一种新型氮杂吲哚-2-酮类FGFR1抑制剂及其抗肿瘤活性

摘要

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的新型氮杂吲哚-2-酮类FGFR1非ATP竞争性抑制剂。另外，本发明还提供了这些化合物的药物组合物以及抗肿瘤用途等。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及具有抗肿瘤作用的氮杂 吲哚-2-酮类化合物的化学结构。另外，本发明还涉及该种化合物的FGFR1非 ATP竞争性抑制机制以及抗肿瘤用途等。

背景技术

成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor receptor，FGFR)属于受 体型蛋白酪氨酸激酶，参与调节细胞增殖、凋亡、新生血管生成、迁移及侵袭 等过程。目前已知的FGFR主要包括4种类型，即FGFR1、FGFR2、FGFR3及 FGFR4，其中FGFR1与肿瘤的关系最为密切。作为重要的抗肿瘤药物作用靶点， FGFR1的小分子抑制剂的研发受到越来越多的重视，目前尚未有FGFR1抑制剂 进入临床使用，因此开发具有我国自主知识产权的新型FGFR1小分子抑制剂具 有十分重要的意义。此外，FGFR1小分子抑制剂可以抑制肿瘤组织新生血管的 生成及肿瘤细胞的生长、分裂和转移，且不杀伤正常细胞，安全性高，具有很 好的发展前景。

目前的FGFR1小分子抑制剂大部分为ATP竞争性抑制剂，这些传统的ATP 竞争性抑制剂药物有着共同的缺点：1)特异性靶向性差，毒副作用大，易产生 多药耐药；2)对FGFR1的抑制效果会受到环境ATP浓度的影响，在高ATP浓 度的组织或细胞状态中易失去药理作用。鉴于非ATP竞争性抑制剂在以FGFR1 为靶点的新药设计和研发中的重要性，寻找新的非ATP竞争性小分子抑制剂成 为是目前的FGFR1靶向药物的研究热点。非ATP竞争性抑制剂是指小分子作用 于非ATP结合域或形成非活性的ATP结合口袋。

目前还没有氮杂吲哚-2-酮类FGFR1非ATP竞争性小分子化合物的研究报 道，本发明人经过长期和艰苦的研究实验，设计、合成最终得了一系列氮杂吲 哚-2-酮类化合物，并经药理活性检测发现它们具有良好的FGFR1体内外抑制活 性及靶向选择性，尤其是其属于非ATP竞争性抑制剂，能用于治疗各种FGFR1 高表达的肿瘤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供新的FGFR1抑制剂抗肿瘤化合物类型及其 药物。具体而言，本发明提供了式(A116)所示的化合物或者其药学上可接受 的盐：

化合物(A116)为：

(Z)-3-[4-(4-甲基-哌嗪)苄叉苯胺]-1H-吡咯[2，3-b]并吡啶-2(3H)-酮

(Z)-3-[4-(4-Methylpiperazin-1-y1)benzylidene]-1H-pyrrolo[2，3-b]pyridin-2(3H)-one

本发明的目的之一是提供一种新型的氮杂吲哚-2-酮类FGFR1抑制剂。

本发明的目的之二是提供一种新型的FGFR1抑制剂的制备方法及抗肿瘤活 性。

在本发明中，我们首先利用化学方法合成了新型的氮杂吲哚-2-酮类化合物 A116。利用体外激酶层次上的活性筛选实验证实了化合物A116具有强烈的 FGFR1抑制活性，同时，对其它激酶抑制活性较弱，具备良好的激酶选择性(详 情见实施例1)。细胞层面上实验也证实这两个化合物可以有效抑制FGFR1及其 下游信号p-Akt和p-Erk的磷酸化水平(详情见实施例2)。我们利用激酶ATP 竞争性抑制实验考察了化合物A116对FGFR1的抑制结合模式，本发明的所涉 及的化合物与FGFR1的抑制结合方式为非ATP竞争性抑制(详情见实施例3)。

附图说明：

这里所列举的化合物只是为了更好地说明本发明的化合物类别和结构形 式，并非限制本发明。

图1说明合成的化合物A116的化合物结构；

图2说明激酶选择性抑制测试；

图3说明化合物细胞水平上化合物的抗肿瘤活性验证；

图4说明化合物可有效抑制H460肿瘤细胞中EGFR及其下游蛋白的磷酸化；

图5化合物A116对FGFR1的非ATP竞争性抑制结合模式。

实施例1化合物体外抑制FGFR1的活性和选择性

FGFR1激酶体外活性筛选：实验采用方法为Caliper Mobility Shift Assay， 该方法是以微流体芯片技术的迁移率检测技术为核心的检测平台。实验步骤： 配置1.25x激酶反应缓冲液(62.5mmol/L HEPES，pH7.5；0.001875％Brij-35； 12.5mmol/LMgCl2；2.5mM DTT)和激酶反应终止液(100mmol/L HEPES，pH 7.5；0.015％Brij-35；0.2％Coating Reagent#3)；在5μ1的5x浓度的化合物溶液 中(用DMSO溶解，用水稀释10倍)加入10μl的2.5x的FGFR1激酶溶液 (在1.25x激酶反应缓冲液中加激酶)，室温孵育10min后再加入10μl的2.5x 底物肽溶液(在1.25x激酶反应缓冲液中加FAM标记肽和ATP)，在28℃下反 应特定的时间后加入25μ1激酶反应终止液。在Caliper上测试收集数据，对激 酶活性的抑制率＝(max-conversion)/(max-min)*100。“max”为未加化合物的 DMSO对照，“min”为低对照。测定IC₅₀时样品设10个稀释度各2个复孔，3 次重复。

激酶选择性抑制测试：将A116依照上述激酶抑制活性测定方法，测定它们 对VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR2～3等6种常见激酶的抑制活性，以表征这 两种化合物对激酶的选择性。

激酶实验表明：化合物A116对FGFR1在10um浓度下的抑制活性为0.4un。 对其它常见6种激酶的抑制活性均大于30um(实验数据见图2)，因此具有良 好的FGFR1抑制活性和激酶选择性。

实施例2细胞水平上化合物的抗肿瘤活性验证

将化合物A116分别用DMSO配置成5、10和20um浓度的溶液，用bFGF及 bFGF联合上述不同浓度的活性化合物分别处理FGFR1高表达的H460和MRC-5 细胞，检测两中化合物的抗肿瘤增殖活性；同时，提取细胞总蛋白，利用Western  blotting检测细胞内bFGF/FGFR信号通路中促增殖信号分子FGFR、ERK和AKT 磷酸化水平的变化。化合物A116具有较好的抗肿瘤增殖活性，并在5、10和 20um三种浓度下均可强烈抑制p-FGFR1，p-AKT和p-ERK水平(见图3)。

实施例3化合物A116对FGFR1的非ATP竞争性抑制结合模式

选择化合物A116，利用激酶抑制活性筛选方法，从0～100μmol/L之间配置10 个浓度梯度，每个浓度均分别在8种不同ATP浓度的反应体系中测试对FGFR1 激酶催化底物肽转化的影响，通过GraphPad Prism等软件拟合竞争性或非竞争 性抑制曲线，计算各浓度下的米氏常数(Km)和酶促最大反应速率(Vmax) 等非ATP竞争性酶抑制反应参数。实验结果如图4所示，标准物pd173074对比， 随着ATP浓度的增加，化合物A116与FGFR1结合均不受ATP浓度的影响，表 明其与FGFR1的抑制结合方式均为非ATP竞争性抑制。