2-3天：孵育：

将细胞和药物在37℃、5%CO₂下于潮湿培养箱中孵育72小时。

第4天：成像：

用基于染色优化研究的Hoechst33342(总细胞)和乙啡啶均二聚物 (Ethidium Homodimer)(死细胞)将平板染色，以确定活细胞计数。用GE InCell1000细胞成像和分析系统对平板成像。

结果

利用基本上如上所述的方案，测试了相比未缀合物的抗-Her2/neu抗 体，本发明的不同缀合物针对乳腺癌细胞系的活性。细胞活力检测结果 概述在图1-4中。令人吃惊的是，在一些HER2+乳腺癌细胞系中，相比 仅曲妥珠单抗，p97-抗体缀合物展示显著提高的癌症杀伤活性。例如，对 于BT474细胞系(图1)，缀合物BOA2/1和BOA2/5在229nM时显示对 细胞死亡的极大效应。这些缀合物对细胞活力的效应比观察到仅用曲妥 珠单抗(BOA2/8)处理的细胞的效应要大得多。

另外，其他实验结果证明，曲妥珠单抗在培养中不进入人脑内皮(HBE) 细胞，在动物体内也不穿透完整的血脑屏障。然而，p97-抗体缀合物显示 进入HBE细胞的明显运输，表明该缀合物具有穿透血脑屏障并进入脑组 织的潜能。

鉴于这些发现，很明显本发明的缀合物通过提高抗体活性和/或允许 抗体接近CNS中的表达Her2/neu的转移性癌症细胞，可以提高抗 -Her2/neu抗体的治疗潜能。

实施例3

P97-曲妥珠单抗缀合物在脑组织中的分布

进行了实验来评估p97-曲妥珠单抗(赫赛汀)缀合物在脑组 织隔室中的分布。首先，经静脉注射以下若丹明标记的蛋白到约23克大 小的小鼠体内：以约4.35mg/kg注射100μg p97-若丹明；以约8.47mg/kg 注射195μg p97-若丹明；以约16.3mg/kg注射375μg p97-BTA-若丹明； 以及仅注射若丹明。

对于标记的蛋白，在IV注射后2小时收集3段20μm部分和3段 50μm部分，并在IV注射后24小时收集2段20μm部分和2段50μm 部分。对于仅若丹明，在IV注射后2小时收集4段20μm部分和2段 50μm部分。这些部分被送至iCapture成像设备用于共聚焦分析。

测量了血管隔室(毛细血管)和脑实质(除管隔室外的所有组织)的 20μm部分中的体素数目。体素为取自组织部分的共聚焦成像的三维像 素。用脑实质中荧光体素的数目除以体素总数目即得出实质中给定缀合 物的体积分数。用脑毛细血管中荧光体素的数目除以体素总数目即得出 脉管系统(毛细血管)中缀合物的体积分数。

结果显示在图5A-5D中。在这些图中，“MTf”为p97，并且“BTA” 为曲妥珠单抗。图5A显示了p97-曲妥珠单抗(BT2111;MTf-BTA)标准化 为注射剂量时在脑组织中的分布，并且图5B显示了标准化为荧光性时的 分布。这里，在毛细血管中发现了多个荧光蛋白，但相对于仅p97或仅 曲妥珠单抗，p97-曲妥珠单抗缀合物选择性分布至实质，尤其是在2小时 的时间点。该结果在图5C中和图5D中得到进一步证实，图5C显示对 于p97-曲妥珠单抗缀合物定位于脑实质的荧光性显著增加，图5D表明 p97-曲妥珠单抗缀合物的实质水平是仅曲妥珠单抗的12倍，且是仅p97 的4倍。

这些发现表明，相对于每种蛋白的单独递送，p97和曲妥珠单抗组合 为蛋白缀合物协同增加了穿透血脑屏障至实质脑组织的递送。

实施例4

P97-曲妥珠单抗缀合物在脑转移中的分布

进行了实验来评估²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物相对于仅曲妥珠 单抗在正常脑组织和脑转移中的分布。还检查了在全身组织中的相对分 布。

对患有乳腺癌的实验性脑转移的小鼠进行了放射标记的p97、曲妥珠 单抗和p97-曲妥珠单抗的静脉内药物给予。具体来说，这些肿瘤实验利 用免疫力低下的NuNu小鼠(Charles River Labs)，其通过经心脏内注射植 入表达eGFP的MDA-MB-231BR高Her-2人乳腺癌细胞。允许肿瘤细胞 植入脑中并在约3-6周的期间内形成脑转移。

一旦动物开始展现肿瘤生长症状即给予测试药物。然后通过放射、 荧光和定量放射自显影分析进行组织分布的监视。使用¹²⁵I标记的p97、 曲妥珠单抗和p97-曲妥珠单抗蛋白，在如通过HPLC测得的>99%的纯度 下进行这些实验。

在2、8和24小时的时间点检查放射标记蛋白的摄取。在安乐死前 约10min–2hr，还给予(i.v.)德克萨斯红-葡聚糖来测量血液-肿瘤屏障被 动渗透。在安乐死后约30-60秒，将脑用2.7%白蛋白和吲哚菁绿灌注来 描绘脑和脑转移中的血管分布，并且用来去除血管内标记的蛋白。灌注 冲刷后立即将脑速冻，并使用低温恒温器切割成20μm冠脉部分。分析 这些部分的绿、红和近红外荧光，来分别描绘肿瘤细胞的脑分布图、定 量血液-肿瘤屏障渗透性和定位肿瘤内的脉管系统。在匹配的组织部分中， 通过磷光成像连同放射性标准测量脑中¹²⁵I-蛋白的分布。分析后，将组织 部分染色来确认肿瘤细胞分布。还进行了解剖来测量和比较其他组织中 ¹²⁵I-蛋白(dpm/g)的水平/分布，包括肝、肾、肺、心脏、脾、肌肉和脂肪。

成像分析被用来测定选定的脑转移和周围正常脑中¹²⁵I标记的蛋白 水平，并被用来获得以nCi/g组织或ng蛋白/g组织为单位表示的放射自 显影图像。分析了关于转移大小、血液-肿瘤屏障渗透性和流通时间的脑 转移中标记的蛋白的摄取。还进行了计算来测量完整药物对脑、脑转移、 血液和其他组织的百分比剂量/g或ml。

结果显示在图6-10中。图6和7显示了¹²⁵I标记的曲妥珠单抗的结 果，并且图8-10显示了¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的结果。

图6A-6F显示了静脉内给予后24小时，¹²⁵I标记的曲妥珠单抗在小 鼠脑中的分布。图6A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转移，并且图 6B显示了该转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图6C显示了¹²⁵I标记的曲 妥珠单抗的放射自显影图，并表明了相对于周围正常脑组织该抗体的倍 数增加。这里，¹²⁵I标记的曲妥珠单抗处于检测极限。如图6F中所显示， 正常脑组织中仅曲妥珠单抗的K_in值为约1.46x10^-7mL/sec/g，并且在脑 转移中为约3.8x10^-7mL/sec/g，对于蛋白来说为相对低的K_in值，并且比 p97-曲妥珠单抗缀合物的K_in值低约～1000。

图7A-7D显示了静脉内给予后24小时时¹²⁵I标记的曲妥珠单抗在小 鼠脑和其他组织中的分布。图7A显示了红色边缘区域内大小不均的脑转 移，并且图7B显示了该转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图7C显示了¹²⁵I 标记的曲妥珠单抗的放射自显影图，并指明了该抗体相对于周围的正常 脑组织成倍增加。图7D显示了不同组织中¹²⁵I标记的曲妥珠单抗的组织 与血液比。这里，对于肺和脾，曲妥珠单抗以约0.2至0.3的组织与血液 比在器官中分布，并且相对于肝，心脏中的分布相当高。正常脑组织和 脑转移中的分布相对低(见图7D中的插图)。脑/血液的0.02的比值非常 低，且仅稍微高于血管间隙中发现的量(即脑脉管系统中发现的曲妥珠单 抗的量，其为约0.01至0.02)。在脑转移中观察到非常少的摄取，尽管这 些转移展示显著的泄露(见图7B)。

图8A-8F显示了静脉内给予后2小时，¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗在 小鼠脑和其他组织中的分布。图8A显示了红色边缘区域内大小不均的脑 转移，并且图8B显示了该转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图8C显示了 ¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的放射自显影图，并且图8C的左图表 明了在每个转移中发现的缀合物的量(ng/g)。图8B的左图显示了相对于 图8A中显示的脑远离肿瘤(BDT)区，每个转移中发现的p97-曲妥珠单抗 缀合物成倍增加。图8D显示了多种组织的p97-曲妥珠单抗缀合物的组织 /血液比。这里，至心脏的分布显著少于至其他组织的分布(例如，少于肺、 肝和脾约10x)。图8E显示了正常脑/血液和脑转移/血液中的p97-曲妥珠 单抗缀合物比值。正常脑/血液的该比值为约0.06(相比仅¹²⁵I标记的p97 的0.04，数据未显示)，并且脑转移/血液的该比值为约0.14(相比仅¹²⁵I 标记的p97的0.06，数据未显示)。图8F概述了单个脑转移中发现的¹²⁵I 标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的浓度，其中浓度为约25-175ng/g组织。

图9A-9F显示了静脉内给予后8小时，¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗在 小鼠脑和其他组织中的分布。图9A显示了红色边缘区域内大小不均的脑 转移，并且图9B显示了该转移的德克萨斯红-葡聚糖染色。图9C显示了 ¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的放射自显影图，并且图9C的左图表 明了每个转移中发现的缀合物的量(ng/g)。图9B的左图显示了相对于图 9A中显示的脑远离肿瘤(BDT)区，每个转移中发现的p97-曲妥珠单抗缀 合物的倍数增加。图9D显示了多种组织的p97-曲妥珠单抗缀合物的组织 /血液比。因此，p97-曲妥珠单抗至心脏的分布显著少于至其他组织的分 布。图9E显示了正常脑/血液和脑转移/血液中的p97-曲妥珠单抗缀合物 比值，其中正常脑/血液中的比值为约0.04(相比2小时时间点的0.06，见 图8E)，并且脑转移/血液的比值为约0.44(相比2小时时间点的0.14，见 图8E)。图9F概述了单个脑转移中发现的¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀 合物的浓度，其中浓度为约25-125ng/g组织。

图10A-10E概述了来自静脉内给予¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合 物后2小时至8小时时间点的数据。图10A显示了多种组织的p97-曲妥 珠单抗缀合物的组织/血液比值。2小时至8小时时间点之间的比值变化 不大；然而，心脏组织中缀合物的比值(水平)显著低于其他组织(例如， 约10x低于肺和肝组织中的比值)。相反，仅曲妥珠单抗在心脏组织中的 分布类似于肝(见图7D)。图10B显示正常脑组织中缀合物的水平在8小 时时间点时稍微偏低(相对于2小时时间点)，并且在那一相同时间点时脑 转移中缀合物的水平显著偏高。图10C显示了测得的正常脑组织(1.1x10^-4mL/sec/g)和脑转移(4.9x10^-4mL/sec/g)中p97-曲妥珠单抗缀合物的K_in值。 相比曲妥珠单抗的K_in值(见图6F)，p97-曲妥珠单抗缀合物以相比仅曲妥 珠单抗约1000倍的更快速度运输到脑内。图10D显示了在2小时和8小 时的脑组织中注射剂量的百分比，并且图10E概述了给予后2小时和8 小时，单个脑转移中¹²⁵I标记的p97-曲妥珠单抗缀合物的浓度。

还基于来自2小时和8小时时间点时的数据计算了p97-曲妥珠单抗 缀合物的药代动力学谱图。这些数据显示在以下的表10中。

表10

参数 值 单位 K_e0.297 hr^-1V_d10.76 mL t_1/22.32 hr Cl 3.202 mL/hr AUC_0-∞2.523 μCi×hr/mL 剂量 8.08 μCi/mL F 1 [无单位]

总之，这些数据强烈地表明可以在脑组织转移中达到治疗有效浓度 的p97-曲妥珠单抗缀合物，即使通过全身(例如，经静脉内)给予此类缀合 物。这些数据还表明相对于正常脑组织，p97和曲妥珠单抗一起协同作用 使得p97-曲妥珠单抗缀合物选择性靶向至脑转移中，并以相比仅曲妥珠 单抗显著偏大的速率(～1000倍)靶向。因此，缀合至p97不仅增加曲妥珠 单抗穿透血脑屏障的运输，还增加穿透血液-肿瘤屏障的运输。另外，由 于相对于其他组织至心脏组织的分布减少，这些数据表明缀合至p97可 以减少诸如曲妥珠单抗的抗体心脏毒效应。

实施例5

P97-西妥昔单抗缀合物的制备和体外细胞毒性测定

在两个人癌症细胞系——A-431和HT-29中进行体外抗癌功效测定， 以评估相对于仅p97和作为载体对照的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)，西妥昔 单抗和p97-西妥昔单抗缀合物的相对功效的IC₅₀。A-431细胞系为表达 EGFR的人表皮样癌，并且HT-29细胞系为人结肠直肠癌。

如上所示，p97(黑素转铁蛋白)为属于铁结合家族蛋白的单体型唾液 酸糖蛋白，所述铁结合家族蛋白包括转铁蛋白、乳铁蛋白和卵清铁传递 蛋白(ovatransferrin)。其最初被鉴定为黑色素瘤细胞表面上97kD、GPI 连接的膜结合蛋白，并被指定为黑色素瘤相关的抗原p97。已经利用重组 技术制备了缺少GPI锚的可溶形式(82kD)。西妥昔单抗()为一种 许可用于治疗某些人癌症的人IgG₁单克隆抗体药物，其通过作用于EGFR 的细胞外结构域发挥作用，并且其作用机制与通过干扰配体结合阻止 EGFR活化相关。

通过将可溶的p97经硫醚连接子共价连接至西妥昔单抗制备p97-西 妥昔单抗缀合物。图11A显示了室温下24小时后粗制反应混合物的HPLC 谱图。

随后通过大小排阻HPLC分析反应产物来确定浓度，并通过 SDS-PAGE确定分子量。用1X PBS将浓缩的无菌p97-西妥昔单抗缀合物 的等分试样稀释10倍，并将等分试样注射入HPLC大小排阻柱。如图11B 中所显示，洗脱谱图显示了主要的峰(96%)，其Rt为8.875分钟，早于西 妥昔单抗(9.70min)或p97(10.03min)的Rt。将220nm处的峰面积(1856.9) 与p97和西妥昔单抗标准曲线一起使用来确定产物的浓度为4.0mg/ml。

对于SDS-PAGE分析，将纯化的蛋白或反应混合物(每种1μg)样品 在4%-12%bis-tris凝胶上用1X MES SDS电泳缓冲液、在非还原条件下 (Invitrogen1-12%Bis-Tris midi凝胶)分析。将凝胶在恒 定125V下运行150分钟，并用SimplyBlue^TMSafeStain(Invitrogen)染色。 如图12中所显示，基于与蛋白梯分子量标准比较，缀合物的分子量估计 为约230KDa；该估计值与1:1的p97-西妥昔单抗比一致。

对于体外活性测定，将A-431细胞首先在包含10%FBS的ATCC配 制的杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中 增殖，并且HT-29细胞在包含10%FBS的ATCC配制的改良McCoy's5a 培养基中增殖。为了确保可靠的IC₅₀分析结果，基于通过显微镜检查得 到的细胞形态，通过排斥试验监测到的增殖倍增时间和使用测试剂处理 前的细胞分裂比数据证实了最优培养条件。

对于每种测试剂浓度点和所有对照，在3天的处理孵育期间以浓度为 1%和10%的两种胎牛血清(FBS)，在平底96-孔板中以一式三份进行IC₅₀测定。基于相关的人肿瘤细胞系中西妥昔单抗的IC₅₀，以覆盖1000倍剂 量范围的8种浓度将测试剂和对照给予到每种细胞系培养物。具体来说， 评估了溶于PBS中的两种测试剂(西妥昔单抗和p97-西妥昔单抗)中的每 种以及对照(p97)和载体(PBS)的半对数浓度规模的总共8种测试剂浓度， 所述浓度显示在以下的表11中。

表11

测试物品和对照 测试浓度(μg/mL) 西妥昔单抗(阳性对照) 0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100和300 P97-西妥昔单抗 0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100和300 MTf 0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100和300 PBS(载体对照) 相对于孵育培养基，10%的加标体积

在两种细胞培养物中的每种中孵育测试剂72小时后，进行了MTT细 胞毒性测定，用于根据BRI SOP:SOP-TM-GEN-029(MTT实验)评估细胞 细胞凋亡。然后用通过SpectraMax^TM软件(Molecular Devices)和 SigmaPlot^TMV5.0操作的SpectraMax^TMM2平板读取器生成IC₅₀值和药物 响应曲线。

可以将以上描述的不同实施方案组合来提供其他的实施方案。本说 明书中提及的和/或本申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请 公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过 引用整体并入本文中。如有必要采用各种专利、申请和出版物的构想来 提供其他的实施方案，可以修改实施方案的方面。

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