棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子及活性分析

摘要

棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供一种获得的棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO：1的-1bp至-1284bp区为棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子的DNA序列，SEQ ID NO:1的+1bp至+30bp区为棉蚜AChE基因Ace2的5’非翻译区的DNA序列；本发明可用于真核基因的高效表达，应用于获得目的基因研究，使其获得高水平、特异性稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的表达。具体涉及一种来源于棉蚜乙酰胆碱酯酶（AChE）基因Ace2，并在细胞中高度特异表达的启动子序列。 

背景技术

棉蚜（Aphis gossypii）是一种重要的世界性农业害虫，通过取食和病毒传播来危害农作物。乙酰胆碱酯酶是氨基甲酸酯及有机磷类杀虫剂的主要靶标，Ace2棉蚜中枢神经系统中高度、特异性表达，该基因阅读框的点突变及该基因的扩增导致了其对上述两类杀虫剂的靶标不敏感。相对于棉蚜Ace1基因，Ace2的表达量极显著于Ace1。这表明出棉蚜Ace2基因启动子极可能具有较高活性。迄今为止，未有从棉蚜中分离的Ace2启动子。因此，获得棉蚜Ace2启动子对于开发出蚜虫神经特性表达系统，及应用该表达系统研究相关外源基因及作为分子标记具有重要意义。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于棉蚜AChE基因Ace2。 

本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的Ace2启动子真核表达载体，该载体指导特异性表达目的基因Ace2的启动子序列和5'非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能反映启动子活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了棉蚜Ace2的启动子区，并构建了真核表达载体，所述载体包含带有Ace2基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。 

本发明提供一种获得的棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO：1的-1bp至-1284bp区（见序列表）为棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子的DNA序列。 

获得的棉蚜特异性表达Ace2启动子序列源自棉蚜AChE基因Ace2。 

SEQ ID NO:1的+1bp至+30bp区（见序列表）为克隆得到的棉蚜AChE基因Ace2的5’非翻译区的DNA序列，本发明所述的棉蚜Ace2基因的5'非翻译区能在Sf9细胞中通过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。 

为实现另一个目的，本发明提供一种用于真核细胞组织特异性表达的表达载体，所述真核细胞表达载体包含棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子序列。 

一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包含棉蚜中枢神经特 异性表达Ace2启动子序列。 

一种用中枢神经真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含棉蚜中枢神经特异性表达Ace2启动子序列。 

关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体（pGL3），所述的棉蚜Ace2基因的启动子和5'非翻译区在表达载体中位于外源基因（Luc+）的前面。本发明提供通过插入本发明所述的棉蚜CYP6J1基因的启动子和5'非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构建的pGL3-Ace2(-1284/+94)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。 

本发明提供来自棉蚜Ace2基因的启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子和5'非翻译区使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。 

本发明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表达，应用于获得目的基因研究，使其获得高水平、特异性稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。 

附图说明

图1为棉蚜基因组电泳图 

图2为Genome walker PCR电泳图 

图3为Ace2连T载酶切鉴定电泳图 

图4为Ace21连pGL3PCR鉴定电泳图 

图5为Ace2连pGL3酶切鉴定电泳图 

图6为pGL3-Ace2(-1284/+94)转染Sf9细胞后启动子活性检测示意图 

图7为pGL3-Ace2(-1284/+94)表达载体示意图 

具体实施方式

下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。 

实施例1：棉蚜Ace2启动子的克隆 

依据棉蚜Ace2mRNA序列(Genbank No.AF502082)设计染色体步移引物GSP1(5-CGCTTCTCCGTATATTCTGGCTCTTG-3)和GSP2(5-GGCGTAATGAAAGTCCATAAGTTGAAGC-3)。提取棉棉蚜基因组DNA（图1），用平切酶AfeI、EcoRV-HF、PvuII、SmaI、PmeI、StuI进行消化，纯化DNA并连接接头引物。按照设计的特异性引物进行PCR扩增，并按照Genome walker（Clontech）PCR方法进行扩增。扩增得到目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1378bp的条带（图2），并进行回收。回收片段与pGEM-T载体连接得到重组质粒，提取质粒并进行酶切验证（图3），并测序。 

棉蚜Ace2启动子（启动子序列SEQ ID NO:1的转录起始位点的-1bp至-1284bp区的DNA核苷酸序列），在棉蚜Ace2基因的5'区序列中得到鉴定。 

在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基用+1示出，ATG用红色标注。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。 

启动子分析网站http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html 

实施例2：棉蚜Ace2启动子表达载体pGL3-Ace2(-1284/+94)的构建 

将在实施例1中所克隆的棉蚜Ace2启动子和5'非翻译区（见序列表）插入到pGL3载体中，从而构建pGL3-Ace2(-1284/+94)载体。 

更具体地说，利用引物（5-GGTACCCTGTACTTGTTTTGATCGA-3，5-CTCGAGGGCGTAATGAAAGTCCATA-3）扩增并将该启动子序列克隆到pGL3载体KpnI和XhoI位点上，构建成pGL3-Ace2(-1284/+94)，用于驱动Luc+的表达，经PCR鉴定（图4）和酶切鉴定（图5）获得启动子与载体的重组质粒。 

实施例3：鉴定本发明所述的棉蚜Ace2启动子的活性 

Sf9细胞接种于24孔板中（4×10⁵cells/孔）,用CellfectinII试剂（Invitrogen；2μL/每孔）瞬时共转染pGL3-Ace2(-1284/+94)建体（2μg/孔）和对照报告基因质粒phRL-TK（Promega;0.2μg/孔），。48小时后，收获细胞，将所得裂解物用于测量萤光素酶活性（Promega）。如图6所示，pGL3-Ace2(-1284/+94)所转染Sf9细胞（草地贪夜蛾卵巢细胞）具有无荧光素酶活性，这说明其具有高度中枢神经特异表达性质。 

实用性 

如上所述，本发明提供棉蚜Ace2基因启动子和5'非翻译区。 

本发明提供分别将棉蚜Ace2基因启动子和5'非翻译区插入至pGL3而获得的真核细胞表达载体。 

经使用所述的真核细胞表达载体进行鉴定，本发明所述的棉蚜Ace2基因启动子和5'非翻译区能够启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高真核基因的特异表达。 

SEQ ID NO.1的序列（带功能元件标记） 

（i）序列特征：（A）长度：-1bp至-1284bp；+1bp至+94bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。 

（ii）分子类型：核苷酸 

（iii）序列描述：SEQ ID NO.1