一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法

摘要

本发明涉及一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法。依次包括以下步骤：1)目标核酸分子与纳米金上的DNA发生杂交；2)目标核酸分子引发四条发卡DNA发生自组装反应，并生成较大的DNA聚合体；3）在反应溶液中加入二价阳离子或一价阳离子的盐，结合有目标核酸分子的纳米金发生不同程度的聚集，纳米金颜色从红色到蓝色发生变化。本发明体系简单，四条发卡DNA设计简单；可实现对目标物的可视化检测；具有较好的温度适应性，反应速度快，灵敏度高，特异性好，反应时间短，检测限能达到8.45pM，可应用于临床检测、食品安全检测和环境监测等领域。

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的新方法。 

背景技术：

核酸检测已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染疾病的预防与控制等许多方面。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）以其灵敏度高成为目前使用最广泛的DNA扩增方法。然而常规PCR技术存在如下缺陷：（1）需要反复的热变性以解开DNA双链,在应用上依赖于高质量的热循环仪；（2）常引起非特异性扩增；（3）扩增反应时间长，一般需要几个小时，难以在基层推广应用。自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术。 

链置换扩增反应技术（Stand Displacement Amplification，SDA）由美国Becton Dickinson研究中心的Walker等于1992年首次报道，其原理是基于在靶DNA两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将双链DNA切出缺口，DNA聚合酶从缺口3’端延伸并置换下一条DNA链。被置换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。但是链置换扩增技术对于引物和靶序列结合形成5’端有特殊要求；SDA在等温扩增之前需要一个加热变性打开双链的步骤，由于聚合酶Klenow Fragment（3’-5’exo^-）无热稳定性，必须在靶DNA变性后才能加入到体系中，容易引起污染。 

依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification,HDA），是由美国New England Biolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温基因扩增技术。HDA法的原理是先用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白（SSB）与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性；引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增。新生成的dsDNA产物作为底物进入下一轮扩增。虽然HDA克服了PCR反应的反复变温过程，但是HDA反应系统反应成分复杂，HDA的反应体系由A和B两个部分组成，A部分含模板、引物、ddH₂0、缓冲液；B部分由大肠杆菌UurD解旋酶、SSB（T4基因32蛋白或RB49基因32蛋白）、dNTP、MutL、DNA聚合酶和缓冲液组成，造成反应成本高。 

环介导的恒温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP）是2000年由Notomi等建立的一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，该技术是用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现DNA的快速等温扩增。该方法虽说扩增效率高，特异性强，但是该方法对引物设计的要求特别高，扩增产 物不能用于克隆测序，只能用于判断。 

滚环扩增技术（Rolling Cycle Amplification，RCA）是在恒定温度下以单链环状DNA为模板，在有强链置换活性的Phi29DNA聚合酶作用下，通过引物与模板环退火而进行的滚环式DNA合成。RCA极高的扩增效率使其可成为信号放大的手段。但是在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。 

虽然荧光定量PCR技术，SDA，HDA,LAMP,RCA等技术可以将信号迅速地放大，但是他们也存在着一些不足；并且在实验中操作复杂且需要酶的参与，所以他们对反应条件，如：反应缓冲液、反应温度等有较严格的要求，稍微改变反应条件可能会对实验结果造成较大影响。因此，为了弥补这些技术的不足，同时降低这种过于依赖反应条件的放大技术，在此，引进了一种无需酶参与，仅仅利用自由能驱动就可以进行的DNA杂交链式反应。 

DNA杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）是2004年由Dirks和Pierce提出的一种新的无需酶的参与并能将DNA信号转换和放大的方法。该方法的的原理是在碱基对形成的自由能的驱使下，通过目标链的引发，小的单链DNA可以自组装聚合成为较长的DNA结构,实现对目标的信号放大。 

结合HCR反应和纳米金的比色检测，2006年Pierce在美国专利（US20060234261A1）中提出了一种结合HCR反应和纳米金比色实现对目标物的检测的方法。由于纳米金带负电荷，HCR产物也带负电荷，负电荷之间的相互排斥，增加了纳米金与HCR产物相结合的难度，实际上该反应难于进行。在该专利中Pierce还提出了一种指数HCR反应方法，但在设计时四条发卡DNA中有两条发卡DNA含有两个环状结构，增加了DNA茎环结构的长度和DNA的合成成本，并且由于负电荷之间的相互排斥，如果将其应用于纳米金比色检测中，实际效果会更差。 

近些年来，纳米材料的快速发展和应用为改善生物传感器的性能和拓宽应用领域创造了有利条件，也不断催生新型纳米生物传感器的发展，其中，纳米金颗粒由于具有良好的光电性能以及生物兼容性，在生物分析领域得到了广泛应用。利用DNA修饰的纳米金体系对DNA、金属离子、蛋白质、生物小分子等的检测是近十几年来发展起来的一种简便、快速的传感方法。2013年Liu等利用纳米金比色性质结合HCR反应，实现了对目标DNA的无酶比色检测，但该方法是线性扩增过程，反应时间长（1小时），灵敏度不高。 

基于现有检测技术的缺点和不足，本发明提出了一种新型的指数发卡组装反应（Exponential Hairpin Assembly，EHA）。该反应只需要一条引发链和四条发卡DNA，四条发卡DNA具有类似的结构，设计简单。在一条引发链的引发下四条发卡DNA发生指数组装，在较短的时间内形成一个较大的DNA聚合体，实现信号的指数放大，该聚合体同时能够作为一种高效的DNA载体与纳米金相结合，实现对目标核酸分子的比色检测，该方法既克服了有 酶反应的种种缺点，又大大缩短了反应时间，提高了检测灵敏度，简化了检测过程，大大降低了检测成本，可广泛应用于临床检测，食品安全检测和环境监测等。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法。本发明利用目标核酸分子能与四条发卡DNA之间发生指数反应，并结合纳米金的比色性质，建立了一种新的快速灵敏的可视化核酸检测新方法。 

为了实现上述发明目的，一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的新方法，按照如下步骤操作： 

1）在10-40℃等温条件下，将目标核酸分子与修饰了DNA的纳米金通过碱基互补配对使目标核酸分子的一端固定在纳米金上； 

2）固定在纳米金上的目标核酸分子引发四条发卡DNA发生自组装反应：向该体系中加入四条发卡DNA，发卡DNA的浓度在1-1000nM之间，在10-40℃等温条件下，目标核酸分子的另一端作为引发链与第一条发卡DNA的落脚点序列杂交，并在自由能的驱动下，打开第一条发卡DNA，暴露出能与第二条和第三条发卡DNA相结合的序列；该序列分别与第二条和第三条发卡DNA的落脚点序列杂交，打开第二条和第三条发卡DNA；在相似的作用原理下，打开的第二条和第三条发卡DNA又分别能打开第一条和第四条发卡DNA，被打开的第一条发卡DNA又能与第二条和第三条发卡DNA同时结合，被打开的第四条发卡DNA也能与第三条和第二条发卡DNA同时结合，并继续循环反应，实现反应的指数放大,生成大的DNA聚合体，反应时间为1-30min； 

3）向该体系中加入二价阳离子或一价阳离子的盐，使纳米金产生聚沉。其中二价盐以MgCl₂为例，一价盐以NaCl为例，加入盐的量与目标核酸分子的浓度有关。加盐之后纳米金发生聚集，纳米金颜色从红色到蓝色发生变化，变化程度与目标核酸分子的物质的量成反比，第一步中所加入的目标核酸分子越多，颜色变化越小，即目标核酸分子越多溶液越红，目标核酸分子越少溶液越蓝，实现了肉眼可视化检测，同时利用紫外可见吸收装置对其进行紫外吸收检测。 

其中，本发明所述的“发卡DNA”指的是具有茎环结构的核酸，其包含自身互补形成的双链结构的茎和单链结构的环状部分，其5’或3’端也包含单链部分；所述的目标核酸分子指实验中用于检测的RNA或单链DNA。 

本发明所述发卡自组装反应为指数反应； 

本发明所述四条发卡DNA均只含有一个环状结构； 

所述指数发卡组装反应，当没有目标链时，反应物和副反应生成的产物都不能连接到纳 米金上。 

本发明反应溶液颜色变化是通过纳米金的聚沉实现的，在相同的盐（如14mM的MgCl₂，150mM NaCl）浓度下，随着目标核酸分子的浓度逐渐减低，纳米金颜色的变化为从红色到蓝色。 

本发明的检测对象包括DNA，RNA，蛋白质，金属离子，生物小分子以及一切能通过物理、化学或生物过程产生目标核酸分子的物质。 

本发明的具体机理为：纳米金颗粒或DNA修饰过的纳米金表面都带负电荷，所以纳米金之间相互排斥，彼此独立分散在溶液中，溶液呈现红色。当向溶液中加入带正电荷的盐离子（如MgCl₂中的Mg²⁺），正电荷会中和纳米金表面所带的负电荷，造成纳米金之间排斥力减弱甚至消失，导致纳米金的聚集，此时溶液就变成蓝色。 

另外，由于DNA也是带负电荷的，因此纳米金表面DNA越多，纳米金表面的负电荷就越多。当样品中没有目标DNA时，纳米金表面就不会发生指数发卡组装反应，纳米金表面的负电荷就不会增多，当向溶液中加入带正电荷的盐离子（如MgCl₂中的Mg²⁺）时，引起纳米金的聚集，溶液变蓝；当样品中有目标DNA时，目标DNA杂交到纳米金上，并引发指数发卡组装反应，在较短的时间内（实施例中为5min）使纳米金表面的DNA量增加，同时纳米金表面的负电荷也增加，负电荷的多少与目标DNA成正比，当向溶液中加入带正电荷的盐离子（如MgCl₂中的Mg²⁺）时，此时纳米金的聚集程度与目标DNA的量成反比。 

本发明整个体系简单，只需要四条发卡DNA，一条目标链以及修饰了DNA的纳米金，无需酶的参与，四条发卡DNA设计简单；可实现对目标物的可视化检测，大大降低了对大型仪器的需求；本发明在恒温条件下进行，同时具有较好的温度适应性；反应速度快，灵敏度高，特异性好，反应时间短，检测限能达到8.45pM，可应用于临床检测、食品安全检测和环境监测等领域。 

附图说明：

图1是指数发卡组装原理图； 

图2是指数发卡组装比色检测核酸方法原理图； 

图3是指数发卡组装电泳图； 

图4是线性发卡混合反应电泳图； 

图5是浓度梯度比色图； 

图6是浓度梯度紫外吸收图； 

图7是浓度梯度线性图； 

图8是特异性检测比色图。 

具体实施方式：

下面结合具体实施例和附图对本发明方法做进一步阐述。 

实施例1：验证方法的可行性及其原理的正确性 

本实施例利用目标链和四条发卡DNA之间的指数组装反应能在较短时间内形成大的DNA聚合体，其生成产物的速度和分子量远远要高于线性组装反应，对比电泳结果验证方法的可行性及其原理的正确性。 

指数发卡组装实验原理如图1所示，目标核酸分子与第一条发卡DNA的落脚点序列杂交，并在自由能的驱动下，打开第一条发卡DNA，暴露出能与第二条和第三条发卡DNA相结合的序列；该序列分别与第二条和第三条发卡DNA的落脚点序列杂交，打开第二条和第三条发卡DNA；在相似的作用原理下，打开的第二条和第三条发卡链又分别能打开第一条和第四条发卡DNA，被打开的第一条发卡链又能与第二条和第三条发卡DNA同时结合，被打开的第四条发卡DNA也能与第三条和第二条发卡DNA同时结合，并继续循环反应，实现反应的指数放大，形成一个大的DNA聚合体。 

反应条件：将发卡DNA，H1（序列为： 

5’-CTGTGAGTGAACTGCGAGACAACCGAAACCGTTAGAGCCAACCAGAACGTTGGCTCTAACGGTTTCGGTTGTGGATTG-3’，即SEQ ID NO.1），H2（序列为： 

5’-GTTCTGGTTGGCTCTAACGGTTTCCAATCCACAACCGAAACCGTTAGAGCCAAC-3’，即SEQ ID NO.2），H3（序列为：5’-GGTTGTCTCGCAGTTCACTCACAGAGGAGTCAGAACCTGTGAGTGAACTGCGAG-3’即SEQ ID NO.3），H4（序列为： 

5’-GAAACCGTTAGAGCCAACCAGAACCTGTGAGTGAACTGCGAGACAACCCTCGCAGTTCACTCACAGGTTCTGACTCCT-3’，即SEQ ID NO.4），在10mM磷酸盐缓冲液,0.3M NaCl,pH7.4的溶液中95℃变性3分钟，缓慢冷却至室温；将终浓度为0.5μM的发卡DNA H1、H2、H3和H4各2μL混合，向该体系分别加入终浓度为0、1μM、0.1μM、0.01μM目标DNA T（序列为： 

5’-CACAGACCAGAGCAATCCACAACCGAAACCGTTAGAGCCAAC-3’，即SEQ ID NO.5）2μL，阴性用缓冲溶液补平，使总体积为10μL，室温反应15min，取反应溶液3μL于2％的琼脂糖凝胶电泳，电压110V，电泳25min。 

将终浓度为0.5μM的发卡DNA H1、H2、H3和H4任意三条链各2μL混合，分成H1、H2、H3，H1、H2、H4，H1、H3、H4，H2、H3、H4，四种组合。向每种组合中分别加入终浓度为0、1μM、0.1μM目标DNA链T（SEQ ID NO.5）2μL，阴性用缓冲溶液补平，使总体积为10μL，室温反应15min，取反应溶液3μL于2％的琼脂糖凝胶电泳，电压110V，电泳25min。 

实施例1的结果示于图3、图4中。图3中泳道M代表2000bp DNA Marker；泳道1为0.5μM H1、0.5μM H2、0.5μM H3和0.5μM H4；泳道2，3，4为在泳道1中分别加入1μM,0.1μM，0.01μM T。 

图4中泳道M代表2000bp DNA Marker；泳道1为0.5μM H1、0.5μM H2、0.5μM H3，泳道2,3为在泳道1中分别加入1μM,0.1μM T；泳道4为0.5μM H1、0.5μM H2、0.5μM H4，泳道5,6为在泳道4中分别加入1μM,0.1μM T；泳道7为0.5μM H1、0.5μM H3、0.5μM H4，泳道8,9为在泳道7中分别加入1μM,0.1μM T；泳道10为0.5μM H2、0.5μM H3、0.5μM H4，泳道11,12为在泳道10中分别加入1μM,0.1μM T； 

图3中的电泳结果表明，当没有目标链，只有四条发卡DNA时，不发生指数发卡组装反应；当有目标链存在时，指数发卡组装反应能发生，并且随着目标链的浓度越小，生成的DNA的分子量越大，图4中的电泳结果表明，当三条发卡DNA与目标DNA T混合时能发生线性反应，并且反应的顺序为目标DNA T先打开H1，而后引发后续的反应。对比两个电泳图表明在相同的条件下，指数发卡组装的反应速率和生成的产物大小远远高于线性组装反应。电泳图表明了方法原理的正确性和可行性。 

实施例2：利用指数发卡组装比色快速检测目标DNA 

本实施例检测了不同浓度的目标DNA，用来验证本发明所陈述的核酸检测方法的灵敏度。 

指数发卡组装比色快速检测目标DNA实验原理如图2所示，将EHA反应能实现DNA的指数信号放大的优点和纳米金比色性质相结合实现对目标DNA的快速、灵敏的检测。当目标核酸分子存在时，目标核酸分子的一端能与修饰在纳米金上的巯基DNA碱基互补配对，目标核酸分子的另一端作为引发链引发EHA反应，在较短的时间内实现DNA的快速增长，使纳米金表面带更多负电荷，纳米金之间的排斥力增大，加入14mM MgCl₂溶液时不会发生纳米金的聚沉。当目标链不存在时，反应物和副反应产物都无法与纳米金相结合，纳米金表面负电荷没有增加，在相同的MgCl₂溶液浓度下纳米金发生聚沉，颜色变化。在此的盐浓度下，随着目标核酸分子的浓度降低，纳米金的颜色由红色向蓝色逐渐过渡，实现对目标物的可视化检测，同时根据不同颜色纳米金溶液的紫外吸收不同的特点，实现对目标物的仪器检测。 

1、操作步骤如下： 

1）在室温条件下，在10mM磷酸盐缓冲液,0.3M NaCl,pH7.4的溶液中，将目标核酸分子与修饰了DNA的纳米金混合，目标核酸分子通过碱基互补配对与纳米金上的DNA进行特异性杂交，使目标核酸分子的一端固定在纳米金上； 

2）固定在纳米金上的目标核酸分子引发四条发卡DNA发生自组装反应：向该体系中加入四条发卡DNA,在室温条件下，目标核酸分子的另一端作为引发链与第一条发卡DNA的落脚点 序列杂交，并在自由能的驱动下，打开第一条发卡DNA，暴露出能与第二条和第三条发卡DNA相结合的序列；该序列分别与第二条和第三条发卡DNA的落脚点序列杂交，打开第二条和第三条发卡DNA；在相似的作用原理下，打开的第二条和第三条发卡DNA又分别能打开第一条和第四条发卡DNA，被打开的第一条发卡DNA又能与第二条和第三条发卡DNA同时结合，被打开的第四条发卡DNA也能与第三条和第二条发卡DNA同时结合，并继续循环反应，实现反应的指数放大,生成大的DNA聚合体，反应时间为5min。 

3）向该体系中加入一价阳离子或二价阳离子盐，其中二价盐以MgCl₂为例，加入量为14mM，加入150mM的NaCl也会让纳米金产生类似的聚沉结果。加盐之后纳米金发生聚集，随着目标核酸分子从多到少，纳米金颜色发生从红色到蓝色的颜色变化。 

2、反应条件： 

取75μL巯基DNA（序列为：5’-CTCTGGTCTGTG-SH-3’，即SEQ ID NO.6）修饰的纳米金，向该体系分别加入5μL终浓度为10×10-9M、5×10^-9M、2.5×10^-9M、1×10^-9M、5×10^-10M、2.5×10^-10M、1×10^-10M、5×10^-11M、2.5×10^-11M、1×10^-11M、5×10^-12M及0M的目标DNA T（SEQ ID NO.5），之后分别加入终浓度为0.2μM H1（SEQ ID NO.1），0.2μM H2（SEQ ID NO.2），0.2μM H3（SEQ ID NO.3），0.2μM H4（SEQ ID NO.4）各5μL，阴性用缓冲溶液补平，使反应总体积为100μL，反应缓冲体系为10mM磷酸盐缓冲溶液,0.3M NaCl,pH7.4的溶液中,反应5min；向反应体系中加入7.5μL0.2M MgCl₂溶液，MgCl₂终浓度为14mM，混合均匀，摆好拍照。将反应溶液置于岛津UV-2600紫外可见光谱仪上进行紫外吸收检测，吸收波长为400-775nm。根据紫外吸收图计算出在波长为524nm和650nm处的吸光度的比值，绘制线性图。 

3、实施例2的结果示于图5、图6、图7中。图5中每个样品都含有0.2μM H1，0.2μM H2，0.2μM H3，0.2μM H4，从左到右目标DNA T的浓度依次是10×10^-9M、5×10^-9M、2.5×10^-9M、1×10^-9M、5×10^-10M、2.5×10^-10M、1×10^-10M、5×10^-11M、2.5×10^-11M、1×10^-11M、5×10^-12M及0M。图6为紫外吸收图，箭头方向表示浓度依次升高。图7为不同浓度下波长为524nm和650nm处的吸光度的比值（A524/A650）。 

图5中比色图表明，随着目标DNA的浓度逐渐降低，纳米金颜色逐渐由红色变成蓝色，当引发链浓度低于10pM时，阳性和阴性颜色没有明显的区分，因此肉眼观测的检测限为10pM。图6中的紫外吸收图表明，随着目标DNA的浓度逐渐降低，在波长为524nm处的吸光度逐渐降低，在650nm处的吸光度逐渐升高。图7中在不同浓度下，波长为524nm和650nm处的吸光度的比值（A524/A650）所做的线性图表明，比色检测在0-1nM之间成线性关系，检测限为8.45pM。通过比色图，紫外吸收图和线性图表明指数发卡组装比色检测核酸具有 简单、可视化、快速、灵敏、检测限低的优点，在5min之内就能检测到8.45pM的目标DNA。 

实施例3：利用指数发卡组装比色检测DNA的方法实现对目标DNA的特异性检测。 

本实施例检测了在目标DNA中分别错配一个碱基（mismatched target： 

CACAGACCAGAGCAATCCACAACCTAAACCGTTAGAGCCAAC，即SEQ ID NO.7），删除一个碱基（deleted target：CACAGACCAGAGCAATCCACAACCAAACC GTTAGAGCCAAC，即SEQ ID NO.8），增加一个碱基（inserted target：CACAGACCAGAGCAATCCACAACCAGAAACCGTTAGAGCCAAC，即SEQ ID NO.9），用来考察本发明的方法在检测核酸时区分碱基差异的能力。 

反应条件： 

取75μL巯基DNA（SEQ ID NO.6）修饰纳米金，分别向该体系加入5μL终浓度为5×10^-10M的目标DNA T（SEQ ID NO.5），5×10^-10M mismatched target（SEQ ID NO.7），5×10^-10M deleted target（SEQ ID NO.8），5×10^-10M inserted target（SEQ ID NO.9），之后分别加入终浓度为0.2μM H1（SEQ ID NO.1），0.2μM H2（SEQ ID NO.2），0.2μM H3（SEQ ID NO.3），0.2μM H4（SEQ ID NO.4）各5μL，使反应总体积为100μL，反应缓冲体系为10mM磷酸盐缓冲溶液,0.3M NaCl,pH7.4的溶液中,反应5min。向反应体系中分别加入7.5μL0.2M MgCl₂溶液，MgCl₂终浓度为14mM，混合均匀，摆好拍照。 

实施例3的检测结果示于图8中。图8中样品从左到右分别对应着matched target，mismatched target，deleted target，inserted target的反应体系。图8结果表明，目标DNA发生错配碱基，删除碱基，增加碱基都使引发指数发卡组装反应的难度增加，在相同的时间内不能形成较大的DNA聚合体，使纳米金在相同的盐浓度下发生聚沉，纳米金颜色变蓝，而完全互补的碱基则能顺利的引发指数发卡组装，生成较大的DNA聚合体，在此盐浓度下不发生聚沉，纳米金颜色不发生变化。说明本专利所提供的方法具有较好的检测特异性。 

序列表

SEQ ID NO.1 (5’-3’)

H1：

ctgtgagtga actgcgagac aaccgaaacc gttagagcca accagaacgt tggctctaac 60

ggtttcggtt gtggattg                                               78

 

SEQ ID NO.2 (5’-3’)

H2：

gttctggttg gctctaacgg tttccaatcc acaaccgaaa ccgttagagc caac       54

 

SEQ ID NO.3 (5’-3’)

H3：

Ggttgtctcg cagttcactc acagaggagt cagaacctgt gagtgaactg cgag       54

 

SEQ ID NO.4 (5’-3’)

H4：

gaaaccgtta gagccaacca gaacctgtga gtgaactgcg agacaaccct cgcagttcac  60

tcacaggttc tgactcct                                                78

 

SEQ ID NO.5  (5’-3’)

target： cacagaccag agcaatccac aaccgaaacc gttagagcca ac            42

 

SEQ ID NO.6  (5’-3’)

Thiol-DNA    ctctggtctg tg-SH                                      12

 

SEQ ID NO.7 (5’-3’)

mismatched target：

cacagaccag agcaatccac aacctaaacc gttagagcca ac                     42

 

SEQ ID NO.8 (5’-3’)

deleted target：

cacagaccag agcaatccac aacc  aaacc gttagagcca ac                    41

 

SEQ ID NO.9 (5’-3’)

inserted target：

cacagaccag agcaatccac aaccagaaacc gttagagcca ac                    43