一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底及其制备方法

摘要

一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底及其制备方法，本发明涉及一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底及其制备方法。本发明是要解决现有的线虫毒理试验培养基底计数不准确、死亡判断误差大、观测时间长、行为观测不精准的问题。秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底按质量百分比由MgSO

说明书

技术领域

本发明涉及一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底及其制备方法。

背景技术

秀丽线虫Caenorhabditiselegans属于线形动物门（Nematoda），能够较灵敏地感受周围 环境变化，其生活史周期短，可在短时间内对环境变化产生指示作用，因为容易培养、保 存的特点被广泛用作模式生物，在毒理学等实验科学中进行环境科学、生命科学等领域的 行为观测研究，并被用作生态环境健康评价的敏感性指示生物。

进行毒理学试验行为观测的秀丽线虫载体一般是琼脂培养基或者是受试液体。秀丽线 虫身体透明，体长一般在1mm左右，在显微镜下可见。经典毒理学指标包括死亡率、行为 变化等，这些指标都要求对试验线虫进行死亡判定、计数以及行为观测等。其中线虫死亡 的判定，需要借助工具，若碰触无反应则界定为死亡，奄奄一息的线虫往往对这种碰触无 反应，使得死亡虫数虚高；而碰触后的虫体受损，无法进行后继的生理生化分析。

在传统的培养基中，线虫与琼脂、水液等培养基质颜色相近，不利计数和观测；秀丽 线虫常常会有钻入琼脂胶中的情况，出现丢虫现象，这增加了计数和行为判断的难度；显 微镜下观测水液中线虫往往有波动水纹，出现漏查，这会影响对线虫计数的准确，特别是 虫体随水晃动，而无法判断线虫是否死亡。一般对毒理试验中常用的一个胁迫下10条虫子 的死亡鉴定，至少需要5min，虫子由于钻入琼脂胶中无法发现，使得总数往往低于10条。 而对其进行行为测量，更是可能高达0.5h。因此传统培养基使得毒理试验中秀丽线虫观测 费力误时，效率极低，也使得试验结果的准确度和精确度有所下降。

发明内容

本发明是要解决现有的线虫毒理试验培养基底计数不准确、死亡判断误差大、观测时 间长、行为观测不精准的问题，而提供一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底及其制备 方法。

本发明的一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底按质量百分比由15%～25%的 MgSO₄、15%～25%的CaCl₂、3%～15%的琼脂糖、1%～3%的KCl、1%～2%的阿尔玛蓝和 30%～65%的蒸馏水组成；所述的MgSO₄和CaCl₂的质量比为1:1。

上述的一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底的制备方法是按以下步骤进行的：

一、按质量百分比称取15%～25%的MgSO₄、15%～25%的CaCl₂、3%～15%的琼脂糖、 1%～3%的KCl、1%～2%的阿尔玛蓝和30%～65%的蒸馏水；

二、将步骤一称取的琼脂糖和KCl放入到步骤一称取的蒸馏水中，搅拌均匀，加热至 沸腾后冷却到40℃～45℃，得到混合溶液A；

三、向步骤二得到的混合溶液A中加入步骤一称取的MgSO₄、CaCl₂和阿尔玛蓝，搅 拌溶解后用浓度为5mol/L的KOH溶液将pH值调整至6.8～7.2，得到混合溶液B；

四、将步骤三得到的混合溶液B倒入24孔细胞培养板中，液面高度为0.1cm～0.2cm；

五、将装有混合溶液B的24孔细胞培养板在室温下置于水平台上至其凝固，即得到秀 丽线虫胁迫响应行为观测平台基底；

本发明优点：1、本发明的观测平台具有由阿尔玛蓝显色的蓝黑色培养基底，与现有的 琼脂、水液等与线虫体色近似的培养基底相比，线虫显而易见，观测更为方便。

2、本发明使得活线虫在硬度较高的基底上表现为垂直站立和剧烈摆尾行为，而死亡线 虫无站立和摆动，这使得对线虫计数和死亡判定直观可见，不会出现丢虫、漏虫现象，观 测时间缩短为1min以内，效率明显提高，试验结果的准确度和精确度也获得提升；由于对 虫体无触碰伤损，便可对线虫进行进一步的生理生化分析，使得利用秀丽线虫进行快速的 生物监测加以评价生态风险和环境健康成为可能。

3、本发明与琼脂、水液培养基相比，使用本发明的线虫胁迫响应行为观测平台进行急 性毒理胁迫响应试验，线虫的存活和行为等没有差异，即本发明的观测平台基底没有对线 虫的存活和行为产生影响。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底按质量百分 比由15%～25%的MgSO₄、15%～25%的CaCl₂、3%～15%的琼脂糖、1%～3%的KCl、1%～2% 的阿尔玛蓝和30%～65%的蒸馏水组成；所述的MgSO₄和CaCl₂的质量比为1:1。

本实施方式的观测平台具有由阿尔玛蓝显色的蓝黑色培养基底，与现有的琼脂、水液 等与线虫体色近似的培养基底相比，线虫显而易见，观测更为方便。

本实施方式使得活线虫在硬度较高的基底上表现为垂直站立和剧烈摆尾行为，而死亡 线虫无站立和摆动，这使得对线虫计数和死亡判定直观可见，不会出现丢虫、漏虫现象， 观测时间缩短为1min以内，效率明显提高，试验结果的准确度和精确度也获得提升；由于 对虫体无触碰伤损，便可对线虫进行进一步的生理生化分析，使得利用秀丽线虫进行快速 的生物监测加以评价生态风险和环境健康成为可能。

本实施方式与琼脂、水液培养基相比，使用本发明的线虫胁迫响应行为观测平台进行 急性毒理胁迫响应试验，线虫的存活和行为等没有差异，即本实施方式的观测平台基底没 有对线虫的存活和行为产生影响。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：按质量百分比由18%～22% 的MgSO₄、18%～22%的CaCl₂、5%～10%的琼脂糖、1.5%～2.5%的KCl、1%～2%的阿尔玛 蓝和30%～65%的蒸馏水组成。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：按质量百分比由16% 的MgSO₄、16%的CaCl₂、6%的琼脂糖、2%的KCl、1%的阿尔玛蓝和59%的蒸馏水组成。 其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是：按质量百分比由22% 的MgSO₄、22%的CaCl₂、11%的琼脂糖、2.5%的KCl、1.5%的阿尔玛蓝和41%的蒸馏水组 成。其他与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：按质量百分比由 25%的MgSO₄、25%的CaCl₂、14%的琼脂糖、3%的KCl、2%的阿尔玛蓝和31%的蒸馏水 组成。其他与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式的一种秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底的制备方法 是按以下步骤进行的：

一、按质量百分比称取15%～25%的MgSO₄、15%～25%的CaCl₂、3%～15%的琼脂糖、 1%～3%的KCl、1%～2%的阿尔玛蓝和30%～65%的蒸馏水；

二、将步骤一称取的琼脂糖和KCl放入到步骤一称取的蒸馏水中，搅拌均匀，加热至 沸腾后冷却到40℃～45℃，得到混合溶液A；

三、向步骤二得到的混合溶液A中加入步骤一称取的MgSO₄、CaCl₂和阿尔玛蓝，搅 拌溶解后用浓度为5mol/L的KOH溶液将pH值调整至6.8～7.2，得到混合溶液B；

四、将步骤三得到的混合溶液B倒入24孔细胞培养板中，液面高度为0.1cm～0.2cm；

五、将装有混合溶液B的24孔细胞培养板在室温下置于水平台上至其凝固，即得到秀 丽线虫胁迫响应行为观测平台基底。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二加热至沸 腾后冷却到42℃。其他与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三搅拌溶解 后用浓度为5mol/L的KOH溶液将pH值调整至7.0。其他与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四所述24孔 细胞培养板的孔直径为11.0mm，孔高度为0.5cm。其他与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四液面高度 为0.15cm。其他与具体实施方式一至九之一相同。

采用下述试验验证本发明效果：

试验一：一、按质量百分比称取25g的MgSO₄、25g的CaCl₂、15g的琼脂糖、3g的 KCl、2g的阿尔玛蓝和30g的蒸馏水；

二、将步骤一称取的琼脂糖和KCl放入到步骤一称取的蒸馏水中，搅拌均匀，加热至 沸腾后冷却到45℃，得到混合溶液A；

三、向步骤二得到的混合溶液A中加入步骤一称取的MgSO₄、CaCl₂和阿尔玛蓝，搅 拌溶解后用浓度为5mol/L的KOH溶液将pH值调整至7.0，得到混合溶液B；

四、将步骤三得到的混合溶液B倒入24孔细胞培养板中，液面高度为0.15cm；

五、将装有混合溶液B的24孔细胞培养板在室温下置于水平台上至其凝固，即得到秀 丽线虫胁迫响应行为观测平台基底。

利用本发明的秀丽线虫胁迫响应行为观测平台基底进行秀丽线虫急性毒理试验，由于 线虫体色与培养基黑色基底对比明显，且活线虫表现为竖直站立和摆动，使得死亡线虫的 判定变的直观而简单，计数效率明显提高。观测时间缩短为30～50s，无丢虫、漏虫现象， 提高了验结果的准确度和精确度。