一种中药组合物在制备抑制类风湿性关节炎血管生成的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种中药组合物在制备抑制类风湿性关节炎血管生成的药物中的应用。它是由黄芪、女贞子等中药组合而成。该中药组合物具有益气养阴、健脾补肾、散结通络的功效，正切病机，实验证实本发明中药组合物可有效抑制血管生成，临床可用于类风湿性关节炎。本发明配伍合理，药物不良反应小，可供病人长期使用。

说明书

本本发明专利申请为分案申请，原案信息如下：

申请号：201210166200.5

申请日：2012年5月26日

发明名称：一种中药组合物在制备抑制血管生成的药物中的应用。

技术领域

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备抑制血管新生的药物中的应用，属中药应用领域。

背景技术

血管生成(即新生血管形成)包括血管发生和血管新生；血管发生指由已存在血管通过出芽的方式形成新的血管，血管新生是指通过成血管细胞/内皮祖细胞募集到新生血管形成位点并分化为内皮细胞。正常情况下血管新生过程在促进血管生成和抑制血管生成的各种因子的精密调节下达到平衡状态。血管生成在人体发育、组织修复、女性月经周期等正常生理过程中发挥重要作用。同时，多种疾病的发展也与血管血管新生密切相关。

与正常血管相比，肿瘤血管的结构缺乏完整性，内皮细胞之间存在较大缝隙，通透性强，血管网状结构紊乱，有大量的血管盲端和动静脉短路，这种结构的异常导致渗出增加及组织间高压，同时也易于癌细胞发生转移。肿瘤的生长有两个不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1~2 mm³。抑制血管生成是抗肿瘤治疗的新策略。一般情况下除了在月经期、炎症或外伤时，成人的血管内皮细胞均处于静止状态。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是重要的血管生成因子，对内皮细胞具有高度特异性，以它们为靶目标的治疗药物被证明具有极少副作用。细胞表面受体和细胞外因素可以调控血管生成的过程，这提示药物可以不被细胞吸收而发挥干扰血管生成的作用。

除过无限制的生长，肿瘤细胞的特征包括粘附、迁移、侵袭，这也是肿瘤细胞离开原发灶，通过血运和体腔向身体局部或远端器官播散的原因。血管新生对肿瘤细胞的远端播散也很重要。肿瘤细胞的功能与肿瘤细胞的转移能力密切相关。黏着斑激酶(FAK) 在细胞的黏附和迁移中起着至关重要的作用，黏着斑激酶(FAK)抑制剂可以有效阻止肿瘤细胞的转移。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年来发现，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(Akt)所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，目前以PI3K-Akt信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中。渥曼青霉素(Wortmannin)就是其中最典型的代表，目前已经进入临床研究阶段。渥曼青霉素结构式如下：

 CAS登录号：19545-26-7。

肿瘤细胞的迁移和黏附在肿瘤侵袭转移中起着重要的作用。PI3K能传递整合素所介导的侵袭信号，尤其对整合素α₂β₁、α₆β₄和α_Vβ₃的侵袭行为是必要的，如PI3K介导前列腺癌中整合素α_Vβ₃驱动的侵袭特性，在乳腺癌和卵巢癌中，Akt2的过表达能通过IV型胶原蛋白上调整合素β₁从而增加细胞的侵袭和转移。

目前类风湿关节炎的病因不明，类风湿关节炎主要表现为进行性的关节破坏，最后造成功能障碍，形态学上主要表现为滑膜增殖形成滑膜组织向关节腔内绒毛状突起，增生的滑膜组织产生多种因子，具有破坏软骨的作用，增生的滑膜组织含有大量的血管成分。资料表明，血管新生在该病的进展中起着重要的作用。对于类风湿性关节炎患者，血管生成是一个由促血管生成和抑血管生成介质调控的复杂过程。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种危及视力的糖尿病慢性血管并发症，不论是胰岛素依赖型还是非胰岛素依赖型患者，DR最终影响几乎所有糖尿病患者。DR的特点表现为逐步加重的视网膜微血管病变，具体病理表现有微循环障碍、视网膜微血管瘤形成、血-视网膜屏障破坏、毛细血管闭塞、视网膜无灌注区以及新生血管形成等，还可能引发玻璃体出血和视网膜脱离，最终导致视功能不可逆性损害。眼底视乳头部或其他部位出现新生血管，多伴有结缔组织增生,使视功能遭到严重破坏而致失明者也不少见，故抑制新生血管出现是治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的重要环节。

动脉粥样硬化(AS)斑块的不稳定可导致斑块破裂，进而发生急性冠脉综合症(ACS)。近年来研究发现，斑块内血管新生可促进粥样硬化病变的发展，增加斑块的不稳定性，因此抑制斑块内血管新生对稳定易损斑块可能起着关键性作用。治疗性血管新生可以促进局部血管新生，提高心肌代偿能力，最终达到治疗缺血性心脏病的目的。

发明内容

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备抑制血管生成药物中的应用。

本发明所述中药均可按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》进行炮制。本发明药物是由如下重量份比例的原料药制成的:

黄芪120-360、 女贞子100-300、人参30-95、灵芝30-95、莪术65-195、白术30-90、半枝莲65-195、绞股蓝120-360、茯苓30-95、鸡内金15-45、蛇莓65-195、白英65-195、茵陈65-195、徐长卿65-195、土鳖虫10-30、白花蛇舌草65-195。

优选的，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:

黄芪120、女贞子300、人参30、灵芝95、莪术65、白术90、半枝莲65、绞股蓝360、茯苓30、鸡内金45、蛇莓65、白英195、茵陈65、徐长卿195、土鳖虫10、白花蛇舌草195。

或

黄芪360、女贞子100、人参95、灵芝30、莪术195 、白术30、半枝莲195、绞股蓝120、茯苓95、鸡内金15、蛇莓195、白英65、茵陈195、徐长卿65、土鳖虫30、白花蛇舌草65。

或

黄芪250、女贞子200 、人参65、灵芝65、莪术132、白术64、半枝莲128、绞股蓝256、茯苓65、鸡内金30、蛇莓128、白英128、茵陈128、徐长卿128、土鳖虫20、白花蛇舌草128。 

优选的，所述中药组合物所用原料药中，白术为炒白术。

本发明还提供了所述中药组合物的活性成分由以下步骤制成:

 (1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

 (2)、女贞子、人参加6-10倍量50-90%乙醇提取1-3次，每次1-4小时，合并提取液，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，滤液及药渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿加4-8倍量水提取挥发油，收集挥发油，另器收集，残渣及水溶液备用; 

(4)、土鳖虫、鸡内金、茯苓粉碎成细粉；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后残渣合并，加7-10倍量水，加热煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子滤液和步骤（3）中的水溶液，浓缩至药液在65℃测时相对密度为1.15-1.30，干燥，粉碎，备用;

步骤（4）所得粉碎粉、步骤（3）所得挥发油与步骤（5）所得的干膏粉共同构成该中药组合物的活性成分。

本发明药物的剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、软胶囊、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

其中胶囊剂的制备方法，是由以下步骤制成：

 (1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

 (2)、人参、女贞子，加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，滤液和人参、女贞子残渣备用;

 (3)、莪术、白术、徐长卿，合并提取挥发油，提油时间不少于8小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用;

 (4)、土鳖虫、鸡内金两味动物药，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，灭菌后备用;

 (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后残渣合并，加9倍量水，加热煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液和步骤（3）中的水溶液，浓缩成相对密度1.20-1.25的清膏，干燥，粉碎，得干膏粉；将所得干膏粉加入适当药学上可接受的辅料制粒；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的颗粒混匀，密闭半小时，装胶囊即得。

本发明药物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

实验证实，本发明药物组合物在体外对血管生成和血管内皮细胞与迁移具有直接抑制作用，对于血管新生具有直接抑制作用，并且对微血管、细胞基质粘附和细胞迁移有显著的抑制作用。同时，能够显著的抑制FAK磷酸化，协同FAK抑制剂具有抑制血管生成作用。

实验证实，本发明药物组合物可协同FAK抑制剂防止肿瘤转移，还可以协同PI3K抑制剂和AKT(丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂防止肿瘤转移。

实验还证实，该中药组合物可以直接抑制肿瘤细胞，并且可以防止癌症的转移，特别是对骨肉瘤、肺癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌或者胃癌有较好的防止转移的作用。

该中药组合物可有效抑制类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变及动脉斑块的血管生成，并有效治疗类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变以及预防动脉斑块增大和脱落。 

本发明配伍合理，简单易行，为纯中药制剂，不良反应小，可供病人长期使用。

附图说明

图1 DME25对体外HECV细胞微血管小管生成的作用。HECV细胞位于基底膜夹层之间，以HECV作为对照组（A），FAK抑制剂干预组（25nM）（B），DME25干预组（1:2000）（C），FAK抑制剂和DME25联合干预组（D）。置显微镜观察小管图像（A-D），用数字图像分析技术量化长度（E）。DME25能够显著抑制小管形成并且和FAK抑制剂之间存在协同作用。

图2 DME25对体外内皮细胞生长的作用效果欠佳。用不同稀释浓度的DME25处理细胞72h。用结晶紫进行细胞计数。对HECV细胞生长没有明显作用。

图3 A：DME25剂量依赖性抑制HECV细胞基质粘附，DME25被稀释从1:40到 1:125,000 (A)。稀释低于1:25,000显示抑制作用。B：粘附的三维成像。左侧：空白对照。右侧： 1:1,000稀释的 DME25处理的细胞。X轴：频数。Y轴：阻抗力。Z轴：时间。C和D：常规方法研究细胞基质粘附。C：龙胆紫染色粘附细胞成像。D：每高倍视野下粘附细胞数目。与空白对照组比较，* p<0.01；与单独DME和单独FAK抑制剂比较，^# p<0.01。

图4 DME25和细胞黏附之间浓度依赖关系（A）与FAK途径的依赖性（B）。所示数据来源于Rb模型。

图5.DME25抑制作用及FAK的作用。DME25能够显著减少黏附，其作用在与FAK抑制剂联用时被增强，图中所示迁移路径（A）和三维模型（B）。i：对照组；ii:FAK抑制剂干预细胞（25nM）;iii：DME25干预细胞（1:1000）；ⅳ：ii和iii联合干预。X轴：频率；Y轴：阻抗力；Z轴：时间。

图6 DME25对细胞迁移的抑制作用及FAK的作用。DME25能显著减少细胞迁移，其作用在与FAK抑制剂联用时被增强，图中所示迁移路径（A）和三维模型（B）。i：对照组；ii:FAK抑制剂干预细胞（25nM）;iii：DME25干预细胞（1:1000）；ⅳ：ii和iii联合干预。X轴：频率；Y轴：阻抗力；Z轴：时间。A图中的箭头提示电损伤诱导的时间点。

图7 DME25抑制HECV内皮细胞FAK和Paxillin的磷酸化。血清饥饿2h后，DME25（2种不同浓度，1:1000和1:5000）、FAK抑制剂（25nM）或者二者的联合干预HECV细胞60min。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离等量蛋白后，用FAK和桩蛋白磷酸化特异性抗体对磷酸化FAK和Paxillin进行探针检测。

图8 HECV细胞中粘附斑激酶（FAK）和pFAK免疫荧光染色。20,000 HECV细胞分别加到空白培养基、DME25 (1:1,000)、 FAK抑制剂以及二者联用中。2小时后细胞被冲洗和固定，分别用抗FAK和抗pFAK抗体处理后，总FAK（左侧）和FAK磷酸化（右侧）被深染。通过100ms照射后FAK成像获得，400ms照射后pFAK成像获得。

图9 DME25对MCF-7 (上), MG-63  (中) 和 A549 cells (下)基质粘附得影响。浓度高于1:125,000均有抑制作用。

图10宽频检测DME25抑制细胞粘附。3D模式图证实提取物对细胞粘附的作用，X轴为频率；Y轴为电阻；Z轴为时间。

图11 A549细胞Rb模式数据。

图12 DME25抑制A549细胞迁移。

图13 PI3K/AKT通路在DME25诱导DU-145细胞粘附中的作用。A: 加入Wortmannin对细胞粘附的影响。B：AKT抑制和DME25对细胞粘附的作用。

图14 DME25对 A549细胞AKT (Ser 473) 磷酸化的影响。A: West-blot检测AKT (Ser 473) 磷酸化；B: ImageJ. Bar图像分析pAKT/GAPDH条带比率。

具体实施方式

实施例1：

原料药配方为：

黄芪250g、女贞子200g、人参65g、灵芝65g、莪术132g 、炒白术64g、半枝莲128g、绞股蓝256g、茯苓65g、 鸡内金30g、蛇莓128g、白英128g、茵陈128g 、徐长卿128g、土鳖虫20g、白花蛇舌草128g。

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、人参、女贞子，加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，滤液和人参、女贞子残渣备用;

(3)、莪术、炒白术、徐长卿，合并提取挥发油，提油时间8小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用;

(4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、炒白术、徐长卿提油后的残渣合并，加9倍量水，加热煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液和步骤（3）中的水溶液，浓缩成相对密度1.25的清膏，干燥，粉碎，备用;

(6)、将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉134克，用85%乙醇制粒；

(7)、将步骤(3) 中所得挥发油用85%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6）中所得的颗粒混匀，密闭半小时，装入1000粒胶囊即得。

实施例2：

原料药配方为：

黄芪360g、女贞子100g、人参95g、灵芝30g、莪术195g、炒白术30g、半枝莲195g、绞股蓝120g、茯苓95g、鸡内金15g、蛇莓195g、白英65g、茵陈195g、徐长卿65g、土鳖虫30g、白花蛇舌草65g。

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加6倍量90%乙醇回流提取4小时，提取液回收乙醇至无醇味，滤液和人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、炒白术、徐长卿合并,加4倍量水提取挥发油，提油时间10小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用;

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用；

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、炒白术、徐长卿提油后的残渣合并，加7倍量水，加热煎煮3次，第一次1小时，第二次2小时，第三次3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液和步骤（3）中的水溶液，浓缩成相对密度1.15的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉112克，用78%乙醇制粒；

(7)、将步骤(3) 中所得挥发油用85%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6）中所得的颗粒混匀，按常规制剂方法制成1000片片剂。

实施例3：

原料药配方为：

黄芪120g、女贞子300g、人参30g、灵芝95g、莪术65g、白术90g、半枝莲65g、绞股蓝360g、茯苓30g、鸡内金45g、蛇莓65g、白英195g、茵陈65g、徐长卿195g、土鳖虫10g、白花蛇舌草195g。

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加10倍量50%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，滤液和人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入10倍量水提取挥发油，提油时间6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣合并，加10倍量水，加热煎煮3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液和步骤（3）中的水溶液，浓缩成相对密度1.30的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油用80%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成1000丸丸剂。

为证实本发明药物在治疗效果，用按实施例1制得的胶囊剂（以下称本发明药物），进行了以下试验研究：

实验例1 本发明药物抑制血管生成及本发明药物与FAK抑制剂协同作用的实验

材料与方法

材料

人脐静脉内皮细胞(HECV)购自于Interlab（米兰，意大利）。这些细胞维持在细胞培养基当中（DMEM）（西格玛奥德里奇，普尔，多赛特，英国），辅以青霉素、链霉素和10%的胎牛血清（西格玛奥德里奇）。细胞培养在37℃，5%CO₂和95%的湿度下进行。人工基底膜（重组基底膜）购自于Collaborative Research Products公司（贝德福德，马萨诸塞州，美国）。一种选择性抑制剂黏着斑激酶（FP573228）购自于Tocris公司（布里斯托尔，英国）。Paxillin来自于转导实验室，磷酸化特异性抗体（pFAK和pPaxillin）购自于santa-cruz生物技术公司（圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国）。

方法

受试药物预处理

为方便实验进行，将本发明药物（石家庄以岭药业股份有限公司生产）作如下预处理：本发明药物胶囊内容物400mg，加入DMSO1ml，常温下旋转轮20转/分，12小时，转速14000rpm离心30分钟，取上清液，加入平衡盐溶液，滤过，在405nm测光度吸收，稀释提取液至光度吸收0.25，此称为DME25，分装保存作为标准化的提取物，备用。

体外细胞生长方法

HECV细胞以每孔3000个细胞种在96孔板上。用一式三份的培养板孵育一晚，3天和5天。经过充分培养之后，将板子从培养器中移出，用4%的甲醛固定和5%的结晶紫染色。随后用10%的醋酸脱去结晶紫，使用Bio-Tek ELx800多功能酶标仪（Bio-Tek仪器公司，佛蒙特州，美国）检测细胞的密度。

电动细胞基质阻抗传感（ECIS）为基础的细胞粘附和迁移实验

ECIS-Zθ仪（应用生物物理学，新泽西州，美国）被用于细胞粘附和运动性（损伤检测）检测研究。细胞模型采用了ECIS RbA建模软件，由制造商提供。目前的厂家采用96W1E阵列。ECIS是通过置于培养皿表面的金膜电极来测量细胞与其附着的底物之间的相互作用。随后处理含有半胱胺酸溶液的阵列表面，该阵列用完全培养基培养1小时。在每个培养孔里添加相同数量的细胞。在细胞粘附试验中，其粘附性在将细胞加入阵列后被即刻跟踪。对于细胞迁移试验，细胞阵列在3小时后达到汇合。单层细胞用2000MA的电流电伤20秒。细胞层的阻抗和电阻记录20小时。信号转导抑制剂检测，在试验板孔里各自的抑制剂都位列其中。粘附和迁移是仿照使用ECIS RbA细胞建模软件。

体外管腔形成实验

体外微血管管腔形成评估使用基底膜内皮细胞小管形成试验。在无血清培养基下，将250μg的基底膜种植在96孔板上，并放置在培养器中至少40分钟使之胶化。在这之后，35000HECV接种到含有和不含MDE25或FAK抑制剂的基底层并培养4-5小时，在培养期间的管腔形成用高倍显微镜记录并拍摄。每一个视野内总的管腔周长用Image J软件来量化。

免疫荧光染色（IFC）

HECV细胞种于16孔腔式载玻片中(LAB-TEK Fisher，英国)，20000个/孔，孵育过夜（25）。吸除培养液，4%的福尔马林固定细胞20 min，BBS室温孵育20 min，再滴加0.1 % Triton X-100 BBS溶液，细胞穿孔5 min。采用MenaPath Autowash buffer封闭液（A. Menarini Diagnostics, 英国）孵育20 min，以阻断非特异性结合，每5毫升封闭液含马血清(Sigma, 英国)2滴。缓冲液润洗2次后，采用特异性抗体标记蛋白paxillin、p-Paxilli、FAK、p-FAK(Santa-Cruz，美国)。一抗以1:100稀释后孵育细胞1 h，缓冲液润洗3次，去除残余一抗。滴加FITC标记的抗鼠二抗(Insight Biotechnology, 英国)，将载玻片置于摇床上，避光孵育1 h。最后，载玻片润洗三次，去除未结合二抗，Fluor-save封片(Calbiochem-Novabiochem, 英国)后，采用奥林巴斯BX51荧光显微镜于100倍物镜下观察。

凝胶电泳和免疫蛋白

细胞在25 cm³组织培养瓶中生长至融合，收集细胞，加入HCMF缓冲液（含1% Triton X-100, 2 mM CaCl2, 100 μg/ml苯甲基磺酰氟, 1 mg/ml亮抑酶肽, 1 mg/ml抑蛋白酶肽and, 10 mM原钒酸钠），置于rotor wheel仪中裂解细胞1 h，13,000g离心去除不溶物。所得样品采用Bio-Rad DC蛋白试剂盒(Bio-Rad, 美国)进行蛋白定量。

将蛋白样品进行充分分离，采用Hybond-C Extra硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences, 英国)转膜，10%牛奶封闭后，测定特定蛋白的表达。分别采用抗-pFAK抗体和抗-pPaxillin抗体标记磷酸化的FAK 和 paxillin(27)。采用GAPDH特异性抗体(Santa-Cruz，美国)测定GAPDH表达，以评价样品的总蛋白水平与一致性。蛋白条带采用SWDED底物化学发光系统进行显色(Perbio Science，英国)，采用UVIProChem成像系统进行检测(UVItec，英国)。

结果

本发明药物可抑制微血管样小管的形成但不影响内皮细胞生长

体外小管形成实验结果表明，与对照组比较DME25能够显著缩短小管长度（P=0.046）（见图1 按1:1000稀释）。这个浓度对小管不产生生长抑制作用，同时对HECV也不产生细胞毒性。（见图2）DME25在相当广的浓度范围内对内皮细胞的生长没有显著的影响。

对细胞基质黏附具有抑制作用

  DME25对HECV细胞的黏附表现为浓度依赖性的抑制作用，明显的抑制作用浓度在1:5000或者更低（图3A，图4）。运用三维模型可以看到DME25的抑制作用经过重复性实验验证（图3B）。常规的细胞基质粘附模型中，DME25显著抑制细胞粘附作用（图3C-D）。

本发明药物能够减少内皮细胞迁移

和细胞基质黏附相似，细胞迁移同样能够被DME25抑制，并且在和FAK抑制剂联用时细胞迁移能够被进一步抑制。（图5）。

本发明药物和FAK抑制剂在内皮细胞黏附、迁移和小管形成存在着协同作用

FAK抑制剂对HECV细胞作用显著（图3C，3D，4B，5）。图中可以看出，与DME25联用时，抑制作用被协同增强。

FAK抑制剂对小管的形成表现为抑制作用但不具有显著统计学意义（p=0.14）（图1E）。但是DME25和FAK抑制剂联用与对照组、单用FAK抑制剂组以及单用DME25组相比对小管生成具有显著的抑制作用。（P=0.006，P=0.041，P=0.011）

本发明药物抑制内皮细胞FAK磷酸化

  我们进一步推断DME25对HECV细胞FAK和paxillin蛋白活性的作用，也就是这些蛋白的酪氨酸磷酸化，运用酪氨酸磷酸化特异性抗体。如图7中所示，DME25抑制FAK磷酸化并且在与FAK抑制剂联用时产生了更大的抑制作用。单用DME25或FAK抑制剂以及二者联用都能够显著作用于paxillin蛋白的磷酸化。通过免疫荧光方法可见，空白细胞中局部粘附点FAK被显著染色（图8，左侧被箭头指出的部位），加入DME25后，FAK抑制剂以及二者联用与空白组相比，虽然染色的程度没有变化，但表现出有较少细胞粘附斑（图8，左侧）。有趣的是部分FAK磷酸化的FAK被pFAK磷酸化抗体深染。如图8所示（右侧，延长暴露的时间），可见空白细胞局部粘附斑处被pFAK染色，DME25 和 FAK抑制剂导致pFAK染色减少，然而，二者联用的细胞完全没有被pFAK染色。

结论

抗血管生成治疗，如阿瓦斯汀，被作为实体肿瘤治疗的新起之秀，并且正在一些肿瘤类型中显现出其临床价值。一些传统的抗肿瘤化合物也被发现在抗血管新生方面的作用。本发明中药组合物作为一种中医药的复方药物，已经显现出其在肿瘤治疗临床疗效方面的优势，包括肝癌、胃癌这两种在中国处于高发病率的肿瘤疾病。也已经证实了其在化疗过程中的一些免疫保护作用。

本实验证实，本发明中药组合物对于肿瘤细胞黏附以及迁移的抑制作用。这两种细胞效应在内皮细胞的血管生成过程中具有重要作用。

由实验结果可见DME25能够显著的抑制体外血管内皮细胞的小管形成。进一步研究发现该提取物剂量依赖性的抑制细胞基质黏附和细胞迁移。这些结果证实本发明中药组合物具有抑制小管形成的作用。

本实验的结果证实是运用小剂量的FAK抑制剂阻断FAK能够显著提高本发明中药组合物的作用，同时提取物本身也对FAK活性有抑制作用，也就是对FAK酪氨酸磷酸化的抑制作用。FAK途径在细胞基质黏附和细胞黏附中的作用强于细胞外基质。在与基质的相互作用中，细胞利用膜整联蛋白与基质结合并触发一系列细胞内活化，其中一个关键的途径就是粘附斑激酶（FAK）的激活，FAK可反过来激活整联蛋白与细胞骨架系统的相互作用。这就形成了基质黏附与接下来细胞迁移过程中的重要组成部分。FAK被认为是血管生成过程中的重要信号通路。FAK抑制剂，在早期对于肺癌及乳腺癌的临床实验中显示了抗肿瘤的作用。

综合来看，可以说本发明中药组合物疗效的其中一个重要作用途径是通过抑制FAK途径在血管生成中的作用。总之，本发明中药组合物对于体外血管生成具有很好的作用，能够减少细胞基质黏附和细胞迁移，这是由于其作用于粘附斑激酶（FAK）途径。

实验例2 本发明药物对于肿瘤血管生成的抑制作用、对于肿瘤细胞的转移的抑制作用以及与Pi3K抑制剂协同作用的实验

材料和方法

材料

人乳腺癌细胞系，MCF-7 和 MDA MB-231；人前列腺癌细胞系PC-3 和 DU-145；人胃癌细胞系，HGC27 和AGS；人结肠癌细胞系，RKO and和 HRT18；均来自ECACC（欧洲动物细胞培养库，英国索尔兹伯里）。人骨肉瘤MG-63和人肺癌细胞系A549购自ATCC(美国标准细胞库)。这些细胞保存于添加青霉素、链霉素和10%胎牛血清的DMEM(Sigma-Aldrich, Poole Dorset, England)培养基中。细胞培养条件37^oC, 5% CO₂ 和 95% 湿度。

ROCK 抑制剂(Y27632) 购自Santa Cruz Biotechnologies Inc. (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., CA, US). JNK抑制剂 II (SP60015), ERK 抑制剂II (FR180204), JAK-3  抑制剂 (Jak-3 抑制剂 1 {4-(4’-Hydroxyphenyl)amino-6,7-dimethoxyquinazoline; WHI-P131}), 和 PLC-g (U73122) 购自 Calbiochem (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, England, UK). cMet kinase 抑制剂  来自 辉瑞制药. 基质胶(人造基底膜) 购自Collaborative Research Products (Bedford, Massachusetts, USA). 抗人GAPDH and anti-phopho-Akt 抗体购自Santa-Cruz Biotechnologies。

方法

受试药物预处理

为方便实验进行，将本发明药物（石家庄以岭药业股份有限公司生产）作如下预处理：本发明药物胶囊内容物400mg，加入DMSO1ml，常温下旋转轮20转/分，12小时，转速14000rpm离心30分钟，取上清液，加入平衡盐溶液，滤过，在405nm测光度吸收，稀释提取液至光度吸收0.25，此称为DME25，分装保存作为标准化的提取物，备用。

体外细胞增殖检测

细胞增殖采用体外细胞增殖分析方法(11,12)。细胞接种于96孔板中至3000个细胞/孔。三块板分别培养过夜、3d、5d后4% (v/v)甲醛固定，0.5%(w/v)结晶紫染色。10%乙酸抽提结晶紫采用分光光度计检测吸光度（Bio-Tek ELx800读板器，Vermont, USA）。

细胞基质电阻抗传感器检测细胞粘附和迁移

ECIS-Zq(Applied Biophysics Inc, NJ, US) 已用于细胞粘附额运动能力检测(13,14)。采用ECIS RbA 立体化软件构建细胞图。96W1E ECIS用于本次研究。通过置于培养板表面的金箔电极测量细胞与基质间相互作用。分析仪表面用10Mm的丝氨酸溶液预处理后，用全培养基在培养中孵育1h。等量细胞加入每个培养孔。在细胞粘附检测中，细胞加入分析仪后随即示踪。在细胞迁移检测中，要求细胞3h后融合。单层细胞电阻抗在2000iA进行损伤。阻抗和电阻随即记录至20h。采用信号转导抑制剂分析。粘附和迁移采用ECIS RbA 立体化软件进行立体图构建。

蛋白印迹分析

细胞在25cm³ 培养瓶中至融合，随后采用（含1% Triton X-100, 2 mM CaCl₂, 100 μg/ml苯甲基磺酰氟，1 mg/ml 亮肽素，1 mg/ml 抑肽酶和, 10 mM 原矾酸钠）HCMF缓冲盐吹打并振荡1h裂解细胞，13,000g离心去掉沉淀。样品中的蛋白含量采用Bio-Rad DC试剂盒(Bio-Rad laboratories, California, USA)检测。

等量蛋白采用SDS-PAGE胶分析。分离完成后向Hybond-C Extra硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences UK Ltd, Bucks, UK)转印，10%牛奶封闭，特异蛋白检测表达。磷酸化AKT(threonine)表达采用抗-pAkt抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA)检测。另外，GAPDH表达也采用特异抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA)检测。一抗连接后加入二抗—连接过氧化物酶的抗小鼠抗体(Sigma, Dorset, UK)。采用Supersignal West Dura Extended Duration底物化学发光系统(Perbio Science UK Ltd, Cramlington, UK)和UVIProChem成像系统(UVItec Ltd, Cambridge, UK)检查蛋白表达。

结果

本发明中药组合物对人肿瘤细胞粘附的作用

使用高通量ECIS检测DME25对不同肿瘤类型的细胞系，包括人乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌和骨肉瘤细胞。YZXJ浓度从1:40 to 1:600,000。浓度高于1:125,000对细胞粘附有抑制性作用。较敏感的细胞包括MCF-7, MG-63和A539，结果见图9。在现在的模型采用宽谱检测也可以证实其抑制性作用，结果见图10。使用Rb法以A549细胞为例（图11）图示定量分析结果。参数α表示基底膜与电极（基质）之间的平均距离。因此，它可以清晰地说明DME25对肿瘤细胞与基质之间存在剂量依赖性抑制。

本发明中药组合物抑制细胞迁移

检测了对肿瘤细胞粘附的作用之后，进行单层融合肿瘤细胞电损伤。采用ECIS检测周围肿瘤细胞损伤恢复。结果DME25对肿瘤细胞，肺癌和结肠癌，迁移表现出浓度依赖性抑制。图12表示DME25对A549细胞迁移的影响。药物浓度在1:125,000即可看到抑制性作用，与细胞粘附实验类似。

本发明中药组合物对人肿瘤细胞增殖影响微弱

进一步研究了DME25体外对细胞增殖的影响。DME25 (1:1000 和1:25,000)处理72h后（结果见表1），在较宽的浓度范围内，DME25对肿瘤细胞增殖无明显影响。

表1. DME25 对于离体癌细胞的生长抑制作用结果

细胞类型对照组(490nm吸光度)1:1000(490nm吸光度)1:25,000(490nm吸光度)RKO, 大肠癌细胞0.82±0.0.310.94±0.0.151.01±0.1PC-3, 前列腺癌细胞0.39±0.110.37±0.080.35±0.05MCF-7, 乳腺癌细胞1.39±0.341.52±0.411.32±0.54HGC27, 胃癌细胞0.72±0.10.95±0.310.97±0.1A549, 肺癌细胞0.24±0.080.21±0.070.24±0.03骨肉瘤细胞0.52±0.020.49±0.030.54±0.02

PI3K/AKT介导本发明中药组合物对细胞粘附的影响

为证实DNE25对细胞粘附作用的信号通路，针对PI3K/AKT 和 AKT检测抑制剂作用。单独加入Wortmannin (PI3K 抑制剂)或者与DME25联用抑制前列腺癌细胞(DU-145)粘附，与对照组和单用DME25比较，粘附均降低。联用较单用也表现出更强的抑制作用。AKT是PI3K的下游通路抑制剂，其抑制剂与DME25联用可提高对细胞粘附的抑制作用。单用抑制对细胞粘附抑制较弱，见图13。图14表示DME25对肺癌细胞系A549 AKT (Ser 473)磷酸化的影响。高浓度（1:1000）DME25降低AKT磷酸化(pAKT)水平。加入AKT抑制剂和DME25对pAKT可协同抑制，尤其与低浓度DME25（1:5000）联用。

结论

本发明中药组合物不仅具有抗肿瘤效果，而且可以直接抑制肿瘤细胞的粘附和迁移，防止肿瘤转移，并且与化疗药物的协同作用。 

实验例3本发明药物治疗类风湿性关节炎的作用及对类风湿性关节炎血管生成的抑制作用

 1  材料

1.1  动物  SD大鼠，雌雄各半，体重为180-200g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号SCXK（京）2006-0009。

1.2  药材与主要试剂  本发明药物胶囊（按照实施例1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；不完全弗氏佐剂（IFA）及酸溶性II型胶原（collagen II，3806）均为sigma产品；卡介苗为购于中国药品生物制品检定所。

方法

2.1 完全弗氏佐剂（Freund,s Complete adjuvant  CFA）的制备：在不完全弗氏佐剂（IFA）加入卡介苗，使之终浓度为7.5mg/ml，反复抽打成乳化剂。

2.2 大鼠胶原关节炎模型的制备：将牛II型胶原溶于0.1M的冰醋酸中，4℃过夜。然后与CFA研磨均匀，制成含II型胶原为2mg/ml的乳剂，将上述乳剂以150μl/只左足及尾根部皮下多点注入模型组及各给药组免疫大鼠（每只大鼠相当于注射150μg的II型胶原），于第10天每只大鼠尾根部注射同种乳剂150μl加强免疫。正常对照组不做任何处理。

2.3 实验动物的分组与给药：SD大鼠随机分为5组。即正常对照组，给等体积溶媒；胶原关节炎模型组，给等体积溶媒；本发明药物大、中、小剂量组，制备模型次日开始灌胃给予本发明药物，剂量分别为1.56、0.78、0.39 g·kg-1；各组给药容积均为1ml/100g体重，连续给药40天。

2.4 本发明药物对胶原关节炎大鼠关节炎指数的影响：给药结束后大鼠采用关节评分法进行评分。耳：结节和发红症状（无0分，有1分）；鼻：红、肿胀（无0分，有1分）；尾：结节（无0分，有1分）；前爪：至少一个关节的炎症（无0分，有1分）；右后爪：肿胀（无0分，轻度1分，中度2分，重度3分）。每组大鼠的平均得分为关节炎指数。

2.5 本发明药物对胶原诱导的关节炎大鼠的足趾容积的影响：用足趾容积测量仪测量每只大鼠的右后足足趾容积，观察各组大鼠足容积的变化。

2.6 病理变化：处死大鼠，取右侧踝关节，福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色方法。

2.7  统计学分析  结果以±s 表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA分析处理和Dunnett检验。

结果

3.1  本发明药物对胶原关节炎大鼠关节炎指数的影响：结果显示，首次免疫后约14天开始II型胶原模型大鼠及各给药组大鼠开始出现耳红肿和关节红肿，后足趾关节出现红肿后蔓延到前足和尾部，并日趋严重，有些鼠尾部出现明显的结节。与正常对照组比较，模型组关节炎指数明显升高（P<0.01）；与模型组比较，本发明药物能明显降低关节炎指数，中、高剂量组有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表1。

3.2  本发明药物对胶原诱导的关节炎大鼠的足趾容积的影响：与正常对照组比较，模型组足趾容积明显升高（P<0.01）；与模型组比较，本发明药物能明显降低足趾容积，中、高剂量组有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表2。

表2 本发明药物对胶原诱导的大鼠关节炎的的影响(±s)

组别N关节炎指数足趾容积对照组90±01.71 ±0.08模型组115.82±0.84^2）2.63 ±0.51^2）低剂量组104.99±1.212.33±0.41中剂量组114.14±1.57³⁾2.11 ±0.42³⁾积高剂量组114.02±0.73⁴⁾2.06 ±0.28⁴⁾

注：与对照组比较，¹⁾ P<0.05，²⁾P<0.01；与模型组比较，³⁾ P<0.05，⁴⁾ P<0.01。

3.3  病理变化：

正常组关节软骨可见1-2层滑膜细胞，关节面光滑，关节腔内无渗出物。

胶原模型组关节结缔组织及肌肉组织可见炎性细胞浸润，关节软骨可见滑膜组织中中性粒细胞、单核细胞，尤其是淋巴细胞浸润、血管增多，血管内膜变形增生，管腔变窄或阻塞，滑膜细胞下纤维素大量渗出，胶原纤维沉积。

本发明药物大、中剂量组对胶原关节炎的组织损伤有较好的改善作用。

结论

本发明药物对II型胶原诱导的大鼠关节炎有很好的防治作用。

讨论

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以累及周围关节为主的多系统炎症性自身免疫病。RA的主要特征是关节炎症反应、滑膜血管新生，进而导致慢性滑膜增生，进一步影响软骨和骨质，导致关节畸形和功能丧失为基本病理改变的疾病。II型胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）动物模型是目前公认的用于研究RA发病机制和开发治疗RA新药的理想动物模型，该模型由II型胶原（Collagen II，CII）诱导，CII是软骨的主要成分，为类风湿关节炎发病的自身抗原。临床类风湿关节炎病人血清和滑膜液中可查出II型胶原抗体。由于CIA模型发病机制更接近人类RA，因而是近年来研究类风湿性关节炎的首选模型。

  我们的实验观察到大鼠模型组出现耳红肿和关节红肿，后足趾关节出现红肿后蔓延到前足和尾部，有些鼠尾部出现明显的结节。病理也显示关节结缔组织及肌肉组织可见炎性细胞浸润，关节软骨可见滑膜组织淋巴细胞浸润、血管增多，血管内膜变形增生，胶原纤维沉积。本发明药物能明显改善一般症状和病理变化。

模型组关节炎指数和足趾容积明显升高，本发明药物能显著降低关节炎指数和足趾容积，改善病灶血管增多，血管内膜变形增生的病理改变，证实本发明药物对II型胶原诱导的大鼠关节炎有很好的防治作用。

实验例4本发明药物治疗糖尿病视网膜病变的作用及对糖尿病视网膜病变血管生成的抑制作用

 1  材料

1.1  动物  KK/Upj-Ay小鼠，30～40 g；C57BL/6小鼠，25～30 g，均为SPF级，雄性，12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2  药材与主要试剂  本发明药物胶囊（按照实施例1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；内皮生长因子（VEGF）一抗（Santa Cruz公司）。

2方法

2.1  动物分组与给药  40只KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值（FBG）分为模型组、本发明药物高、中、低剂量组，另设C57BL/6小鼠为对照组，每组10只动物。采用灌胃给药，本发明药物高、中、低剂量组分别给予1.56、0.78、0.39 g·kg^-1的本发明药物，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日一次，连续3个月。

2.2  形态学变化  

2.2.1 给药结束后，取小鼠眼球，置于甲醛固定，HE染色；

2.2.2 小鼠眼球，取眼球，固定于10%甲醛液中48 h，分离视网膜，自来水漂洗，放入3%胰蛋白酶消化液37℃孵箱中消化振荡约3h，仅剩下一层透明的视网膜血管网，进行HE-PAS染色。

2.2.3 小鼠眼球，置于戊二醛固定，电镜观察超微结构。

2.3  Western blot法检测VEGF蛋白的表达   取视网膜组织，RIPA裂解法提取总蛋白，将蛋白样品进行12%的SDS－PAGE凝胶电泳，4℃恒压电转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，后加入一抗（1:200 稀释的VEGF，1:1000 稀释的GAPDH内参），4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释浓度1:1000)，ECL暗室 发光显色，凝胶成像系统照相扫描灰度值分析，以目的蛋白灰度值与GAPDH的灰度值比值用于统计分析。

2.4  统计学分析  结果以±s 表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA分析处理和Dunnett检验。

3结果

3.1 HE染色：对照组视网膜各层细胞层次分明，细胞结构紧密；模型组视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱，本发明药物能改善上述变化。

3.2 HE-PAS染色：正常小鼠视网膜毛细血管分布规则，走向较直，管径粗细均匀一致；模型组视网膜毛细血管网排列紊乱，走向极不规则，多根毛细血管扭聚成丛，部分毛细血管扩张、管腔粗细不均；本发明药物能明显改善上述变化，以高剂组最为明显。

3.3电镜结果：对照组小鼠视网膜，光感受器细胞内、外节交界处，线粒体嵴清晰，细胞排列整齐，细胞核和细胞器正常；模型组视网膜，出现空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性。内、外核层细胞内线粒体肿胀，光感受器细胞膜破裂，核固缩，周边可见细胞碎屑。本发明药物组外节膜盘间隙较模型组缩小，排列平行度稍好，内外核层细胞线粒体空泡变性有所减少，高剂量组最为明显。

3.4 视网膜VEGF表达： Western blot结果显示VEGF蛋白表达在对照组正常视网膜中表达较低，模型组VEGF蛋白表达明显高于对照组（P<0.01），本发明药物干预后VEGF蛋白表达显著低于模型组，且中、高剂量组有统计差异（P<0.05，P<0.01）。见表3。

表3 本发明药物对KK小鼠视网膜VEGF表达的影响(n=3, ±s)

组别VEGF对照组0.25±0.03模型组0.78±0.15²⁾本发明药物低剂组0.57±0.11本发明药物中剂组0.44±0.07³⁾本发明药物高剂组0.31±0.05⁴⁾

注：与对照组比较，¹⁾ P<0.05，²⁾P<0.01；与模型组比较，³⁾ P<0.05，⁴⁾ P<0.01。

4结论

  本发明药物对糖尿病视网膜病变小鼠有一定的防治作用，VEGF蛋白表达显著降低，可有效抑制血管生成。

5讨论

临床中II型糖尿病占糖尿病群体的90% 以上，一般研究者均选用II型糖尿病（DM）动物模型。本实验中选用的KK小鼠为自发性DM模型，已被广泛用于DM的基础研究。有报道称8-12周龄KK小鼠饲养3个月后视网膜出现了明显的毛细血管和神经病变，本研究通过预实验也观察到了相似的结果，因此在此研究中我们选择了8-12周龄KK小鼠饲养3个月作为糖尿病视网膜病变（DR）模型。我们的光镜和电镜结果也显示了模型组小鼠视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱；毛细血管网排列紊乱，走向极不规则；出现空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性等病理损伤，提示糖尿病视网膜病变模型已经形成。

光镜和电镜结果同时显示本发明药物能改善视网膜病理损伤，从形态学上证实了本发明药物可延缓糖尿病大鼠视网膜病变的出现，对DR确有防治作用。

在正常眼组织中，视网膜色素上皮细胞、视网膜血管周细胞、内皮细胞和Müller 细胞均可产生较低水平的VEGF，用以维持血管稳定性和视网膜正常发育，但在高糖条件下，VEGF 被释放，导致一系列的反应，包括视网膜血管渗漏、刺激视网膜内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管形成等。本实验也证实了模型组DR小鼠视网膜VEGF蛋白表达显著升高。给予不同剂量的本发明药物治疗3个月后，VEGF表达均有不同程度的降低，证实本发明药物可通过降低VEGF表达，抑制血管生成，从而起到保护糖尿病小鼠视网膜的作用。

实验例5 本发明药物对于动脉斑块的稳定作用及对动脉斑块血管生成的抑制作用 

1  材料

1.1  动物  大耳白兔，普通级，雄，2.0~2.4 kg，购买于北京科宇动物养殖中心，许可证编号：SCXK（京）2007-0003。

1.2  药材与主要试剂  本发明药物胶囊（按照实施例1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；油红0购自美国Sigma公司；天狼猩红购自美国Sigma公司。

方法

2.1 研究方法：30 只雄性大耳白兔，应用球囊损伤腹主动脉+高胆固醇饲料(l%胆固醇,每只喂养饲料120-140g/d)喂养8 周的方法，建立稳定动脉粥样硬化（As）斑块模型, 随机分为：本发明药物治疗组(每天给予0.39 g·kg-1本发明药物胶囊，本发明药物组)，普通饮食喂养自然消退组（对照组），继续高脂喂养对照组(模型组)。每组10只兔子。模型组和本发明药物组建模后继续高脂饮食喂养，分别单笼喂养，自动饮水，12 周后给予中国斑点螃蛇毒和组胺进行药物触发0.15mg/kg腹膜下注射，30min后耳缘静脉注射组胺0.02mg/kg，处死动物前24 h、48 h 两次药物触发，以促使斑块发生实验性破裂， 触发后处死。

2.1血管内超声显像检查（IVUS）的测定：分别药物触发后进行腹主动脉血管内超声检查。3%戊巴比妥钠麻醉后，将实验兔仰卧位固定于实验台上，具体操作如下：常规应用4F穿刺针穿刺左股动脉，在0.014英寸导引钢丝及扩张管辅助下，插入5F 鞘管，固定，立即静脉给予肝素100u/kg抗凝，沿导引钢丝在体表血管超声的引导下，插入血管内超声探头导管，通过狭窄病变至血管远端，然后缓慢回撤探头导管（0.5mm/s），标记斑块远端、近端图像，录像供脱机分析和存档。测量三组动物斑块破裂的发生率，同时测定

（1）血管外弹力膜面积（external elastic membrance area，EEMA）：指血管外弹力膜所包含的面积，包括血管腔面积和斑块面积之和。

（2）管腔面积（lumen area，LA）：指血管内膜所包含的面积。

（3）斑块面积（plaque area，PA）：血管外弹力膜面积与管腔面积之差。

（4）管腔面积狭窄百分率（lumen area stenosis，LAS%）：斑块面积与血管外弹力膜面积之比。

2.2 特殊染色：利用油红O染色观察斑块内脂质、胶原相对含量。

2.3  统计学分析  结果以±s 表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA分析处理和Dunnett检验。

结果

3.1 血管内超声显像检查（IVUS）：

与模型组比较，本发明药物组实验兔EEMA、PA、LAS%下降明显（P<0.01），（表4）。测得的三组动物腹主动脉斑块的破裂率：本发明药物组：0%；对照组：0% ；模型组：33%。

表4治疗12周后实验兔腹主动脉IVUS测值的比较

指标本发明药物组(n=9)对照组(n=9)模型组(n=9)LA(mm²)6.59±1.287.27±1.747.93±2.26EEMA(mm²)9.44±1.88**12.82±2.3415.23±2.39PA(mm²)2.55±1.04**5.19±2.245.99±2.17LAS(%)25.76±2.11**39.15±2.9442.83±3.62

注：与模型组比较** P<0.01

3.2 病理变化：

特殊染色显示模型组油红O染色阳性百分比明显高于对照组，与模型组比较，本发明药物组阳性百分比显著降低。

结论

本实验应用球囊损伤腹主动脉+高胆固醇饲料建立了家兔动脉粥样硬化模型，通过IVUS检查表明本发明药物治疗组可显著降低EEMA、PA、LAS%，并降低斑块的破裂率，从而发挥稳定易损斑块的作用，显微观察可明显减少斑块内血管数量，抑制血管生成。