一种倾斜宽场光切片扫描成像显微系统及其成像方法

摘要

本发明包括激光发射装置，由激光发射装置发射的激光入射二维扫描振镜、准直透镜组及第一显微物镜组成的激光扫描光路对样品台上的样品进行倾斜扫描；第二显微物镜、场镜、探测器组成了成像探测光路，其光轴与激光扫描光路光轴垂直，成像显示控制装置通过数据采集卡、样品台控制装置分别控制二维扫描振镜、第二显微物镜、探测器的同步动作及样品台的自动位移，对采集的探测器成像数据处理形成样品宽场三维图像信息。本发明的成像显微系统及成像方法扫描成像速度快，分辨率高，可实现宽场扫描成像。

说明书

技术领域

本发明属于光学显微领域，尤其是指光切片照明扫描显微成像装置和显微成像方法。

背景技术

随着科学技术的发展，人们对于分辨微小结构以及生物功能显微成像方面提出了越来越高的要求。除了高分辨率的要求之外，在检测时间以及检测范围上也同样需要更快更广。

1994年，光切片照明荧光显微，即平面光显微镜最早提出并被用于观察较大的样品，最初使用了正交光切片照明显微的方式。在该设计中，使用光切片垂直照明样品，然后在与照明光垂直的方向上观察被照明面的荧光图像。 但是这种光切片扫描过程中需要通过平台移动来实现扫描过程，扫描速度较慢。

但是，目前在生物和医学众多领域，往往需要在保证较高分辨率的同时，对较大范围的生物组织快速进行显微成像，现有技术依然不能满足这一要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种倾斜宽场光切片扫描显微成像系统及方法，通过该装置，可在保证高分辨率的同时，对较大范围的样品组织进行快速显微成像。

为解决上述技术问题，本发明提供一种倾斜宽场光切片扫描成像显微系统，依次包括激光发射装置、二维扫描振镜、准直透镜组、第一显微物镜、样品台、第二显微物镜、场镜、探测器、数据采集卡及成像显示控制装置；其中，所述二维扫描振镜反射所述激光发射装置产生的激光后经所述准直透镜组聚焦再准直后经所述第一显微物镜倾斜入射放置在所述样品台上的样品形成倾斜入射样品的激光扫描光路；所述准直透镜组包括第一透镜和第二透镜，靠近所述第一显微物镜的所述第二透镜与所述第一显微物镜构成4f光学系统；扫描样品后的出射光依次经所述第二显微物镜、所述场镜后在所述探测器上成像形成成像探测光路；所述激光扫描光路的光轴和所述成像探测光路的光轴垂直；所述第二显微物镜安装在压电片底座上，并可沿成像探测光路的光轴轴向发生位移；

所述样品台上的样品被所述激光扫描光路聚焦光斑照亮区域位于所述第二显微物镜的物方焦面上；

所述数据采集卡分别与所述激光发射装置、所述二维扫描振镜、所述压电片底座及所述探测器连接，并分别向与其连接的所述各部件发送控制信号控制所述各部件动作；

所述样品台与一样品台控制装置连接，所述样品台控制装置控制所述样品台进行三维移动；

所述成像显示控制装置分别与所述探测器、所述样品台控制装置、所述数据采集卡连接，并分别向所述探测器、所述样品台控制装置、所述数据采集卡发送设定参数及控制指令；并处理显示样品三维图像信息；

当样品为荧光标记时，在所述第二显微物镜与所述场镜之间设置有滤光片。

所述激光发射装置依次包括激光发生器、单模光纤、及准直透镜；所述激光发生器发出激光经所述单模光纤耦合后经所述准直透镜形成激光光束入射所述二维扫描振镜。

所述二维扫描振镜包括横向扫描头和纵向扫描头，所述数据采集卡分别向所述横向扫描头和纵向扫描头发送控制电压信号控制其偏转角度及偏转周期。二维扫描振镜接收来自数据采集卡的控制电压信号，进行有规律有次序偏转，实现扫描激光在样品上的有序扫描，形成光切片序列。

所述准直透镜组的第一透镜的像方焦点和第二透镜的物方焦点重合。

所述数据采集卡向所述二维扫描振镜发送的控制电压信号周期、向所述压电片底座发出的控制电压信号周期、及所述探测器的曝光时间相同。

所述激光发射装置包括发射不同波长激光的第一激光发射装置和第二激光发射装置，所述第一激光发射装置依次包括激光发生器、单模光纤、准直透镜及反射镜，所述第二激光发生装置依次包括激光发生器、单模光纤、准直透镜及偏振分束器；所述第一激光发射装置发射的激光光束经准直后由所述反射镜反射至所述偏振分束器，再经所述偏振分束器反射入射所述二维扫描振镜，同时，所述第二激光发射装置发射的激光光束经准直后穿过所述偏振分束器入射所述二维扫描振镜；所述第一激光发射装置和第二激光发射装置所产生的激光于所述二维扫描振镜处合束后再经准直通过所述第一显微物镜入射样品；所述样品为经双色荧光标记的双色荧光样品。

根据上述本发明的成像系统进行成像的方法也是本发明所要解决的技术问题。本发明的一种倾斜宽场光切片扫描成像方法，包括如下步骤：

（1）调节倾斜光切片扫描成像显微系统至初始位置；将样品划分为多个扫描区域；

2）激光发射装置发射出激光光束经单模光纤耦合后，经准直透镜准直得到准直激光光束并入射二维扫描振镜后，经准直透镜组聚焦再准直后经第一显微物镜倾斜入射样品；

3）通过样品台控制装置调节样品台水平和垂直位置，使样品被照亮区域位于入射激光光束的束腰位置；通过显示成像控制装置控制数据采集卡向压电片底座发送调节信号，使第二显微物镜沿压电片底座光轴方向位移，使样品被照亮区域位于第二显微物镜的物方焦面上；然后，精确调节样品平台水平位置，使入射激光聚焦光斑位于样品目标区域；

（4）数据采集卡向二维扫描振镜发送周期相同的横向扫描电压控制信号和纵向扫描电压控制信号，二维扫描振镜中横向扫描头和纵向扫描头分别在横向、纵向依次有序转动，周期性有序性调节二维扫描振镜出射激光光束的角度，实现激光光束穿过第一显微透镜后的入射激光聚焦光斑在样品入射面内周期性有序性的移动扫描形成一组样品光切片序列；同时数据采集卡向压电片底座发送控制信号调节第二显微物镜位置，保证入射激光聚焦光斑扫描光切片一直位于第二显微物镜的物方焦面上；同时，采集数据卡向探测器发送控制拍摄速率的控制信号使其拍摄速率与光切片扫描移动速率相同；

（5）形成的一组样品光切片序列依次经反射后通过第二显微物镜和场镜在探测器上依次成像；所述样品光切片的长度等于所述聚焦激光光斑的横向扫描幅度，宽度等于聚焦激光在样品中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直径；

6）二维扫描振镜及第二显微物镜被还原至初始位置，调节样品台至目标扫描区域，重复上述操作，对其他扫描区域进行依次依序扫描；

7）显示成像控制装置采集各个扫描区域扫描后形成的样品光切片序列数据，并进行数据处理及拼接，形成样品宽场三维图像信息。

在进行荧光样品扫描成像时，在第二显微物镜和场镜之间需要增加滤光片，通过滤光片消除由于激光光斑散射和反射引入的杂散光，仅使激发荧光反射光通过滤光片后在探测器上成像。

上述的显示成像控制装置为主控计算机，通过软件可以对数据采集卡、样品台控制装置等输出控制信号进行控制。激光发射装置中的激光发射强度通过数据采集卡进行控制，由主控计算机输入控制信号，自动调节激光强度。探测器为CCD探测器，探测器的成像探测面位于场镜的像方焦面上。

激光发射装置为两组时，两组发射的激光波长不同，不同波长的激光波长可以激发样品上标记的两种荧光，产生不同的荧光反射光，位于第二显微物镜和场镜之间的滤光片可以允许激发的不同波长的荧光反射光通过，但是激光光束的散射和反射光则不禁止通过；两种不同波长的荧光反射光在探测器上成像，形成两种荧光标记的样品荧光光切片成像。

激光发射装置的发射的激光经耦合及准直后入射二维扫描振镜，在二维扫描振镜主要包括横向扫描头和纵向扫描头。分别对横向扫描头加载横向扫描电压信号、对纵向扫描头加载纵向扫描电压信号，使横向扫描头和纵向扫描头发生偏转改变激光光束的反射路径；横向扫描电压控制所述二维扫描阵镜使激光通过所述第一显微物镜聚焦后的聚焦光斑沿垂直于所述激光光束入射面方向扫描，纵向扫描电压控制二维扫描振镜使激光通过所述第一显微物镜之后的聚焦光斑在所述入射激光光束入射面内移动，从而实现所述聚焦激光光斑的二维扫描；横向扫描电压控制信号为锯齿波信号，纵向扫描电压控制信号为阶梯信号；纵向加载的阶梯信号的变化间隔与横向加载的锯齿波信号的周期相同；这样，当所述激光聚焦光斑横向扫描一次之后会纵向移动一小段间隔继续下一次扫描；每一次横向扫描都能够在样品中反射光形成光切片，由若干次纵向移动而形成一组样品光切片序列，完成一次完整的局部扫描；由于第二显微物镜的光轴与聚焦激光光斑的光轴垂直，故可以保证荧光生物切片完全位于第二显微物镜的物方焦面内，每一个荧光生物切片都通过所述第二显微透镜以及所述场镜组成的成像光路成像到CCD探测器上；所述样品荧光切片的长度等于所述聚焦激光光斑的横向扫描幅度，宽度等于聚焦激光在荧光生物组织中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直径，通过调整所述纵向阶梯信号的梯度电压可以控制样品上的荧光切片密度；所述纵向阶梯信号的递增梯度数量决定了一次所述局部扫描产生的样品光切片的数量。

光束照射到样品发生反射和散射，得到的反射光和散射光被第二显微物镜接收，然后经过场镜收集并聚焦到所述CCD探测器上；第二显微物镜与场镜组成的成像探测光路的光轴与准直透镜组和第一显微物镜组成的激光扫描光路的光轴垂直，并且成像探测光路的光轴处于激光扫描光路光束的入射面内；将第二显微物镜固定在压电片底座上，在压电片上施加信号电压，可以使第二显微物镜沿着光轴方向做一维的伸缩移动；CCD探测器放置在场镜的像面上，CCD探测面与光轴垂直,这样就能将通过第二显微物镜的物像成像在CCD探测器上；在第二显微物镜与所述场镜之间，根据观察样品特性，选择性放置滤光片。当样品为荧光样品时，放置滤光片，滤光片保证激发的样品荧光的反射光可以通过，消除激光反射光及散射光，保证激发荧光光切片成像。

本发明的工作原理如下：

采用功率可调的激光发生器，单模光纤，准直透镜组成的激光发射装置来作为系统的激光光源，根据待测荧光或者非荧光样品的特征来调整激光器的输出功率，激光的出射功率会影响系统成像的信噪比，并且功率太高会导致荧光样品被迅速漂白。

之后，采用二维扫描振镜，准直透镜组以及第一显微物镜组成的激光扫描光路来实现光切片扫描。准直激光光束通过二维扫描振镜反射，然后经过准直透镜组聚焦再准直为平行光后，由第一显微物镜聚焦到待测样品表面。准直透镜组包括第一透镜和第二透镜，第二透镜靠近第一显微物镜，并与第一显微物镜组成共焦4f光学系统，这样，在二维阵镜转动时，出射准直激光光束方向改变，通过准直透镜组中的第一透镜和第二透镜、与第一显微物镜之后的聚焦光斑位置会发生改变。

具体的光切片扫描实现方法为：在二维扫描振镜的横向和纵向分别加载扫描电压信号，不同的信号电压分别对于横向和纵向不同的偏转角度。横向扫描电压信号为锯齿波信号，控制激光光斑在垂直于激光光束入射到样品平台入射面的方面快速扫描，纵向扫描电压信号为阶梯信号，控制激光光斑在激光入射到样品平台的入射面内移动。阶梯信号每一个梯度的保持时间与横向锯齿信号的周期一致，并且梯度信号的变化与锯齿信号变化同步，这样保证聚焦激光光斑横向每扫描一次形成一层样品光切片之后，纵向会移动一段距离进行下一次横向扫描。每一层样品光切片的长度等于横向扫描的幅度，宽度等于激光在组织中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直径。样品纵向移动的次数与阶梯信号的阶梯数一致，这样就能通过连续扫描获得由若干层样品荧光切片组成的切片序列。定义这样的一次扫描过程为局部扫描，扫描范围为局部扫描范围。

扫描过程中要注意的是，通过第一显微物镜聚焦之后的激光光束用来对样品扫描的区域为激光光束的束腰区域。在光束束腰区域光束的发散角很小（可近似认为是平行光），能够保证聚焦后的扫描激光光束在样品中穿透一定深度之后能够仍然保持较小的光斑直径，确保每一层样品荧光切片的厚度是均匀的。

此外，扫描激光光束的入射角度与样品平台水平夹角45°，故样品光切片也与样品平台夹角为45°。第二显微物镜用来对样品光切片成像，成像探测光路光轴与样品光切片是垂直的。45°角入射样品，可保证入射的稳定性，同时本发明的成像显微系统结构对称紧凑。另外，在光切片纵向移动的同时，第二显微物镜在压电片底座的带动下沿成像扫描光路的光轴轴向跟随光切片伸缩位移，故能将样品光切片始终保持在第二显微物镜的物方焦面上，从而保证在CCD探测器上获得每一层光切片的图像信息。

受到第一显微物镜的出瞳以及第二显微物镜的伸缩范围的限制，局部扫描的区域比较小，为了能够实现宽场样品的观察，采用样品平台的移动来获得宽场样品全部的样品光切片。即在每一次局部扫描完成之后，通过主控计算机向样品台控制装置发出控制信号，来移动样品平台，使其他待观测区域移动至观察扫描区域，进行下一次局部扫描。依次依序往复移动样品台进行样品局部扫描，最终获得大范围完整的样品宽场光切片信息。

通过这种样品切片扫描的方式，由于激光扫描光路采用倾斜入射的方式，成像探测光路可以将样品垂直方向于光轴的图像转化为横向和纵向的图像，即可以得到跟横向和纵向方向接近的轴向分辨率。

非荧光样品以及双色荧光样品的显微观测原理与单色荧光样品的观察原理基本一致。区别分别为，非荧光样品是通过的为激光聚焦光斑在样品中的散射光，而不是样品受激发产生的荧光；双色荧光样品需要让不同波长的激光光束合束，然后对于双色荧光样品进行扫描。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

通过倾斜45°入射的激光光束扫描形成光切片，可以改善显微成像的轴向信噪比，有效的提高样品观察的轴向分辨率。由于数据采集卡对二维扫描振镜、压电片底座的控制信号周期相同，控制第二显微物镜与二维扫描振镜的偏转同步，保证样品被扫描激光光路的聚焦光斑的束腰照亮区域一直位于第二显微物镜的物方焦面，保证光轴轴向的高分辨率，实现轴向超分辨。

通过二维扫描振镜扫描与样品平台扫描相结合的扫描方式，可以实现快速宽场光切片扫描，缩短宽场扫描需要的时间。同时通过对探测器的快门动作频次控制和曝光时间周期，保证了光切片成像的图像信息。本发明的倾斜扫描成像显微系统，可以通过对局部扫描区域逐一有序扫描成像从而实现宽场范围内的样品三维扫描图像。且由于本发明的倾斜扫描成像显微系统的光学元部件少，易于控制，可以保证三维图像品质。可对非荧光样品、荧光样品、双色荧光样品等进行扫描成像。本发明的成像显微系统为平面光显微镜，其扫描激光激发的为薄平面，激发部分易于被成像探测光路采集到，其量子得率高，相对于共聚焦显微镜来说，本发明的成像显微系统光损伤小，成像品质更高。

附图说明

图1， 为本发明的宽场荧光切片扫描显微装置的一种实施方式的示意图。

图2， 为本发明的宽场荧光切片扫描显微装置的第二种实施方式的示意图。

图3， 为本发明的宽场荧光切片扫描显微装置的第三种实施方式的示意图。

图4， 为激光倾斜扫描切片示意图。

图5， 为本发明中计算机控制二维扫描阵镜、压电片、CCD相机的波形图以及对应的时序关系，其中，（a）控制二维扫描阵镜使入射激光光斑垂直于激光入射面扫描的横向扫描电压信号锯齿波信号波形图；（b）控制二维扫描阵镜使激光光斑在入射面内扫描的纵向扫描电压信号阶梯信号的波形图；（c）控制压电片底座使第二显微物镜沿轴向伸缩的阶梯信号的波形图；（d）控制CCD探测器自动拍摄的脉冲信号的波形图。

具体实施方式

针对本发明的成像系统及方法，分别举例并结合图示进行具体说明。

一种倾斜宽场光切片扫描成像显微系统，包括激光发射装置、二维扫描振镜、准直透镜组及第一显微物镜，第二显微物镜、场镜、探测器，样品台，数据采集卡，样品台控制装置，成像显示控制装置。准直透镜组及第一显微物镜形成的光路为激光扫描光路；第二显微物镜及场镜形成的光路为成像探测光路。下面以非荧光样品、荧光样品及双色荧光样品为例举例说明。

实施例1

以对非荧光样品进行成像为例，参看图1。

成像显示控制装置，为主控计算机16，在主控计算机中安装有控制及成像显示程序，通过主控计算机16，向数据采集卡发出控制信号指令，通过数据采集卡控制本发明成像装置中的激光强度、二维扫描振镜的偏转角度、压电片底座位移、探测器的快门控制等动作，实现二维扫描振镜、压电片底座、探测器的快门控制的同步动作。

通过主控计算机16向样品台控制装置15发出控制信号指令控制样品台三维移动动作。

激光发射装置，主要包括依次设置的激光器1，单模光纤2，准直透镜3。单模光纤2的出射端面位于准直透镜3的物方焦点处。激光器1发生激光经单模光纤2耦合后，经准直透镜3进行准直，使激光光束形成平行准直激光光束。激光器1的输出功率可调，根据样品特性进行调节。根据待测荧光样品或非荧光样品的特征来调整激光器的输出功率，激光器的输出功率会影响系统成像的信噪比，并且功率太高会导致荧光样品被迅速漂白。在本发明中，激光器的输出功率，即激光强度通过成像显示控制装置，即主控计算机向数据采集卡14发出指令，由数据采集卡向激光器发出调节信号，调节激光器的输出功率。

二维扫描振镜4，包括横向扫描头和纵向扫描头，横向扫描头为横向扫描，纵向扫描头为纵向扫描，在横向扫描头、纵向扫描头上均带有反射镜，准直激光光束入射二维扫描振镜4，通过横向扫描头上的反射镜反射至纵向扫描头，再通过纵向扫描头上的反射镜反射，从二维扫描振镜4中出射后通过准直透镜组和第一显微物镜后聚焦于样品上。二维扫描振镜4上的横向扫描头和纵向扫描头分别与数据采集卡14连接，主控计算机16向数据采集卡14发送信号指令，通过数据采集卡14向二维扫描振镜的横向扫描头和纵向扫描头分别发出横向电压控制信号和纵向电压控制信号，控制横向扫描头和纵向扫描头的偏转角度，调整从二维扫描振镜出射光束的出射角度，从而达到调整入射样品的激光光束聚焦光斑位置。横向电压控制信号为锯齿波电压信号，纵向电压控制信号为阶梯波电压信号，横向电压控制信号和纵向电压控制信号的周期相同。当激光聚焦光斑横向扫描一次之后会纵向移动一小段间隔继续下一次扫描。

准直透镜组包括第一透镜5和第二透镜6，第一透镜5的像方焦点与第二准直透镜6的物方焦点重合；第二透镜6与第一显微物镜7组成4f光学系统。经二维扫描振镜出射的激光光束经第一透镜5进行聚焦后再经第二透镜6进行准直，准直后的激光光束经过第一显微物镜入射样品。准直透镜组和第一显微物镜组成的光路为激光扫描光路，激光扫描光路入射样品的入射角度为45度。

样品台9，为三维可移动样品台。通过一样品台控制装置15与主控计算机16连接。通过主动计算机对样品台控制装置发出控制指令，样品台控制装置15可以控制样品台在水平面的x轴和y轴方向移动，也可以控制样品台的纵向方向z轴方向进行垂直移动，实现三维方向移动，以方便调整样品8的位置。

第二显微物镜10、场镜12及探测器13依次设置在成像探测光路上。第二显微物镜10安装在压电片底座11上。经过第一显微物镜入射样品8后的激光光束的反射光和散射光经过第二显微物镜及场镜后在探测器的探测面上成像。成像探测光路的光轴与激光扫描光路的光轴相垂直。第二显微物镜10沿光轴的轴向位置可通过压电片底座进行调节。通过主控计算机16控制数据采集卡向压电片底座发出调节电压信号，压电片底座沿成像探测光路的光轴轴向位置发生物理形变，从而带动第二显微物镜10沿光轴轴向位移。控制第二显微物镜的轴向位置调节的控制电压信号周期与控制二维扫描振镜的横向和纵向偏转的横向扫描电压信号和纵向扫描电压信号的周期相同，保证第二显微物镜位移与二维扫描振镜偏转同步，保证激光扫描光路的激光光束束腰位置照亮样品的照亮区域始终位于第二显微物镜的物方焦面上。激光扫描光路倾斜入射即可，仅需成像探测光路的光轴与激光扫描光路的光轴垂直。激光扫描光路倾斜45度入射样品时成像显微系统结构对称紧凑，稳定性更高。

探测器13为CCD探测器，其分别与数据采集卡14和主控计算机16连接。入射非荧光样品的激光光束经反射、散射后的出射光通过第二显微物镜后通过场镜12收集并在CCD探测器的探测面上成像，CCD探测器的快门控制信号由主控计算机发送至数据采集卡，由数据采集卡进行控制快门动作频度，保证其与二维扫描振镜的偏转保持同步，保证对每一次扫描的光切片都进行成像。CCD探测器的曝光时间周期与控制二维扫描振镜的偏转的横向或纵向扫描电压信号周期相同，保证每次光切片的曝光，保证光切片成像质量。CCD探测器上的光切片成像数据发送至主控计算机，并由主控计算机进行计算处理，形成样品扫描三维图像信息。

对于非荧光样品，本发明的成像显微系统的CCD探测器上的成像为激光光束在样品上的反射和散射光的成像。

实施例2

以单色荧光蛋白标记的单色荧光样品为例。

与实施例1对非荧光样品扫描成像显微系统不同的是：对单色荧光样品进行扫描成像时，在第二显微物镜10和场镜12之间加装有滤光片17，参看图2。滤光片17允许荧光样品上被扫描激光光束激发的荧光通过，消除扫描激光光束产生的反射光和散射光，仅使荧光样品扫描区域的被激发荧光在CCD探测器的探测面上成像。其他成像显微系统的结构与实施例1相同。对荧光样品进行激光扫描时，发射的激光波长为单色荧光样品标记的荧光蛋白对应的吸收波长，对不同样品可以选择不同的激光波长，如绿色荧光蛋白mEoc2，可以选择532纳米和561纳米的激光，对EGFP可以用波长488纳米的激光。不同荧光分子需要的吸收波长不同。

实施例3

以双色荧光蛋白标记的双色荧光样品为例。

在实施例2中对单色荧光样品的扫描成像显微系统的基础上，增加一组激光发射装置，形成两组平行设置的第一激光发射装置和第二激光发射装置，参看图3。

第一激光发射装置依次包括激光器18、单模光纤19、准直透镜20及反射镜21，所述第二激光发生装置依次包括激光器1、单模光纤2、准直透镜3及偏振分束器22；第一激光发射装置的激光器18发射的激光光束经单模光纤19耦合后经准直透镜20准直形成准直激光光束，然后经反射镜21反射至偏振分束器22，再经偏振分束器22反射后入射二维扫描振镜4，同时，第二激光发射装置的激光器1发射的激光光束经单模光纤2耦合后经准直透镜3准直形成准直激光光束后，穿过偏振分束器22入射二维扫描振镜4；第一激光发射装置和第二激光发射装置所产生的准直激光光束激光经偏振分束器后合束同时入射二维扫描振镜4，再由二维扫描振镜4反射再经准直透镜组后通过第一显微物镜入射双色荧光样品。激光器1和激光器18发射的激光波长不同，分别对应双色荧光样品中两种标记荧光蛋白的吸收波长。通过两束不同波长的激光光束激发双色荧光样品中的双色荧光，双色荧光穿过第二显微物镜、滤光片、场镜后在探测器的探测面上成像。滤光片17允许让激发的双色荧光通过，同时消除两种 波长激光光束的反射光和散射光。

上述三种实施例为本发明针对非荧光样品、单色荧光样品、双色荧光样品的举例，针对其他的样品，比如三色荧光样品，增加一组激光发射装置即可。

本发明上述三实施例的扫描成像显微系统的成像显微方法：1）首先使扫描成像显微系统处于初始位置。然后针对扫描样品的种类，由主控计算机向数据采集卡发出指令，通过数据采集卡调节激光器的输出功率至合适值。激光器发射出光束，经单模光纤耦合和准直透镜准直，得到准直激光光束；该准直激光由二维扫描振镜反射后，经过准直透镜组的第一透镜聚焦再经过第二透镜的再准直，再准直后的激光光束经过第一显微物镜，形成激光扫描光路，激光扫描光路的经过第一显微物镜的聚焦光斑入射样品台，此时，将样品台水平放置，调整激光扫描光轴的角度使其与样品平台夹角为45°。

2）将样品放置在样品台上，然后通过主控计算机向样品台控制装置输出指令，由样品台控制装置控制样品台移动，调整样品的位置。首先调整样品台垂直位置，使样品表面待测区域位于通过第一显微物镜聚焦的激光光束的焦点附近，精确调节样品在垂直方向的位置，直到通过第一显微物镜聚焦的激光光束的束腰位置对样品进行照明，然后调节控制样品台在水平面内移动将样品移动到待扫描区域的初始位置。

3）调整第二显微物镜，使由第二显微物镜和场镜组成的成像探测光路的光轴与激光扫描光路的光轴垂直，并且调整第二显微物镜的位置，使样品上被激光扫描光路照亮的区域位于第二显微物镜的物方焦面上，使其可以对样品中被激光光束激发出的荧光图像成像（荧光样品时，增加有滤光片）或对样品中对激光光束的反射光或散射光图像成像（非荧光样品时，不加装滤光片）。第二显微物镜位置调节基于其放置在压电片底座上，压电片底座在电压控制信号作用下可沿光轴方向发生物理形变，从而带动第二显微物镜发生位移，实现调节第二显微物镜的物方焦面的位置。使用场镜来收集通过第二显微物镜的光线并将其成像到CCD探测器上，CCD探测器探测面与成像探测光路的光轴垂直。

4）在正式扫描前，需要对于光切片成像显微系统进行标定。标定输入二维扫描振镜的横向锯齿波扫描电压信号的幅值对应激光聚焦光斑在样品上的扫描幅度，标定纵向阶梯波扫描电压信号的递增梯度对应的激光聚焦光斑在样品上的纵向移动间隔。测试并且确认在选用的第一显微物镜的出瞳限制下，横向和纵向扫描的最大范围，校准输入压电片底座的阶梯波电压信号，确保第二显微物镜的移动能够与荧光切片的纵向移动相互匹配，确保样品荧光切片始终能够通过第二显微物镜清晰成像。

5）确定每一次通过二维扫描振镜的偏转而实现的激光聚焦光斑二维扫描的横向和纵向范围，并将其定义为局部扫描范围。然后，将样品上待测宽场区域划分为若干个局部扫描区域，在主控计算机上设定对样品台控制器发送的样品台移动指令，以便在正式扫描时控制样品台依次依序按照划分的局部扫描区域移动。

6）调节设定完毕后，开始进行样品扫描。主控计算机通过数据采集卡向二维扫描振镜的横向扫描头和纵向扫描头分别输入锯齿波扫描电压信号和阶梯波扫描电压信号，横向锯齿波扫描信号通过控制二维扫描振镜横向偏转来控制激光扫描光路的聚焦光斑在垂直于激光扫描光路入射面的方向扫描，纵向阶梯波扫描电压信号控制二维扫描振镜纵向偏转来控制激光扫描光路的聚焦光斑在激光扫描光路的入射面内移动，纵向阶梯波扫描电压信号的递增梯度间隔与横向锯齿波扫描电压信号的周期相等，且两者变化同步，如此，二维扫描振镜的横向和纵向的合成扫描可以控制扫描激光光束聚焦光斑在完成每次横向扫描之后纵向移动一段间隔经行下一次扫描，每次横向扫描都形成一层光切片，故光切片经过若干次纵向移动会形成一组荧光切片序列，每一层荧光切片与样品平台夹角为45°，参见图4，展示了光切片序列的示意图，样品光切片的长度取决于二维扫描振镜横向锯齿波扫描电压信号的幅度，宽度取决于扫描激光光束聚焦光斑在样品中的穿透深度，厚度等于扫描激光光束聚焦光斑的直径，每两层光切片之间的间隔取决于纵向阶梯波扫描电压信号的递增梯度。同时，数据采集卡向压电片底座输出阶梯波电压控制信号，控制压电片底座带动第二显微物镜沿轴向跟随光切片移动，保证每一层光切片都正好在第二显微物镜的物方焦面上。同时，光切片每移动一次，数据采集卡发送一次脉冲信号给CCD探测器，控制CCD探测器的快门打开一次，CCD探测器的曝光时间设置为每一次二维扫描振镜的横向锯齿波扫描电压信号的周期，从而记录下每一层光切片的图像信息。图5为通过数据采集卡输出的控制二维扫描振镜的横向和纵向扫描电压信号、控制压电片底座的控制电压信号及控制探测器曝光时间的电压信号的时序关系示意图。当样品上一个局部扫描区域扫描完毕以后将样品移动到另一个局部扫描区域中，主控计算机控制成像显微系统复归初始状态，同时重复6）中的扫描过程分别对划分的每一个局部扫描区域进行扫描，每一个局部扫描区域都会形成一组光切片序列。使用CCD探测器对每个扫描区域的光切片序列进行图像信息采集。

7）CCD探测器将获得的图像信息即时传输回主控计算机进行数据处理。首先，将每个局部扫描区域的样品光切片还原为样品的三维图像，然后将不同局部扫描区域之间的处理结果进行拼接还原出宽场范围的样品三维图像信息。

本发明由于数据采集卡对二维扫描振镜、压电片底座的控制信号周期相同，控制第二显微物镜与二维扫描振镜的偏转同步，保证样品被扫描激光光路的聚焦光斑的束腰照亮区域一直位于第二显微物镜的物方焦面，保证光轴轴向的高分辨率。同时通过对探测器的 快门动作频次控制和曝光时间周期，保证了光切片成像的图像信息。本发明的倾斜扫描成像显微系统，可以通过对局部扫描区域逐一有序扫描成像从而实现宽场范围内的样品三维扫描图像。且由于本发明的倾斜扫描成像显微系统的光学元部件少，易于控制，可以保证三维图像品质。可对非荧光样品、荧光样品、双色荧光样品等进行扫描成像。