一种利用细菌氧化糠醛衍生物制备糠酸和5-羟甲基糠酸的方法

摘要

本发明涉及一种利用细菌氧化糠醛衍生物制备糠酸和5-羟甲基糠酸的方法，包括：（1）从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环醋酸杆菌接入液体种子培养基中，在20-30℃下培养12-24小时，以活化菌种；（2）将种子液接入到液体发酵培养基中，于20-30℃摇床培养或者静置培养12～48h；（3）待液体发酵培养基中有大量的絮状物生成，向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛及其衍生物溶液，使培养基中糠醛及其衍生物的终浓度达到1-50mmol/L，于20-35℃摇床培养或者静置培养0.5～7天后，即得。本发明转化得率较高，可达75-98%，反应条件温和、绿色环保，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于糠酸和5-羟甲基糠酸的制备领域，特别涉及一种利用细菌氧化糠醛衍生物制 备糠酸和5-羟甲基糠酸的方法。

背景技术

糠酸又称α-呋喃羧酸、2-呋喃甲酸或呋喃甲酸，常用作防腐剂、杀菌剂，也可用作有机 合成和医药中间体，以转化为酯、酰氯、酸酐、酰胺等衍生物，用于制造香料和药物等，在 塑料工业中可用于增塑剂，热固性树脂等。化学上一般以呋喃甲醛（糠醛）为原料，经氧化 或坎尼扎罗反应（Cannizzaro reaction）制取。以糠醛为原料制备糠酸时，在强碱性介质和催 化剂存在下，糠醛经空气氧化、硫酸酸化可制得糠酸，但在反应中有大量副产品糠醇产生。 5-羟甲基糠酸（5-hydroxymethylfurfural，HMF）又称为5-羟甲基-2-呋喃甲酸，可以通过氧化 等反应制备，也是重要的精细化工原料。

化学法制备糠酸和5-羟甲基糠酸的反应时间较长，溶剂用量大，转化率低，副产物多， 不易分离纯化，成本高，因此亟需开发新的技术方法生产糠酸类衍生物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用细菌氧化糠醛衍生物制备糠酸和5-羟甲基糠 酸的方法，该方法转化得率较高，可达75-98%，反应条件温和、绿色环保，具有良好的应用 前景。

本发明的一种利用细菌氧化糠醛衍生物制备糠酸和5-羟甲基糠酸的方法，包括：

（1）从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环醋酸杆菌接入液体种子培养基中，在20-30℃下 培养12-24小时，以活化菌种；

（2）将种子液按体积百分比6-10%接入到液体发酵培养基中，于20-30℃摇床培养或者静置 培养12～48h；

（3）待液体发酵培养基中有大量的絮状物生成，向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛及其衍 生物溶液，使培养基中糠醛及其衍生物的终浓度达到1-50mmol/L，于20-35℃摇床培养或者 静置培养0.5～7天后，即得糠酸和5-羟甲基糠酸。

所述步骤（1）中的醋酸杆菌为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属或葡糖酸醋杆菌属。

所述步骤（1）和（2）中的液体种子培养基和液体发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄 糖、蔗糖、甘油或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃ 灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘油或果糖20-100g，酵母浸膏5g，蛋白胨 或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。

所述步骤（1）中在液体种子培养基中培养是摇床培养，速度为160～180r/min。

所述步骤（2）和（3）中的摇床培养的速度为100-250r/min。

所述步骤（3）中的糠醛衍生物为5-羟甲基糠醛。

有益效果

本发明转化得率较高，可达75-98%，反应条件温和、绿色环保，与传统的化学法相比能 耗低、生产工艺简单、副产物少，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）氧化转化不同浓度糠醛的历程图；A为培 养基中添加0-40mmol/L糠醛时残余葡萄糖的变化情况；B为培养基中添加0-40mmol/L糠醛 时培养过程pH值的变化情况；C为培养基中添加0-40mmol/L糠醛时培养过程中活菌的增殖 情况；D为培养基中添加0-40mmol/L糠醛时糠醛浓度的变化；图中箭头表示添加糠醛的时 间点；

图2为木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）氧化转化不同浓度5-羟甲基糠醛的历程图； A为培养基中添加0-40mmol/L5-羟甲基糠醛时残余葡萄糖的变化情况；B为培养基中添加 0-40mmol/L5-羟甲基糠醛时培养过程pH值的变化情况；C为培养基中添加0-40mmol/L5- 羟甲基糠醛时培养过程中活菌的增殖情况；D为培养基中添加0-40mmol/L5-羟甲基糠醛时 5-羟甲基糠醛浓度的变化；图中箭头表示添加糠醛的时间点。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入 液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者甘油25g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L， pH3.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养12小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按6%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、甘露醇、蔗糖或者甘油25g、 蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5，121℃灭菌20min）中，于20℃、100r/min条件 下摇床培养或者静置培养12h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛（HMF）溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到10mmol/L，于20℃、100r/min条 件下摇床培养或者静置培养1天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的 转化率。

HPLC（Agilent1200series，C18柱配UV和DAD检测器）的检测方法：流动相为由含2 mmol/L甲酸的Milli-Q超纯水和含2mmol/L甲酸的乙腈组成的梯度洗脱流动相：先用3%乙 腈洗3min，然后在5min内乙腈浓度线性逐步提高到10%。流动相流速：0.4-0.5mL/min， 柱温：40oC，检测波长：254nm。

结果如图1和图2中10mM糠醛衍生物的情况。结果发现被转化的糠醛衍生物的量达到 100%，其中转化为糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分别占到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的93 和88%。

实施例2

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入 液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L， pH5.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养18小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按8%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、甘露醇、蔗糖或者果糖25g、 胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，于30℃、250r/min条 件下摇床培养或者静置培养18h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到5mmol/L，于35℃、250r/min条件下摇床培 养或者静置培养4天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率，检 测方法如实施例1。结果与图1和图2中10mM糠醛衍生物的情况类似。结果发现被转化的 糠醛衍生物的量达到100%，其中转化为糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分别占到初始糠醛和5- 羟甲基糠醛含量的95和90%。

实施例3

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入 液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L， pH5.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养24小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按10%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、 胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，于25℃、150r/min条 件下摇床培养或者静置培养48h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到40mmol/L，于30℃、150r/min条件下摇床 培养或者静置培养0.5天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率， 检测方法如实施例1。结果如图1和图2中40mM糠醛衍生物的情况。结果发现被转化的糠 醛和5-羟甲基糠醛的量分别达到20%和30%，其中转化为糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分别占 到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的20和29%。

实施例4

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans DSM 2003或者ATCC23773）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母 浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中， 在30℃下160转培养12小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按6%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸 膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中， 于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养1h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到50mmol/L，于20℃、100r/min条件下摇床 培养或者静置培养0.5天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率， 检测方法如实施例1。结果与图1和图2中40mM糠醛衍生物的情况类似。结果发现被转化 的糠醛和5-羟甲基糠醛的量分别达到50%和60%，其中转化为糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分 别占到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的42和55%。

实施例5

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans DSM 2003）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨 5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160 转培养14小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按10%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g， 酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min） 中，于30℃、250r/min条件下摇床培养或者静置培养48h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到50mmol/L，于35℃、250r/min条件下摇床 培养或者静置培养1天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率， 检测方法如实施例1。结果与图1和图2中40mM糠醛衍生物的情况类似。结果发现被转化 的糠醛和5-羟甲基糠醛的量分别达到20%和30%，其中转化为糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分 别占到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的30和39%。

实施例6

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus  ATCC23770或者ATCC53524）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g， 酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min） 中，在30oC下160转培养12小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按8%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g， 酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min） 中，于26℃、140r/min条件下摇床培养或者静置培养20h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到10mmol/L，于20℃、100r/min条件下摇床 培养或者静置培养2天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率， 检测方法如实施例1。结果发现被转化的糠醛和5-羟甲基糠醛的量都达到100%，其中转化为 糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分别占到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的95和87%。

实施例7

（1）活化菌种

从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter hansenii  ATCC23769）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g， 蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，在30℃ 下160转培养24小时，以活化菌种；

（2）扩培菌种细胞

将含有种子液按9%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g， 酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na₂HPO₄2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min） 中，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养36h后备用；

（3）分别加入糠醛或者5-羟甲基糠醛制备糠酸和5-羟甲基糠酸

待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的糠醛和5-羟甲基 糠醛溶液，使培养基中糠醛衍生物的终浓度达到10mmol/L，于25℃、180r/min条件下摇床 培养或者静置培养5天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的糠醛衍生物的转化率， 检测方法如实施例1。结果发现被转化的糠醛和5-羟甲基糠醛的量都达到100%，其中转化为 糠酸和5-羟甲基糠酸的含量分别占到初始糠醛和5-羟甲基糠醛含量的96和90%。