葡糖糖酸内酯在诱导纤维素酶表达中的应用

摘要

本发明涉及葡糖糖酸内酯在诱导纤维素酶表达中的应用，所述葡糖糖酸内酯为δ-葡萄糖酸内酯，结构式如下所示：

说明书

技术领域

本发明涉及葡糖糖酸内酯在诱导纤维素酶表达中的应用，特别涉及δ-葡萄糖酸内酯(δ -gluconolactone)在诱导纤维素酶表达中的应用，属生物工程技术领域。

背景技术

地球上存在丰富的木质纤维素资源，其在可循环替代能源及基础化合物生产方面具有巨 大的应用潜力。众所周知，纤维素的降解终产物是葡萄糖，葡萄糖作为一种工业原料可进行 多种衍生物的合成。纤维素降解方法主要有化学法和生物法两种方法，前者主要是通过强酸 或者强碱破坏木质纤维素的天然结构，并使木质纤维素进行不同程度的降解，后续处理麻烦 对环境危害极大；后者主要是通过微生物对木质纤维素进行生物降解，条件温和且对环境友 好，有利于可持续发展。

自然界存在许多可有效降解转化木质纤维素的微生物，其对木质纤维素的降解过程构成 了地球碳循环的一个重要方面，其中瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是最重要的代表菌株。 它通过分泌纤维素酶来降解纤维素，主要包括外切葡聚糖苷酶、内切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖 苷酶等。真菌所产生的纤维素酶大部分都是诱导酶，添加高效诱导物是提高纤维素酶诱导表 达的一种有效方法。目前为止，已有大量文献报道微晶纤维素(Avicel)，纤维糊精 (cellodextrin)，纤维二糖(Cellobiose)，乳糖(Lactose)，槐糖(Sophorose)等均具有诱导 纤维素酶表达能力。其中微晶纤维素属不溶性底物，其作为诱导物给后续的纤维素酶分离纯 化带来一定的麻烦，纤维糊精，纤维二糖，槐糖具有明显的纤维素酶诱导效果，但由于其价 格昂贵造成成本过高。另外，一个制约纤维素生物降解的关键性因素就是降解速度过慢。

因此，寻找新的价格适当的新型纤维素酶诱导物对于更深层次的探索纤维素酶诱导表达 调控机制以便通过遗传手段提高纤维素降解菌利用纤维素的效率，促进纤维素酶工业生产， 实现木质纤维素类物质合理利用具有及其重大的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供葡糖糖酸内酯在诱导纤维素酶表达中的应用。

葡糖糖酸内酯在诱导纤维素酶表达中的应用，所述葡糖糖酸内酯为δ-葡萄糖酸内酯，结 构式如下所示：

根据本发明优选的，所述的应用，步骤为：向以δ-葡萄糖酸内酯为碳源的诱导培养基中 接种产纤维素酶的微生物，使诱导培养基中δ-葡萄糖酸内酯的质量浓度为0.2～0.5%，经诱 导培养，即可。

根据本发明进一步优选的，所述δ-葡萄糖酸内酯的质量浓度为0.25%。

根据本发明进一步优选的，所述产纤维素酶的微生物选自瑞氏木霉TU-6。

根据本发明进一步优选的，所述维素酶为纤维素外切酶CBH1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

根据本发明进一步优选的，所述诱导培养基，每升组分如下：

有益效果

本发明提供了一种新的纤维素酶表达的诱导物，为从原料和后期分离纯化工艺两方面降 低纤维素酶生产成本开辟了新的途径，并且新类型纤维素酶表达诱导物的发现对于科研方面 更进一步揭示纤维素酶诱导表达调控机制具有促进作用。

附图说明

图1是本发明纤维素酶表达诱导物δ-葡萄糖酸内酯诱导纤维素酶的Western Blot检测结 果图；

其中：黑色条带为纤维素酶CBH1；横坐标代表不同的取样时间；

图2是纤维素酶诱导物δ-葡萄糖酸内酯不同浓度对纤维素酶表达影响的Western Blot检 测结果图；

其中：黑色条带为纤维素酶CBH1；横坐标代表不同的取样时间；阳代表阳性对照。

图3是纤维素酶诱导物δ-葡萄糖酸内酯与同浓度纤维二糖诱导效果对比结果

其中：黑色条带为纤维素酶CBH1；横坐标代表不同的取样时间；阳代表阳性对照；相对 强度值为CBH1信号相对强度值，代表诱导效果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以便本领域的技术 人员了解本发明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的瑞氏木霉购自美国典型微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为：ATCC MYA-256。

实施例中所述δ-葡萄糖酸内酯购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

实施例中瑞氏木霉预培养培养基，每升组分如下：

实施例中所述诱导培养基，每升组分如下：

实施例1

δ-葡萄糖酸内酯诱导瑞氏木霉纤维素酶表达能力的确定

(1)在瑞氏木霉预培养培养基中接种瑞氏木霉的孢子10⁶个，30℃，200转/分钟培养36小 时，用G1砂芯漏斗收集菌丝并并转移到新鲜的瑞氏木霉预培养培养基中继续培养12小时，最 后将菌丝收集并以24g/L的接种量转接至诱导培养基中，每隔12小时取发酵液，进行纤维素酶 表达的检测。

(2)对步骤(1)中获得的发酵液利用纤维素酶CBH1的多克隆抗体通过Western Blot进行检 测。

1)将样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶的浓度为8wt%（方法参照《蛋白质操作手册》）， 然后进行电转法将蛋白转印到PVDF膜上，转印条件为电压100V，转印时间为4h。

2)转膜后，用含有0.1wt%吐温20（Tween-20）的PBS缓冲液润洗膜。

3)用封闭液浸泡膜，封闭液为含有3wt%牛血清白蛋白（BSA）和0.1wt%吐温20 （Tween-20）的PBS缓冲液，常温下轻轻振荡1h。

4)用含有0.1wt%吐温20（Tween-20）的PBS缓冲液轻轻润洗上述PVDF膜，将膜浸泡 在一抗CBH1多克隆抗体（该抗体是以CBH1的426—446肽段为抗原，由南京金斯瑞生物科 技有限公司合成）中，振荡，2～8℃保温1h。根据一抗进行稀释，可选用1：（5000～10000） 稀释度，抗体溶在50ml封闭液中，封闭液为含有3wt%牛血清白蛋白（BSA）和0.1wt%吐 温20（Tween-20）的PBS缓冲液，一抗回收保存于0.02%叠氮化钠中可重复使用十次以上。

5)用含有0.1wt%吐温20（Tween-20）的PBS缓冲液润洗上述PVDF膜，每次15min， 重复洗三次。

6)将上述PVDF膜浸泡在含有二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，购自 北京中山金桥生物技术有限公司）的孵育液中，孵育液为含有1wt%牛血清白蛋白（BSA）和 0.1wt%吐温20（Tween-20）的PBS缓冲液，二抗由孵育液稀释，稀释度为1：10000，室温 振荡1h。

7)再次用含有0.1wt%吐温20（Tween-20）的PBS缓冲液润洗膜，每次约15min，共洗 三次。

(3)利用Millipore Western Blot化学发光HRP底物ECL发光液(购自密理博（上海）贸 易有限公司)进行显色，Western Blot检测主要纤维素酶CBH1结果如图1，其中黑色条带即 为显色后CBH1。

由上述结果可以看出，δ-葡萄糖酸内酯具有诱导瑞氏木霉产生纤维素酶的作用。

实施例2

δ-葡萄糖酸内酯诱导瑞氏木霉表达纤维素酶的最佳浓度的确定

分别以质量浓度为0.1%，0.25%，0.5%，0.75%的δ-葡萄糖酸内酯为碳源配制诱导培养 基，诱导培养基其他成分同实施例1，在30℃，200rpm的条件下，诱导培养，每隔12小时 进行发酵液取样，并对纤维素酶的表达量进行检测，检测方法如实施例1中所示，同时以CBH1 纯蛋白（南京金斯瑞生物科技有限公司提供）作为阳性对照。通过Western Blot检测瑞氏木 霉主要纤维素酶CBH1，结果如图2所示。

由图2可以看出，低浓度的δ-葡萄糖酸内酯对于纤维素酶的诱导效果不明显，而随着δ -葡萄糖酸内酯浓度的增加，纤维素酶诱导表达反馈抑制加强，当δ-葡萄糖酸内酯浓度为 0.25%时，诱导效果最佳。

对比例

δ-葡萄糖酸内酯诱导瑞氏木霉表达纤维素酶的效果优于同浓度下纤维二糖

分别以质量浓度为0.25%的δ-葡萄糖酸内酯和纤维二糖为碳源配制诱导培养基，诱导培 养基其他成分同实施例1，在30℃，200rpm的条件下，诱导培养，每隔12小时进行发酵液 取样，并对纤维素酶的表达量进行检测，检测方法如实施例1中所示，同时以CBH1纯蛋白 （南京金斯瑞生物科技有限公司提供）作为阳性对照。通过Western Blot检测瑞氏木霉主要 纤维素酶CBH1，结果如图3所示。

由图3可以看出，δ-葡萄糖酸内酯诱导瑞氏木霉产纤维素酶的效果优于纤维二糖。