一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒的组成及其应用，属于生物医药技术领域。一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，其特征在于，包括用于采用检测CD137L蛋白表达水平的一对抗体组合。该试剂盒能够对肿瘤患者的肿瘤组织样品进行检测，通过与标准图谱对照，从而明确CD137L突变的类型和突变的机制，能够用于指导相关疾病的治疗和预后判断及疾病进展监测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒的组成及其 应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肿瘤标志物在临床已广泛应用。其意义主要包括筛查健康或高危人群、病 理分型分级诊断、预后判断、治疗反应与监测、检测肿瘤复发转移。目前主要 是针对消化系统肿瘤和生殖系统肿瘤的肿瘤标志物应用较广泛，如AFP、CEA、 CA125等。

血液肿瘤的诊治还缺乏特异性的标志物，将协同刺激分子的表达形式和水 平引入肿瘤标志物的研究，具有理论创新特点和较大的现实意义，该研究将为 血液肿瘤的早期诊治提供理论依据。同时还为靶向治疗药物的生物标志物研究 和筛选提供重要参考。

肿瘤的发生是因它能逃脱免疫监视。肿瘤细胞可通过多种方式逃脱免疫， 其中包括缺乏协同刺激分子的表达。人CD137L（又称CD137L）是通过存在于 细胞膜表面的Ⅱ型膜蛋白传导信号来发挥协同刺激作用，动物试验显示增强了 T细胞介导的抗肿瘤免疫性。sCD137L(soluble CD137ligand)是CD137L的 可溶性形式，SaLih等在健康志愿者和患有恶性血液病的患者抽取血清样品显 示：急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）、骨髓增生异常 综合症（myelodysplastic syndrome,MDS）和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’ slymphoma,NHL)患者血清sCD137L水平明显提高。初步证明，在AML和MDS， 血清sCD137L水平高的患者，预后较差。CD137L存在2种新的剪接方式，这 产生了新的sCD137L。这2种突变在不同AML患者亚型中分布显著不同，尤其 是缺失129个核苷酸突变型与疾病进展密切相关。

尽管在实验中发现了很多关于CD137L表达水平与相关疾病进展的关系， 并且干预CD137L的表达对相关疾病的治疗也具有重要的临床意义，但是还没 有专门检测CD137L突变体蛋白表达水平的试剂盒的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，该试 剂盒能够对肿瘤患者的肿瘤组织样品进行检测，通过与标准图谱对照，从而明 确CD137L突变的类型和突变的机制，能够用于指导相关疾病的治疗和预后判 断及疾病进展监测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，特殊之处在于其主要 包括一对抗体、免疫组化检测试剂以及标准对照图谱；其中所述的一对抗体包 括用于检测CD137L N端50-80个氨基酸的抗体和用于检测CD137L C端30-50 个氨基酸的抗体。

上述用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，具体由以下试剂组成， 来源如下，-20℃保存：

组分 来源 CD137L C端的抗体（sc-11817） SANTA CRUZ CD137L N端的抗体（2305-1） Abcam HRP标记的羊抗兔抗体 中杉金桥 DAB显色试剂 中杉金桥 封闭液 自制 显色反应终止试剂 自制 PBST洗脱液（10×） 自制 抗体稀释液 自制 标准免疫组化图谱 依据Hercep Test^TM

上述的试剂组成中，所述的一对抗体分别采购自SANTA CRUZ公司和Abcam 公司，所述的HRP标记的羊抗兔抗体和DAB显色试剂采购自中杉金桥公司，所 述的封闭液、显色反应终止试剂、PBST洗脱液（10×）、抗体稀释液可以自制 或者采用行业中常规通用的试剂，所述标准免疫组化图谱是依据Hercep Test^TM而得。（注：上述试剂来源并不局限于这些公司）

本发明一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，提供的一对引 物组合用于检测CD137L蛋白表达水平，通过辅助计算机照片分析以及与标准 图谱对照，来确定剪接突变发生的类型和机制，指导恶性血液病及与CD137L 表达变化相关治病的临床治疗。

附图说明

图1不同浓度的美罗华对Raji、Raji/C和Raji/CD137L细胞的增殖的影 响；

图2Raji、Raji/C和Raji/CD137L细胞对淋巴细胞的增殖的影响；

图3Raji、Raji/C和Raji/CD137L细胞对淋巴细胞IL-2释放的影响；

图4标准免疫组化图谱。

本发明提供一种用于检测恶性血液疾病CD137L突变的试剂盒，该试剂 盒能够对肿瘤患者的肿瘤组织样品进行检测，通过与标准图谱对照，从而明 确CD137L突变的类型和突变的机制，能够用于指导相关疾病的治疗和预后 判断及疾病进展监测。

本发明中的抗体组合N端抗体为能检测CD137LN端68个氨基酸的抗体； C端抗体为能检测CD137LC端42个氨基酸的抗体.

在一些实施例中揭示了蛋白水平的判断标准和方法，当发明中所采用的 计算软件参数设计发生变化时，所获得的累积光密度值（integrated optical  density,IOD）会发生变化，会影响到结果的判断。检测过程中要严格按照标 准图谱（图4）要求进行标准色彩取值，以免发生偏差。可以使用非试剂盒推 荐的图像处理软件进行计算IOD值，但是标准色彩取值应当一致。

在一些实施例中发现，转染CD137L对疾病的治疗具有协同作用，说明 CD137L的缺失与疾病的进展密切相关，是相关疾病治疗的重要靶点。对于产 生机制的进一步检测，能够指导临床化疗方案的实施。对于直接表达出来转 运到细胞外的sCD137L患者，可以补充协同刺激信号，提高治疗效果；对于 由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）切割产生的sCD137L 患者，要采取抑制MMP的活性的个体化治疗方案。

本发明试剂盒具体由以下试剂组成，来源如下，-20℃保存。

组分 来源 CD137L C端的抗体（sc-11817） SANTA CRUZ CD137L N端的抗体（2305-1） Abcam HRP标记的羊抗兔抗体 中杉金桥 DAB显色试剂 中杉金桥 封闭液 自制 显色反应终止试剂 自制 PBST洗脱液（10×） 自制 抗体稀释液 自制 标准免疫组化图谱 依据Hercep Test^TM

在另外的实施例中，发现在其他非血液系统疾病中，也发现CD137L发 生相似的基因突变，如咽喉部的肿瘤。在实际应用中仍然具有重要的临床意 义。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制 在所描述的实施例范围中。

实施例1、转染细胞对美罗华敏感性的变化

美罗华是全球第一个被批准用于临床治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）的单克 隆抗体，美罗华对Raji细胞的生长具有抑制作用，且具有浓度依赖性和时间 依赖性。本研究表明美罗华对Raji和Raji/C的抑制作用无明显区别（图1）， 而对于转染CD137L的Raji/CD137L细胞能够产生更强的抑制作用，对美罗 华敏感性增高，在浓度＞2.5mg/mL，增殖率率显著低于Raji和Raji/C。

实施例2、转染细胞对外周血淋巴细胞活性的影响

为了检测转染CD137L细胞对外周血淋巴细胞增殖的影响，采用不同效/ 靶比的淋巴细胞与Raji、Raji/C和Raji/CD137L细胞混合培养，采用CCK-8 细胞增殖检测试剂盒进行测定各组细胞活性（图2），表明转染人CD137L的 Raji细胞能显著促进淋巴细胞的增殖，并且随着效/靶比的增加，促进增殖活 性越强（P＜0.01）。

实施例3、转染细胞对因子释放的影响

IL-2是重要的效应细胞因子，它能活化其它T淋巴细胞和B淋巴细胞， 并且刺激NK细胞增殖，具有抗肿瘤的作用。本研究发现转染Raji/CD137L 能显著促进外周血淋巴细胞释放IL-2（P＜0.01），且随着效/靶比的增加，效 应增强（图3）。

实施例4、CD137L在淋巴瘤组织中的表达情况

采用N端抗体检测的是总CD137L的表达水平，而C端抗体主要检测膜 结合型CD137L的表达水平，故总体IOD值N端测定组大于C端测定组。结 果表明，CD137L表达水平与年龄、性别及病理类型等无显著相关性，只是 HD患者N端CD137L表达水平较NHL患者略高（表1）。另外，对同一组织， 采用两种不同抗体分别测定的CD137L的IOD值，发现两者的IOD值并无显 著相关性（P>0.05）。这说明不同的患者CD137L转变为sCD137L的比率是随 机的。

表1组织芯片分析CD137L抗原在淋巴瘤组织中表达情况

实施例5、CD137L在咽喉癌及癌旁正常组织的表达与病理因素之间的关 系

我们并不是对阳性率进行了简单统计。另外，采用Image-Pro Plus6.0图 像分析软件批处理程序计算各组织点的IOD值。然后对IOD值作为计量资料 进行统计学分析。统计结果表明，其表达情况与年龄、性别及肿瘤生长部位 无显著相关性，与病理类型和肿瘤分级有一定相关性。同时，我们也比较两 种不同抗体测定CD137L表达情况，结果发现两者并无显著相关性（P>0.05）。 这说明在不同的咽喉癌患者，CD137L发生剪接突变的比率是随机的，这与 CD137L在其他疾病表达的研究结果相符（表2）。

表2组织芯片分析CD137L抗原在咽喉癌及癌旁正常组织的表达