PPAR-γ其配体在制备治疗眼科疾病药物中的用途

摘要

本发明属医药领域，涉及PPAR-r其配体在制备治疗眼科疾病药物中的新用途，本发明采用外源性PPAR-r配体罗格列酮，匹格列酮或酪氨酸衍生物，通过在眼部视网膜缺血再灌注损伤动物模型中试验研究，结果表明PPAR-r其配体，尤其是匹格列酮能显著改善视功能，抑制胶质细胞活化所引起的视网膜炎症反应，对抗缺血再灌注所引起的视网膜细胞凋亡，可制成治疗眼部缺血性及视神经损伤疾病的药物，用于治疗包括青光眼急性大发作，糖尿病视网膜病变，高血压视网膜病变，视网膜血管栓塞，早产儿视网膜病以及影响视网膜血流量的眼科手等疾病，进一步改善视功能。

说明书

技术领域

本发明属医疗领域，涉及PPAR-γ其配体在制备治疗眼科疾病药物中的用 途，尤其是在制备治疗缺血性或神经损伤性眼科疾病药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferators -activated receptor-γ，PPAR-γ)是一类配体激活的转录因子，属2型核受体超 家族成员，其在糖类和脂类代谢以及细胞增殖分化中起到重要作用，因而PPAR- γ配体曾广泛应用于糖尿病治疗。已知PPAR-γ有两种配体，其一，为内源性配 体，主要包括多不饱和脂肪酸及脂肪酸衍生物，如亚油酸、亚麻酸、二十碳五稀 酸、部分前列腺素，白三烯B4，其中15d-PGJ2（15脱氧前列腺素J2）是较强的 天然激动剂，活性达到微摩尔级；另一种为化学合成配体（外源性），主要包括 噻唑烷二酮类药物，如，罗格列酮，匹格列酮等，和酪氨酸衍生物（GW7845） 等。研究显示，天然配体特异性较弱，而化学合成配体作用及特异性相对较强。

缺血再灌注损伤是眼科常见的病理过程，涉及眼科多种疾病，包括青光 眼急性眼压升高，糖尿病视网膜病变，高血压视网膜病变，视网膜血管栓塞，早 产儿视网膜病以及影响视网膜血流量的眼科手术等等。视网膜组织发生来源于原 始视杯，是中枢神经系统在外周的延伸，其新陈代谢旺盛，在缺血缺氧环境中极 易受到损伤，从而引起视功能的改变。在上述疾病发生发展过程中，缺血再灌注 损伤是其造成眼部损害的主要原因，且有着部分共同的特点，视网膜损伤除了血 液循环障碍所引起的视网膜各层组织形态及功能紊乱外，神经元变性、凋亡、坏 死成为损伤后逐步偷走视力的元凶。因此，寻找能够保护视功能的保护，以及维 持损伤后视神经存活及功能的方法成为当下以至今后很长一段时期的热点研究 方向。

发明内容

本发明的目的是提供PPAR-r其配体在制备治疗眼科疾病药物中的新用途， 尤其涉及眼科缺血性病变以及神经损伤性病变中视网膜及视功能的保护作用。

本发明所述的PPAR-r其配体选自外源性PPAR-r配体匹格列酮，罗格列酮或 酪氨酸衍生物（GW7845）；

本发明中，采用外源性PPAR-r配体进行了动物模型的眼部缺血性及视神经 损伤的治疗试验，结果显示，所述的PPAR-r其配体对视网膜形态学以及视功能 具有保护作用，本发明的一个实施例中，采用外源性PPAR-r配体匹格列酮进行 动物试验，结果表明，所述的匹格列酮具有如下作用：

1、能减轻视网膜形态学损伤变化，维持神经节细胞及内丛状层及整个视网 膜厚度；

2、具有在缺血损伤中减少视网膜神经节细胞丢失的作用；

3、具有保护视功能的作用，对视觉电生理包括视网膜电图、视觉诱发电位 均具有保护作用；

4、具有抑制胶质细胞活化所导致的视网膜损伤的作用；

5、具有抑制视网膜急性损伤后炎症激活的作用；

6、具有抑制视网膜细胞凋亡的作用；

实验结果表明，本发明的PPAR-r其配体，优选匹格列酮，对视网膜形态学 以及视功能具有保护作用，能显著改善视功能，抑制胶质细胞活化所引起的视网 膜炎症反应，对抗缺血再灌注所引起的视网膜细胞凋亡；所述的PPAR-r其配体 可作为治疗眼科疾病的药物，尤其是治疗眼部缺血性及视神经损伤疾病的药物以 及改善视功能或抗视网膜细胞凋亡的药物；用于治疗包括青光眼急性大发作，糖 尿病视网膜病变，高血压视网膜病变，视网膜血管栓塞，早产儿视网膜病以及影 响视网膜血流量的眼科手术等疾病，进一步改善视功能。

附图说明

图1是上丘逆行标记视网膜铺片视网膜神经节细胞(RGC)计数，

其中，A.为缺血再灌注损伤后7天各组视网膜组织铺片，荧光显微镜观察结 果，显示只有存活的RGC细胞，能够有较好的轴浆转运功能的细胞才能将荧光染 料从上丘脑运送至RGC胞体，从而通过激发荧光观察到存活的细胞；

B为统计学分析图，显示正常对照组RGC密度约为2549.2±113.85/mm2， I/R损伤后RGC密度较正常减少53％(p<0.001)，匹格列酮经腹腔给药组RGC密度 约为正常组77％，经眼周给药组RGC密度约为正常组的74％，与损伤组有显著统 计学差异（p<0.01）；

图中，RGC，视网膜神经节细胞；Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射。

图2为匹格列酮保护大鼠闪光视觉诱发电位（fVEP）实验结果，

其中，A为四组大鼠典型fVEP波形，显示I/R损伤组N1-P1，P1-N2，N2-P2成 分的振幅均较正常组显著下降（p<0.01）；匹格列酮经腹腔给药及经眼周给药显 著减少fVEP P1-N2成分振幅下调（p<0.01），两种给药方式间差异无统计学意 义；图中Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射。

图3为匹格列酮保护大鼠闪光视网膜电图（fERG）实验结果，

其中，A为四组大鼠典型fERG波形，显示I/R损伤组a波、b波成分振幅较正 常组显著下降（p<0.01）；匹格列酮经腹腔给药及经眼周给药显著减少ERG b波成 分振幅下调（p<0.01），两种给药方式间差异无统计学意义；

图中^**p<0.01vs.control##p<0.01vs.I/R by Student’s two-tailed t-test.Pio， 匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射。

图4是TUNEL法检测视网膜组织细胞凋亡，

其中，A为大鼠视网膜缺血再灌注损伤后24小时凋亡检测结果；

B为凋亡细胞数统计学分析，Tunnel染色显示匹格列酮对于大鼠视网膜缺血 再灌注所引起的视网膜各层细胞凋亡具有明显的抑制作用；其中，RGC，视网膜 神经节细胞；IPL，内丛状层；；INL，内核层，ONL，外核层；OPL，外丛状层；RPE， 视网膜色素上皮；Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射；Control为正常；

标尺为50um.放大400倍视野。

图5是各实验组视网膜组织bax/bcl-2表达，

其中，A显示损伤后24h，免疫蛋白印记检测bcl-2及bax表达结果；

B为A图中bax/bcl-2条带灰度比值的统计学分析，图中结果^*p<0.05，vs.I/R group^**p<0.01vs.I/R group  （Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格 列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射。

图6.各实验组视网膜组织PPAR-r表达，

其中，A显示损伤后24h，免疫蛋白印记检测PPAR-r表达结果；

B为A图中PPAR-r条带灰度值的统计学分析，图中结果^*p<0.05，vs.I/R group^**p <0.01vs.I/R group（Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格列酮；ip，腹 腔注射；po，眼周注射。

图7.匹格列酮降低胶质细胞酸性蛋白（GFAP）蛋白表达，

其中，A显示损伤后7天，免疫蛋白印记GFAP为位于50kd大小的单一条带； B为A图中条带灰度值的统计学分析，图中结果^**p<0.01vs.control，#p<0.05vs. I/R group（Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po， 眼周注射。

图8.匹格列酮降低胶质细胞酸性蛋白（GFAP）mRNA表达，

其中，Real-time PCR显示I/R损伤后7天GFAP基因表达显著上调；匹格列酮 预处理组GFAP表达较I/R组下调，图中结果^*p<0.05，^**p<0.01vs.I/R group （Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注 射。

图9.匹格列酮降低视网膜组织肿瘤坏死因子（TNF-a）表达，

其中A显示损伤后7天，免疫蛋白印记检测TNF-a为位于17kd大小的单一条 带；B为A图中条带灰度值的统计学分析，图中结果^*p<0.05vs.I/R group，^**p< 0.01vs.I/R group  （Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格列酮；ip，腹 腔注射；po，眼周注射。

图10.匹格列酮降低视网膜组织核因子-kB（NF-kB）活化，

其中，A显示损伤后7天，免疫蛋白印记检测Phosphorylated NF-κB p65及 NF-κB p65条带；

B、C为A图中条带灰度值的统计学分析，图中结果^*p<0.05，vs.I/R group^**p <0.01vs.I/R group（Student′s t-test）；I/R，缺血再灌注；Pio，匹格列酮；ip，腹 腔注射；po，眼周注射。

图11.免疫组织化学检测各实验组视网膜组织核因子-kB p65（NF-kB p65）表 达，

图中在RGC及内核从中可见染色为深褐色的NF-kB p65阳性细胞，RGC，视网 膜神经节细胞；IPL，内丛状层；INL，内核层；ONL，外核层；OPL，外丛状层；RPE， 视网膜色素上皮；Pio，匹格列酮；ip，腹腔注射；po，眼周注射；标尺为50um.放大 400倍视野。

具体实施方式

首先动物分组及建立缺血再灌注损伤（I/R）模型

104只SD大鼠随机分为4组，分别为：1、I/R损伤组；2、I/R损伤+匹格 列酮1.0mg/kg腹腔注射组；3、给予实验动物：I/R损伤+匹格列酮0.5mg/kg眼 球旁（眼周）注射组；4、正常对照组。

给药组均为药物预处理，在损伤模型进行前3小时给予药物处理。

方法：实验前散瞳检查排除角膜病及葡萄膜、晶状体、玻璃体疾病。大鼠腹 腔麻醉(10％水合氯醛)0.4ml/100g至睡眠状态。将连接生理盐水输液管的29G 针头置针刺入大鼠右眼前房，升高输液瓶150cm可在眼内形成110mmHg左右 的眼压，可观察到球结膜苍白，眼底血管断流。持续l小时后降低输液瓶高度至 动物水平，拔出前房灌注针头，可见眼结膜充血，恢复血液供应。

实施例1：PPAR-r其配体匹格列酮减少视网膜形态学损伤，维持神经节细胞 及内丛状层视网膜厚度试验

模型损伤后7天大鼠经心脏多聚甲醛灌注固定按常规处理，获取眼球，予石 蜡包埋，制作眼球切片，行HE染色明确视网膜各层组织结构。结果显示，缺血 再灌注损伤（I/R损伤）7天后整个视网膜尤其是内丛状层厚度显著减少（retinal thickness：119.3±3.593um；IPL：13.45±0.476um；n=6per group)给药组无论经 腹腔全身给药或经眼球旁局部给药，视网膜组织各层结构均较损伤组清晰，视网 膜厚度均大于损伤组，内丛状层及内核层尤其明显(腹腔注射组retinal thickness： 158.2+5.848um，p=0.0109vs I/R；IPL：34.84±1.429，p<0.0001vs I/R；n=6per group；眼周注射组retinal thickness：143.7±7.967um，p=0.0109vs I/R；IPL： 25.54±2.018um p<0.0001vs I/R；n=6per group)，具有显著统计学意义，实验 结果证实，匹格列酮具对视网膜形态学，尤其是损伤后内层视网膜厚度的维持具 有保护作用。

实施例2：PPAR-r及其配体匹格列酮在缺血损伤中减少视网膜神经节细胞 丢失试验

高眼压模型术后行上丘逆行标记，确定上丘体表投射位置，经颅骨孔注入 4％DiI后关闭切口；模型损伤后7天大鼠经心脏多聚甲醛灌注固定，常规处理， 获取眼球，解剖分离出视网膜，行视网膜铺片，荧光显微镜下观察RGC存活状 态；存活的RGC细胞，能够有较好的轴浆转运功能的细胞能将荧光染料从上丘 脑运送至RGC胞体，从而通过激发荧光观察到存活的细胞；如图1所示，正常 对照组RGC密度约为2549.2±113.85/mm2，I/R损伤后RGC密度较正常减少 53％(p<0.001)，匹格列酮经腹腔给药组RGC密度约为正常组77％，经眼周给药 组RGC密度约为正常组的74％，与损伤组有显著统计学差异（p<0.01）；给药组 无论经腹腔全身给药或经眼球旁局部给药，对视网膜RGC具有显著的保护作用， 再缺血再灌注损伤后显著减少RGC的丢失，成为对视功能维持的物质基础。

实施例3：PPAR-r及其配体匹格列酮具有保护视功能的作用试验

模型损伤后活体动态检测大鼠视觉电生理改变，包括闪光视网膜电图 （fERG）及闪光视觉诱发电位（fVEP）；损伤7天后，损伤组视网膜电图a波及 b波振幅均显著下降（p<0.01）；匹格列酮预处理组，大鼠经心脏多聚甲醛灌注 固定常规处理获取眼球，予石蜡包埋，制作眼球切片，行HE染色明确视网膜各 层组织结构，结果显示，给药组无论经腹腔全身给药或经眼球旁局部给药，视网 膜组织各层结构均较损伤组清晰，视网膜厚度均大于损伤组，内丛状层及内核层 尤其明显，具有显著统计学意义，实验结果证实匹格列酮具对视网膜形态学，尤 其是损伤后内层视网膜厚度的维持具有保护作用。

实施例4：PPAR-r及其配体匹格列酮抑制视网膜细胞凋亡的作用试验

如图4所示，TUNEL染色阳性细胞显示为深褐色，在SD大鼠视网膜缺血再灌 注损伤模型中，60min急性高眼压所致视网膜血管断流在损伤24h后可导致视网 膜各层不同程度的细胞凋亡，再给予匹格列酮预处理的实验组，视网膜各层细胞 凋亡数目均显著减少，与此同时，视网膜组织中促凋亡以及抗凋亡平衡被打乱， 损伤后bax/bcl-2表达显著增高，而给予匹格列酮预处理的两组实验组，均较损 伤组上调倍数降低，如图5所示；视网膜细胞凋亡是视网膜缺血再灌注后所导致 的严重不良后果之一，视网膜神经元细胞不可再生，其凋亡将对视网膜功能以及 整体的视功能造成严重的损害；在给予匹格列酮预处理后，损伤早期观察到 PPAR-r表达的上调，如图6所示，而损伤组显著下调，提示PPAR-r本身在该过 程中起到了重要的保护作用，因此PPAR-r及其配体匹格列酮的抗凋亡作用在视 网膜缺血及视神经损伤等疾病的治疗中具有重要应用价值。

实施例5：PPAR-r及其配体匹格列酮抑制胶质细胞活化的作用试验

胶质细胞酸性蛋白（GFAP）是视网膜组织中Muller细胞和星形胶质细胞的 重要标志物，为RGC提供代谢和营养支持，并维持细胞外离子和神经递质的稳态， 在视网膜损伤时还发挥吞噬细胞的作用，诱发炎症和免疫应答，在视网膜环境中 充当免疫监视及调控的关键因素，胶质细胞过度激活则会导致视网膜的损伤；如 图7、8所示，损伤后，GFAP的表达大幅上调，在匹格列酮预处理组，药物的作 用够在转录及翻译水平均显著的抑制胶质细胞的激活。

实施例6：PPAR-r其配体匹格列酮抑制视网膜急性损伤后炎症激活扩大的 作用试验

TNF-a是局部免疫应答的重要成分，是引起RGC继发损伤的重要原因之一， 如图9所示再给予匹格列酮预处理后，给药组TNF-a水平均较损伤组明显降低， 同时，匹格列酮预处理后，损伤的视网膜组织NF-kB激活水平显著低于损伤组， 如图10、及11所示；NF-kB的激活是炎症反应中重要的中间环节，可诱导多条 炎症信号通路的信息传递，结果显示，PPAR-r其配体匹格列酮具有抑制视网膜 损伤后炎症反应扩大激活的作用。