特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子

摘要

本发明公开了特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子，属于生物分析和基因工程领域。本发明的筛选方法基于cell-SELEX技术，采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；在反筛过程中不断增加反筛细胞的量、洗脱时间及洗脱液的体积；同时，逐渐缩短靶细胞的孵育时间，适当延长反筛细胞的孵育时间；通过数轮的筛选，得到与胃癌细胞特异性结合且结合力高的序列，即得到特异性靶向胃癌细胞的适配子。这些适配子的序列如SEQIDNO.1-6所示，具有良好的结合力与特异性，能特异性的结合并靶向胃癌细胞，可用于胃癌的诊断及制备胃癌诊断药物。

说明书

 

技术领域

本发明属于生物分析和基因工程领域，具体涉及特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子。

背景技术

核酸适配子是采用指数富集配体的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。细胞SELEX（cell-SELEX）是以完整的细胞为研究对象，从人工合成的寡核苷酸库中筛选出的能与靶细胞高特异性、高亲和力结合的核苷酸序列。

cell-SELEX在靶标筛选优于传统的SELEX技术，它能更好地保持细胞表面靶分子的完整性与生物活性，而且更有利于进行临床样本的分析与检测。

胃癌是世界上发病率比较高的恶性肿瘤之一，而在临床上能够诊断出来的胃癌大多数已处于中晚期阶段，缺少合适且有效的治疗手段，所以找到胃癌细胞上的某些肿瘤标志物（也可能是治病基因）对胃癌的早期诊断及设计合理有效地治疗方法有着极其重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选方法；该方法基于cell-SELEX技术，针对胃癌细胞，用体外合成的DNA 文库筛选出能够特异性识别胃癌细胞的适配子序列。

本发明的另一目的在于提供通过上述筛选方法得到的特异性靶向胃癌细胞的适配子。

本发明的再一目的在于提供上述特异性靶向胃癌细胞的适配子的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选方法，基于cell-SELEX技术，包括如下步骤：采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；在反筛过程中不断增加反筛细胞的量、洗脱时间及洗脱液的体积；同时，逐渐缩短靶细胞的孵育时间，适当延长反筛细胞的孵育时间；通过数轮的筛选，得到与胃癌细胞特异性结合且结合力高的序列，即得到特异性靶向胃癌细胞的适配子。所述的洗脱液优选为杜氏磷酸缓冲液。

优选的，所述的特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选方法，包括如下步骤：采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；起始加入的DNA文库的量为5～10nmol，起始靶细胞的量为2～3×10⁶个细胞；从第3轮筛选时加入2～3×10⁶个反筛细胞，在接下来每增加一轮筛选，细胞数增加一个数量级，且洗脱时间从开始的1min增加到5min，洗脱液的体积从开始的500μL增加到3mL；同时，靶细胞的孵育时间从60min缩短到30min，反筛细胞的孵育时间从30min增加到45min；一共进行10轮的筛选。

更优选的，所述的特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选方法，包括如下步骤：

采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；

（1）第一轮筛选：将7～10nmol DNA文库变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min，500μL洗涤液洗涤细胞后收集结合的DNA作为下一轮筛选的亚文库；

（2）在第二、第三轮筛选：将前一轮筛选的亚文库变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min，500μL洗涤液洗涤细胞后收集结合的DNA作为下一轮筛选的亚文库；

（3）第四轮筛选：将第三轮筛选的亚文库变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min后，500μL洗涤液洗涤细胞后收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL洗涤液洗涤细胞1次，1min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（4）第五轮筛选：取（3）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育45min后，收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL洗涤液洗涤细胞2次，2min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（5）第六轮筛选：取（4）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育45min后，收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL洗涤液洗涤细胞2次，2min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（6）第七轮筛选：取（5）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁷个反筛细胞在37℃孵育45min，2000μL洗涤液洗涤细胞3次，3min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（7）第八轮筛选：取（6）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁷个反筛细胞在37℃孵育45min，2000μL洗涤液洗涤细胞3次，3min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（8）第九轮筛选：取（7）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁸个反筛细胞在37℃孵育45min，3000μL洗涤液洗涤细胞3次，5min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR；

（9）第十轮筛选：取（8）PCR产物7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁸个反筛细胞在37℃孵育45min，3000μL洗涤液洗涤细胞3次，5min/次，收集未结合的DNA，进行不对称PCR。

所述的DNA文库优选为随机单链DNA文库：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N₄₀-AGT

ATGAGCGAGCGTTGCG-3’。

所述的洗涤液优选为杜氏磷酸缓冲液。

所述的不对称PCR的引物优选为：上游引物B1：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’，下游引物B2：5’-CGCAACGCTCGCTCTCA-3’；不对称PCR的条件优选为：上、下游引物比例为50:1，95℃预变性5 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，28个循环，最后72℃延伸7 min。

特异性靶向胃癌细胞的适配子，通过上述筛选方法得到。

所述的特异性靶向胃癌细胞的适配子优选包括S1a、S1b、S1F、S2a、S3F和S4a，其核苷酸序列如下所示：

S1a：5’-TCTGGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGGAGT-3’；

S1b：5’-ACTCTGGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGGAGTATG

-3’；

S1F：5’-GGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGG-3’；

S2a：5’-GGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGT-3’；

S3F：5’-CCCTTGTTGATGGACAACTCCCTTCCTCTCCACTTCGTGGAGT-3’；

S4a：5’-GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT-3’。

更优选的，所述的特异性靶向胃癌细胞的适配子为S1a和S4a。

上述特异性靶向胃癌细胞的适配子在制备胃癌诊断药物中的应用。

一种胃癌诊断药物，包含上述适配子。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明所筛选的适配子对靶细胞——胃癌细胞具有很高的特异性和选择性，对非靶细胞基本无识别作用。从共聚焦图片和流式细胞术实验中可以看出本发明的适配子可以很好地区分靶细胞和反筛细胞。

本发明在适配子的反筛过程中不断增加反筛细胞的量、洗脱时间及洗脱液的体积，保证了筛选得到的适配子序列的特异性以及高亲和力。

本发明用流式细胞术、共聚焦显微镜等检测手段证明了所筛选得到的适配子具有良好的结合力与特异性。

本发明的适配子能特异性的结合并靶向胃癌细胞，可用于胃癌的诊断。

附图说明

图1是对文库的富集进行检测的流式细胞图，A和B分别是SGC7901细胞和GES-1细胞富集的文库；图中纵坐标和横坐标分别为细胞数和荧光强度。

图2是文库的富集的共聚焦显微图，A：SGC7901细胞+未筛选的文库，B：GES-1细胞+未筛选的文库，C：SGC7901细胞+第八轮的库，D：GES-1细胞+第八轮的库；A、B、C、D各图左边是荧光场（488nm激发）下的图片，右边是明场的图片。

图3是筛选得到适配子的结合力的流式细胞仪分析图。

图4是筛选得到适配子的特异性的共聚焦显微图，A：SGC7901细胞+FITC-S1a，B：GES-1细胞+FITC-S1a，C：SGC7901细胞l+FITC-S4a，D：GES-1细胞+FITC-S4a；A、B、C、D各图左边是荧光场（488nm激发）下的图片，右边是明场的图片。

具体实施方式

将DNA文库与一定量的靶细胞在一定的温度下孵育一段时间后，洗脱结合的库，再与一定的反筛细胞结合，收集未结合的DNA文库，通过PCR扩增作为下一轮筛选的亚文库。如此反复进行8～10轮的筛选，将得到每轮的DNA文库分别用流式细胞仪和共聚焦显微镜证明文库的富集。对结合力比较高的库进行克隆、测序，测定各条序列与胃癌细胞的结合力与特异性，最终得到数条结合力比较好的序列。

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1  基于cell-SELEX技术筛选特异性靶向人胃癌细胞的适配子

筛选所用的靶细胞和反筛细胞分别为人胃癌细胞SGC7901和人胃黏膜细胞GES-1细胞；所用的DNA文库为随机单链DNA文库：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N₄₀-AGTATGAG

CGAGCGTTGCG-3’；不对称PCR上游引物B1：5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’，下游引物B2：5’-CGCAACGCTCGCTCTCA-3’，由上海赛百盛公司合成。

具体过程如下：

（1）在第一轮时筛选时，将靶细胞用细胞刮刀刮下后用杜氏磷酸缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀；将7～10nmol人工合成的DNA文库溶于结合缓冲液（杜氏磷酸缓冲液中含有5mM的氯化镁、4.5g/L葡萄糖），95℃变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min；500μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞后95℃加热、离心收集结合的DNA作为下一轮筛选的亚文库。

（2）在第二、第三轮筛选时都是将前一轮洗脱结合的DNA 为文库，变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min，500μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞后离心收集结合的DNA作为下一轮筛选的亚文库。

（3）第四轮筛选的文库为第三轮洗脱的亚文库，变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育60min后，500μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞后离心收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞1次，1min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件：上、下游引物比例为50:1，95℃预变性5 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，28个循环，最后72℃延伸7 min），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（4）第五轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育45min后，收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞2次，2min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（5）第六轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育45min后，离心收集结合的DNA，变性处理后与2～3×10⁶个反筛细胞在37℃孵育30min，1000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞2次，2min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（6）第七轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，离心收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁷个反筛细胞在37℃孵育45min，2000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞3次，3min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（7）第八轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，离心收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁷个反筛细胞在37℃孵育45min，2000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞3次，3min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（8）第九轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，离心收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁸个反筛细胞在37℃孵育45min，3000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞3次，5min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（9）第十轮筛选，取上述定量的DNA 7～10nmol变性处理后与2～3×10⁶个靶细胞在37℃孵育30min后，离心收集结合的DNA，变性处理后与1～2×10⁸个反筛细胞在37℃孵育45min，3000μL杜氏磷酸缓冲液洗涤细胞3次，5min/次，离心收集未结合的DNA为模板，进行不对称PCR扩增（条件同（3）），12%变性PAGE电泳，割胶回收目的条带，紫外定量。

（10）将得到每轮的DNA文库分别用流式细胞仪和共聚焦显微镜证明文库的富集，结果如图1和图2所示。由图1可以看出，对于SGC7901细胞来说，在一定的细胞数量下，随着筛选轮数的增加，细胞上的平均荧光强度也随之增加；而对于GES-1细胞来说，细胞上的平均荧光强度并不随筛选轮数的增加有所增加。表明筛选的DNA 文库在靶细胞（SGC7901 细胞）上得到了一定程度的富集，初始DNA文库在第八轮得到了最大程度的富集。由图2可以看出，对于SGC7901细胞来说，相对于未筛选的文库，第八轮的库与细胞有很强的结合（细胞膜上有很明显的荧光）；而对于GES-1 细胞 来说，无论是未筛选的DNA文库还是富集之后的第八轮的库都没有明显地与其结合，所以在荧光场中我们基本看不到荧光。表明筛选的第八轮DNA 文库在靶细胞（SGC7901细胞）上得到了最大程度的富集。

（11）将第八轮的文库扩增成dsDNA，然后用T-A克隆试剂盒将其插入pUC-T质粒上，然后转入E. coli中，挑取单克隆，提取质粒，送公司测序，通过比对，得到一系列序列，再用DNAMAN软件预测各适配子的二级结构，通过用流式细胞术测定各条序列与靶细胞的结合力，最终得到如下结合力高的序列： 

S1a:5’-TCTGGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGGAGT-3’；

S1b: 5’-ACTCTGGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGGAGTATG-3’；

S1F: 5’-GGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGG-3’；

S2a: 5’-GGACGCTCTGTAGTGTGTTGACCAGTCCCTCCCGTGCTGT-3’；

S3F: 5’-CCCTTGTTGATGGACAACTCCCTTCCTCTCCACTTCGTGGAGT-3’；

S4a: 5’-GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT-3’。

（12）取3×10⁵个靶细胞分别与不同浓度（0nM、25nM、50nM、100nM、120nM、150nM、200nM、250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM）的适配子S1a和S4a孵育20min，洗涤后进行流式细胞术实验，结果如图3所示，随着适配子浓度的增加，其对靶细胞的结合力就越强，最终结合趋于饱和。当适配子与细胞结合率达到50%时，此时所需的适配子的浓度就是其平衡解离常数Kd，由此我们可以得到适配子S1a和S4a各自与细胞的结合力常数分别为141.1nM 和55.33nM。

（13）将200nM的FITC标记的适配子S1a、S4a分别与3×10⁵个靶细胞或3×10⁵个反筛细胞结合20min，洗涤，4%的多聚甲醛固定后进行共聚焦显微镜实验，结果如图4所示，对于SGC7901细胞来说，适配子S1a 和S4a均能很好的与其结合，且在细胞膜上可以看到很明显的荧光，而对于GES-1细胞来说，适配子S1a 和S4a均没有明显地与其结合，所以在荧光场中我们基本看不到荧光。

通过上述实验得出以下结论：本发明的适配子序列均能很好的与靶细胞结合，而且靶向性也很好，为以后这些适配子用于临床诊断以及分子影像提供了可能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子

 

<130>  1

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  78

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  随机单链DNA文库

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (20)..(59)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  1

accgaccgtg ctggactctn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna       60

 

gtatgagcga gcgttgcg                                                     78

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  不对称PCR上游引物B1

 

<400>  2

accgaccgtg ctggactct                                                    19

 

 

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  不对称PCR下游引物B2

 

<400>  3

cgcaacgctc gctctca                                                      17

 

 

<210>  4

<211>  46

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S1a

 

<400>  4

tctggacgct ctgtagtgtg ttgaccagtc cctcccgtgc tggagt                      46

 

 

<210>  5

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S1b

 

<400>  5

actctggacg ctctgtagtg tgttgaccag tccctcccgt gctggagtat g                51

 

 

<210>  6

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S1F

 

<400>  6

ggacgctctg tagtgtgttg accagtccct cccgtgctgg                             40

 

 

<210>  7

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S2a

 

<400>  7

ggacgctctg tagtgtgttg accagtccct cccgtgctgt                             40

 

 

<210>  8

<211>  43

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S3F

 

<400>  8

cccttgttga tggacaactc ccttcctctc cacttcgtgg agt                         43

 

 

<210>  9

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  适配子S4a

 

<400>  9

gatctctctc tgccctaagt ccgcacccgt gcttccctgt                             40