一株巨大芽孢杆菌Z2013513及其生产苯基乳酸的方法

摘要

本发明涉及一株巨大芽孢杆菌Z2013513（BacillusmegateriumZ2013513），保藏编号为CCTCCNO：M2013244；本发明还涉及利用巨大芽孢杆菌Z2013513以苯基丙酮酸为底物进行生物转化合成苯基乳酸的方法。本发明的巨大芽孢杆菌Z2013513来源于传统的发酵食品，属于一般安全菌种，可以在食品中应用；该菌株在牛肉膏蛋白胨或者LB培养基上生长良好，容易扩大培养收集菌体，通过生长细胞和静息细胞转化所得的苯基乳酸含量分别可高达5.4g/L和16.1g/L，抑制食品中腐败菌的能力较强。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，涉及一株巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513）及其生产苯基乳酸的方法。

背景技术

β-苯基乳酸，又称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸（Phenyllactic acid，简称PLA），相对分子质量为166，熔点121～125℃，无气味，对酸、热稳定，在121℃加热也不被破坏，存在于天然蜂蜜中。该有机酸是由多种微生物(尤其是乳酸菌)代谢苯丙氨酸产生的代谢产物，是赋予乳酸菌发酵产品抗真菌和长货架期的主要活性物质之一。PLA作为一种新型、安全、广谱的抑菌物质受到了广泛关注。这种由公认为安全的乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸经研究表明其对人和动物细胞均无毒性。另外，与多数天然防腐剂相比，PLA具有更广的抑菌谱，特别是能够抑制真菌污染，而且其水溶性和热稳定性好，作用pH范围宽，这些优点利于其在食品工业的广泛应用。众多研究已经证实PLA具有广谱且高效的抗菌活力，并且可以替代抗生素用于家畜饲养。比如，已有的资料表明PLA可以有效抑制包括食源性致病细菌，如Listeria monocytogenes、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Providencia stuartii、 Klebsiella oxytoca，酵母和霉菌，如Aspergillus ochraceus、 Penicillium roqueforti 、Penicillium citrinu等多种微生物的生长。

现有技术中生产3-苯基乳酸的方法主要有化学法和生物合成法。化学方法存在的问题是产物光学纯度不够高，技术复杂、污染环境严重、产品成本高以及产品质量难以控制等。由于β-苯基乳酸未来可能主要应用于食品和医药领域，在消费者崇尚天然、营养食品的今天，世界各国的研究者把研究的重点转移到了生物合成法方面；生物合成法即通过完整的微生物细胞的立体选择性生物催化来实现。因此筛选高立体选择性的优良微生物菌株是该方法的关键。早在1986年，Kamata等就用乳糖发酵短杆菌Brevibacterium Lactofermentum发酵生产了R-3-苯基乳酸，产量为1.94 g/L，并且申请了专利；1998年，DieμLeveux等从白地霉Geotrichum Candidum的培养液中也分离到了R-3-苯基乳酸，该菌株在TSBYE培养基中发酵产生R-3-苯基乳酸的量为0.6 g/L～1 g/L；2000年，Lavermicocca等发现从发酵面团中分离到的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他们将植物乳杆菌接种在小麦粉水解液中，30℃培养发酵24 h，产生的R-3-苯基乳酸量为0.009 mol/L。2002年，Katrin 等从青贮草中也分离到了一株L.plantarum MiLAB 393，它产生的S型和R型3-苯基乳酸的比例为9:1；1996年，Hashimoto 等从土壤中筛选到了一株假单胞菌Pseudomonas sp. BC218，能将苯乙醛-氰醇转化为S-3-苯基乳酸。这一转化有较高的对映选择性，生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值为75%，再经过优先结晶，e.e.值可达到99%。该菌株经诱变后，S-3-苯基乳酸的产量是出发菌株的12倍；Diversa公司用腈酶（EC 3.5.5.1）（Nitrilases）可以制备e.e.值为99%的S-3-苯基乳酸；近来，Thierry 等报导费氏杆菌（Propionibacteriun freudenreichii）在奶酪发酵过程中产生了3-苯基乳酸，这些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羟基还原酶作用下得到的。目前β-苯基乳酸已在Diversa公司进行了工业化生产。

然而这些利用不同微生物以简单碳源从头合成PLA的过程复杂，产量较低，并且多数报道所涉及的微生物或者所需营养要求高，或者生长缓慢，并不适用于大规模的生产应用。苯丙酮酸作为一种较为廉价的大宗化学原料，以其为底物，利用微生物的酶催化专一性和高效性，一步合成PLA正成为当前的研究热点。本发明从食品中筛选出具有高效催化苯丙酮酸合成PLA的安全菌株，在此基础上开发出微生物高效转化苯丙酮酸合成PLA的生物合成技术，有效地解决了乳酸菌等生产菌株营养要求高、生长缓慢的问题，显著地提升了产物的产量和生产强度。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株来源安全、培养方法简单、高合成苯基乳酸的微生物菌株。

本发明的第二个目的是提供一种利用上述菌株生产苯基乳酸的方法。

    为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案为：

一、一株巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513），其已于2013年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013244。

本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：米黄色；

需氧方式：好氧生长；

菌落大小：1.2～2.5×2.0～10.0μm；

最适宜生长温度：35-40℃；

最适宜生长初始pH：7；

菌体形态：杆状，末端圆，单个或呈短链排列，能运动；

革兰氏染色：阳性；

芽孢：1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生。

上述巨大芽孢杆菌 Z2013513的获取方法，经出发菌株的选育，LB培养基摇床培养及苯基丙酮酸为底物转化，再同时分别经金黄色葡萄球菌及桔青霉菌平板筛选而得到

具体地说，所述巨大芽孢杆菌 Z2013513的筛选纯化方法包括如下步骤：

1、出发菌株的选育-

以市售腊肠或者豆腐乳为菌源，取适量样品于无菌生理盐水中振荡处理2h后，取菌悬液于80℃处理10min。取处理后的菌悬液1mL接种于10mL牛肉膏蛋白胨培养基于30-40℃富集培养12h。取0.1mL富集培养液分别涂抹于含2%琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基，30℃培养2-3天，获得单菌落。随机挑选若干个单菌落进一步在牛肉膏蛋白胨培养基上划线分离，获得出发菌株并4℃下斜面保存备用；

2、菌体活化及转化液制备

将所选育的菌株分别接种至LB培养基，37℃，200转/分钟活化培养10小时，然后取培养物按照10%（v/v）接种量接入SYG液体培养基，35-40℃，200转/分钟，继续培养8小时。培养物经4℃，4000转/分钟离心5分钟后弃去上清液，加入适量转化培养基悬浮菌体，置于30-40℃，200转/分钟摇床转化4-8小时。转化液经10000转/分钟离心10 min后取上清液进行抑菌实验。

3、金黄色葡萄球菌平板筛选

取长满金黄色葡萄球菌（As1.89）的斜面试管一只，加入无菌蒸馏水10mL，制成菌悬液，取0.1mL接种于牛肉膏蛋白胨培养基表面并均匀涂布，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，取上述步骤2）所得上清液200μL加入牛津杯中，37℃培养22小时，挑出在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株；

4、桔青霉菌平板筛选

在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基，将桔青霉菌制成孢子悬液，取0.1mL接种于PDA平板培养基上并均匀涂布，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，取上述步骤2）所得上清液200μL加入牛津杯，28℃培养60小时，挑出在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株；

挑选能够同时抑制上述金黄色葡萄球菌和青霉菌、且抑菌圈较大的发酵液所对应的菌株，命名为巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513）。

二、一种利用巨大芽孢杆菌 Z2013513生产苯基乳酸的方法，该方法以苯基丙酮酸为底物，利用本发明菌株的生长细胞或静息细胞生物转化合成苯基乳酸。

具体包括如下步骤：

1）种子培养：将巨大芽孢杆菌 Z2013513单菌落接种至LB培养基中活化，35-40℃，200rpm活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基中，35-40℃，摇床200转每分，培养8小时至细胞生长对数中期，将所得培养液于4℃下，4000rpm离心5min，并用无菌生理盐水洗涤2次收集静息细胞菌体；

3）转化生产苯基乳酸：将步骤2）所得菌体转到转化液中40℃转化4-18小时。

所述步骤3）中生长细胞转化生产苯基乳酸的优选方案为：扩大培养4个小时后，分别在之后6个小时里，每小时加0.375mL的流加培养基，转化8小时。

所述步骤3）中静息细胞转化生产苯基乳酸的优选方案为：将步骤2）的菌体悬浮于10 mL转化培养基中并于30℃，200rpm摇床中转化。在前14小时内，每2小时补加0.5mL 流加培养基，共加入约320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖，40℃转化18小时。

所述步骤3）中静息细胞转化生产苯基乳酸的优选转化方法为分批发酵转化：将步骤2）菌体悬浮于10 mL转化培养基中并于40℃，200rpm摇床中转化若干小时，每2h取样，10000rpm离心10min，取上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用同体积0.05%三氟乙酸水溶液溶解，经适当稀释后采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量，经4h转化，转化培养基中苯丙酮酸几乎消耗殆尽。

所述LB培养基包含：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

所述SYD培养基包含：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L。

所述的转化培养基为：葡萄糖20g/L，苯丙酮酸钠4g/L，pH7的磷酸缓冲液。

所述的流加培养基为：葡萄糖100g/L，苯丙酮酸钠78g/L，pH7的磷酸缓冲液。

进一步的苯基乳酸的纯化方法为： 

1）将所得的转化液10000rpm离心10min，弃除沉淀，上清液调PH为2.0；

 2）取上述步骤1）所得上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，后取有机相减压蒸发至干，得到苯基乳酸的粗品；

3）用同体积的0.05%的三氟乙酸水溶液溶解步骤2）所得的苯基乳酸的粗品，经适当稀释后采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯基乳酸的含量。

其中，HPLC测定条件为：色谱柱为岛津VP-ODSC18，流动相为0.05%的三氟乙酸/甲醇（A）和0.05%的三氟乙酸/水（B）的混合液，流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃，进样量10μL，进样前用0.22mm滤膜过滤。

本发明的有益效果在于：

本发明的巨大芽孢杆菌Z2013513属于一般认为安全菌种，具有较高的安全性；该菌株在LB和SYG培养基上生长良好，营养要求低，生长周期短，容易培养和保存，通过生长细胞转化可得苯基乳酸5.4g/L，通过静息细胞转化所得的苯基乳酸含量可高达16.1 g/L，且转化的苯基乳酸易于提纯，抑制食品中腐败菌的能力较强。

附图说明

图1为巨大芽孢杆菌 Z2013513的显微照片（1000×）。

图2为巨大芽孢杆菌Z2013513的静息细胞分别在转化苯丙酮酸之前、转化2小时，4小时所产苯基乳酸的HPLC图谱。

图3为巨大芽孢杆菌Z2013513生长细胞流加底物转化苯丙酮酸生成苯基乳酸图。

图4为巨大芽孢杆菌Z2013513静息细胞流加底物转化苯丙酮酸生成苯基乳酸图。

本发明所述的生物材料，其分类命名为巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513），已于2013年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址是：中国.武汉.武汉大学），保藏编号：CCTCC NO：M 2013244。

具体实施方式：

    下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。

本发明所采用的培养基：

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g。

斜面保藏培养基（g/L）：酵母提取物5g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂20 g。

LB培养基（g/L）：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g。

转化培养基（g/L）：葡萄糖 20g，苯丙酮酸钠4g，0.2mol/L pH7磷酸缓冲液。

流加培养基（g/L）：葡萄糖100g，苯丙酮酸钠78g，0.2mol/L pH7磷酸缓冲液。

SYG培养基（g/L）：葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g。

PDA固体培养基（g/L）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，自然pH。

本发明产物的HPLC测定条件为：色谱柱：VP-ODSC18，流动相为0.05%的三氟乙酸/甲醇（A）和0.05%的三氟乙酸/水（B）的混合液，流速1mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃，进样量10μL，进样前用0.22mm滤膜过滤。

实施例1:本实施例说明巨大芽孢杆菌Z2013513的筛选及纯化鉴定方法。

1、出发菌株的选育-

以市售腊肠或者豆腐乳为菌源，取适量样品于无菌生理盐水中振荡处理2h后，取菌悬液于80℃处理10min。取处理后的菌悬液1mL接种于10mL牛肉膏蛋白胨培养基于 35℃富集培养12h。取0.1mL富集培养液分别涂抹于含2%琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基，30℃培养3天，获得单菌落。随机挑选若干个单菌落进一步在牛肉膏蛋白胨培养基上划线分离，获得出发菌株并保存于4℃备用；

2、菌体活化及转化液制备

将所选育的菌株分别接种至LB培养基，37℃，200转/分钟活化培养10小时，然后取培养物按照10%（v/v）接种量接入SYG液体培养基，40℃，200转/分钟，继续培养8小时。培养物经4℃，4000转/分钟离心5分钟后弃去上清液，加入适量转化培养基悬浮菌体，置于37℃，200转/分钟摇床转化8小时。转化液经10000转/分钟离心10 min后取上清液进行抑菌实验。

3、金黄色葡萄球菌平板筛选

取长满金黄色葡萄球菌（As1.89，购自于中科院微生物研究所国家菌种保藏中心）的斜面试管一只，加入无菌蒸馏水10mL，制成菌悬液，取0.1mL接种于牛肉膏蛋白胨培养基表面并均匀涂布，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，取上述步骤2）所得上清液200μL加入牛津杯中，37℃培养22小时，挑出在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株；

4、桔青霉菌平板筛选

在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基，将桔青霉菌制成孢子悬液，取0.1mL接种于PDA平板培养基上并均匀涂布，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，取上述步骤2）所得上清液200μL加入牛津杯，28℃培养60小时，挑出在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株；

挑选能够同时抑制上述金黄色葡萄球菌和青霉菌、且抑菌圈较大的发酵液所对应的菌株，命名为巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513）。

该菌株的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：米黄色；

需氧方式：好氧生长；

菌落大小：1.2～2.5×2.0～10.0μm；

最适宜生长温度：35-40摄氏度；

最适宜生长初始pH：7；

菌体形态：杆状，末端圆，单个或呈短链排列，能运动；

革兰氏染色：阳性；

芽孢：1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生。

实施例2:本实施例说明巨大芽孢杆菌Z2013513的鉴定方法。

1、芽孢菌株的鉴定：

对该菌的16SrDNA部分的序列的测定及比对分析，鉴定为巨大芽孢杆菌，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名为巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513），其保藏登记号为：M2013244。

2、巨大芽孢杆菌Z2013513的特征：

形态学特征：

将巨大芽孢杆菌Z2013513菌株在LB固体培养基上，37℃培养8小时，形成明显的菌落，直径在1.0～2.0 mm之间，圆形，培养基内呈圆状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。在显微镜下观察，革兰氏染色阳性，运动，细胞短杆状，0.29～0.45 mm×1.58～4.20 mm，产孢子。

培养特征：

最适生长温度35-40℃，好氧生长，最适生长初始pH为7.0。

实施例3：本实施例说明本发明菌株的生长细胞发酵生产苯基乳酸中的方法。

1）种子培养：将巨大芽孢杆菌 Z2013513单菌落接种至LB液体培养基35℃，200转每分活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基中，40℃，摇床200转每分培养4h获得生长细胞；

3）转化生产苯基乳酸

扩大培养4个小时后，分别在之后6个小时里，每小时补加0.375mL的流加培养基，转化8小时。

取步骤3）转化液，经10000rpm离心5分钟，得上清液，上清液中加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用0.05%三氟乙酸水溶液溶解，采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯基乳酸的含量，苯基乳酸最终含量达到5.4g/L，转化率达到45%（图3）。

实施例4：本实施例说明本发明菌株的静息细胞批式发酵生产苯基乳酸中的方法。

1）种子培养养：将巨大芽孢杆菌Z2013513单菌落接种至LB液体培养基35-40℃，200rpm活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基，35℃, 200rpm培养8小时至细胞生长对数中期，所得培养液于4℃，4000rpm离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次；

3）静息细胞批式转化生产苯基乳酸

将步骤2）菌体悬浮于10 mL转化培养基中并于40℃，200rpm摇床中转化若干小时，每2h取样，10000rpm离心10min，取上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用同体积0.05%三氟乙酸水溶液溶解，经适当稀释后采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量。经4h转化，转化培养基中苯丙酮酸几乎消耗殆尽，同时生成苯基乳酸2.7g/L，苯丙酮酸转化率达到67.5%如图2所示。

实施例5：本实施例说明本发明菌株的静息细胞分批流加发酵生产苯基乳酸的方法。

1）种子培养：将巨大芽孢杆菌Z2013513单菌落接种至LB液体培养基35℃，200rpm活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基，40℃, 200rpm培养8小时至细胞生长对数中期，所得培养液于4℃，4000rpm离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次；

3）分批流加法转化生产苯基乳酸

将步骤2）菌体悬浮于10 mL转化培养基中并于40℃，200rpm摇床中开始转化。从第2h开始的前14小时内，每2小时往转化液中补加0.5mL 流加培养基，总计加入约320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖，40℃下共转化18小时结束。最终苯基乳酸含量可达16.1g/L，转化率达到50%（图4）。

结果表明，该菌的静息细胞，采用流加的转化策略可有效的转化苯丙酮酸生成苯基乳酸，本方法采用的工艺和菌株转化苯丙酮酸合成苯基乳酸的产量、转化率及生产率显著优于以乳酸菌为基础的生物转化指标。