一种基于细胞代谢调控策略的普鲁兰多糖生产方法

摘要

本发明涉及一种利用细胞代谢调控技术提高细胞通透性生产普鲁兰多糖的新方法。通过在发酵培养基中添加0.02%~2.14%聚醚类物质和0.01%~1.35%表面活性剂类物质能够有效提高普鲁兰多糖的产量，提高底物的转化效率，缩短发酵周期，降低黑色素的生成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于细胞代谢调控策略的普鲁兰多糖生产方法，属于生物工程领域。

背景技术

普鲁兰多糖是由出芽短梗霉利用蔗糖、葡萄糖等小分子糖类发酵产生的一种水溶性大分子胞外多糖，由于其具有极佳的成膜性、可塑性、阻气性，被广泛应用于食品保鲜、医用材料、化妆品领域。普鲁兰多糖的生产方法主要是生物发酵法，但在其生产过程中一直存在着不少问题，其中出芽短梗霉发酵过程中周期长、分泌大量黑色素及底物糖的转化率低导致产量低、分离纯化过程复杂，大大增加生产成本，降低了产品品质，成为制约普鲁兰工业化生产的关键问题，因此，目前国内暂无普鲁兰多糖工业化生产的报道。

针对这些问题，目前国内外普遍采用的方法是通过筛选和诱变获得产色素少的菌株，但这些方法获得的菌株发酵产量低，周期依旧过长，而且还是有少量色素产生而难以除去。本发明通过改进发酵培养基，从细胞代谢调控的角度控制多糖的产生和色素的分泌，方法简单，效果显著。

发明内容

为解决普鲁兰多糖发酵生产过程中的关键技术难题，本发明的目的是提出一种基于细胞代谢调控策略的普鲁兰多糖生产方法。

本发明为解决技术难题所采用的技术方案是：

一种基于细胞代谢调控策略的普鲁兰多糖生产方法主要包括以下步骤：

（1）种子制备。将甘油管保存的菌种进行平板划线分离培养2~3 d，挑取长好的单菌落接入种子瓶，28~30℃，250~280 r/m摇床震荡培养24~36 h，对菌液计数，如达到10⁷个/mL说明菌液活化完好；

（2）发酵培养。将种子液按照2%~10%的接种量接种到发酵培养基中，28~30℃，250~280 r/m摇床震荡培养50~60 h，当测至普鲁兰多糖的含量不再增加，且残糖的浓度降低至1~5 g/L以下时，发酵结束；

（3）提取与纯化。普鲁兰多糖后处理提取与纯化包括过滤除菌、活性炭脱色、乙醇脱盐、脱水、真空干燥。

说明：步骤（1）所采用的种子培养基为：蔗糖 5%~8%，酵母膏0.2%~0.5%，磷酸氢二钾0.5%~0.8%，硫酸镁0.02~0.05%，硫酸铵0.05%~0.08%，氯化钠0.05~0.15%；步骤（2）所采用的发酵培养基为：蔗糖 10%~15%，酵母膏0.2%~0.5%，磷酸氢二钾0.5%~0.8%，硫酸镁0.02~0.05%，硫酸铵0.05%~0.08%，氯化钠0.05~0.15%，聚醚0.05%~5.0%，表面活性剂0.01%~0.1 %。

该发明的有益效果是：通过在发酵过程中添加聚醚类物质和表面活性剂类物质，增强出芽短梗霉细胞膜的渗透性，提高了细胞内外物质转运的速率，降低胞内多糖积累对细胞的反馈抑制作用，细胞新陈代谢速率得到提高，发酵周期缩短至50-55h，底物转化率达到70%以上，普鲁兰多糖的产量和底物转化率得到明显提高。而且产生的色素少且容易出去，最种产品颜色好、品质高。

该发明的有益效果对其他产品特别是胞内产物应用细胞代谢调节技术提高发酵的产量、底物转化率和生产强度具有一定的帮助。

具体实施方式

对照例

（1）种子培养基配制及灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 5%，酵母膏0.2%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.1%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（2）种子制备；将甘油管保存的菌种进行平板划线分离培养3 d，挑取长好的单菌落接入种子瓶，28.5℃，260 r/m摇床震荡培养30 h；

（3）发酵培养基配制灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 10%，酵母膏0.2%，磷酸氢二钾0.6%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.1%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（4）发酵培养；将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中，28.5℃，280 r/m摇床震荡培养72 h，残糖的浓度为3 g/L发酵结束，检测发酵液中普鲁兰多糖的含量为45g/L，底物转化率为45%；

（5）提取与纯化：普鲁兰多糖后处理提取与纯化包括过滤除菌、活性炭脱色、酒精脱盐、脱水、真空干燥，得到黄色的普鲁兰多糖产品，产品纯度为85%。

实施例1

（1）种子培养基配制及灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 5%，酵母膏0.2%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.1%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（2）种子制备；将甘油管保存的菌种进行平板划线分离培养3 d，挑取长好的单菌落接入种子瓶，28.5℃，260 r/m摇床震荡培养30 h；

（3）发酵培养基配制灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 10%，酵母膏0.2%，磷酸氢二钾0.6%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.1%，聚氧丙烯醚1%，吐温-20 0.05%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（4）发酵培养；将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中，28.5℃，280 r/m摇床震荡培养55 h，残糖的浓度为3.2 g/L发酵结束，检测发酵液中普鲁兰多糖的含量为71g/L，底物转化率为71%；

（5）提取与纯化：普鲁兰多糖后处理提取与纯化包括过滤除菌、活性炭脱色、酒精脱盐、脱水、真空干燥，得到白色的普鲁兰多糖产品，产品纯度为98%。

实施例2

（1）种子培养基配制及灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 6%，酵母膏0.3%，磷酸氢二钾0.6%，硫酸镁0.03%，硫酸铵0.05%，氯化钠0.05%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（2）种子制备；将甘油管保存的菌种进行平板划线分离培养3 d，挑取长好的单菌落接入种子瓶，28.5℃，260 r/m摇床震荡培养25 h；

（3）发酵培养基配制灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 12%，酵母膏0.3%，磷酸氢二钾0.6%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.1%，聚氧乙烯聚氧丙烯醚2%，吐温-80 0.1%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（4）发酵培养；将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中，28.5℃，280 r/m摇床震荡培养55 h，残糖的浓度为3 g/L发酵结束，检测发酵液中普鲁兰多糖的含量为91g/L，底物转化率为75.8%；

（5）提取与纯化：普鲁兰多糖后处理提取与纯化包括过滤除菌、活性炭脱色、酒精脱盐、脱水、真空干燥，得到白色的普鲁兰多糖产品，产品纯度为98.5%。

实施例3

（1）种子培养基配制及灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 8%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.06%，氯化钠0.05%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（2）种子制备；将甘油管保存的菌种进行平板划线分离培养3 d，挑取长好的单菌落接入种子瓶，28.5℃，260 r/m摇床震荡培养24 h；

（3）发酵培养基配制灭菌：按照以下配方配制发酵培养基

蔗糖 15%，酵母膏0.3%，磷酸氢二钾0.6%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.08%，氯化钠0.1%，聚乙烯基醚3%，吐温-80 0.1%，配制、分装完毕后，利用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min；

（4）发酵培养；将种子液按照5%的接种量接种到发酵培养基中，28.5℃，280 r/m摇床震荡培养52 h，残糖的浓度为3 g/L发酵结束，检测发酵液中普鲁兰多糖的含量为118g/L，底物转化率为78.6%；

（5）提取与纯化：普鲁兰多糖后处理提取与纯化包括过滤除菌、活性炭脱色、酒精脱盐、脱水、真空干燥，得到白色的普鲁兰多糖产品，产品纯度为98.6%。