成人的髓母细胞瘤细胞系及其应用

摘要

本发明公开了一种成人的髓母细胞瘤细胞系XQ625，保藏号为CCTCC No：C2013171；该细胞系是从发生于成人小脑蚓部的经典型髓母细胞瘤手术切除标本中分离培养获得，在体外能够长期传代培养，在裸鼠体内1×10

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种肿瘤细胞系。

背景技术

髓母细胞瘤是儿童最常见的恶性脑肿瘤，发病高峰年龄为8岁；仅30%的髓母细胞瘤发生 于成人。由于发病率较低，目前全世界已有的髓母细胞瘤细胞系非常有限，仅有Daoy、D283、 D341Med、BO-1、MED-FU、ONS-76和ONS-81几种，且均来源于儿童。近年来，随着对髓 母细胞瘤研究的深入，大量证据表明，儿童和成人的髓母细胞瘤在遗传背景及临床预后等方 面均有不同。例如，成人的髓母细胞瘤通常发生于小脑半球，而儿童的髓母细胞瘤多发生于 小脑蚓部；成人的髓母细胞瘤组织学类型上多以促结缔组织增生型为主，且比儿童的髓母细 胞瘤预后更差。因此，有必要分离并建立一系列具有不同生物学特性的髓母细胞瘤细胞系， 以满足对髓母细胞瘤及其治疗药物的深入研究需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于分离并建立具有不同生物学特性的髓母细胞瘤细胞系，以 满足对髓母细胞瘤及其治疗药物的深入研究需要。

经研究，本发明提供如下技术方案：

成人的髓母细胞瘤细胞系XQ625，保藏号为CCTCC No：C2013171。

发明人收集了2011-2013年间中国人民解放军第三军医大学第二附属医院术前诊断疑是 髓母细胞瘤的13例标本，手术中取材进行原代细胞的培养。术后病理诊断为髓母细胞瘤的5 例标本（MB1-MB5）均在体外成功分离培养原代髓母细胞瘤细胞，并规律传代。在传代培养 过程中发现，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力逐渐减弱，4例原代髓母细胞瘤细胞在 培养十几代后细胞的分化现象非常明显，细胞生长停滞，仅1例原代髓母细胞瘤细胞（MB4） 可以连续传代，由此建立了稳定的髓母细胞瘤细胞系XQ625。

髓母细胞瘤细胞系XQ625来源于成人，发生于小脑蚓部，其病理诊断依据2007年WHO 中枢神经系统肿瘤分类属于经典型髓母细胞瘤。

对XQ625细胞的生物学特性研究发现：细胞的倍增时间为42小时；细胞周期为G₁期占 53.93%，G₂期占16.07%，S期占30.00%；在裸鼠体内，1×10⁴个XQ625细胞即能起始肿瘤的发 生；移植瘤细胞呈弥散分布，细胞小而圆，核浆比大，核分裂相易见，胞浆少，胞浆内细胞 器少，可见核糖体及线粒体，呈较原始的未分化状态；免疫组化标记Vimentin呈阳性，Ki67 约95%细胞呈阳性，其余免疫组化标记CD99、CgA、GFAP、Pan-CK、Syn、LCA、EMA、 Desmin和S-100均为阴性。

本发明的成人髓母细胞瘤细胞系XQ625可以用于制备或筛选抗髓母细胞瘤的药物。例 如，通过体外实验筛选出具有抑制或杀伤XQ625细胞的抗体，可将此抗体作为治疗髓母细胞 瘤药物的主要成分，或筛选出特异识别XQ625细胞的抗体作为靶向工具，制备抗髓母细胞瘤 的靶向药物。

本发明的有益效果在于：本发明在对5例髓母细胞瘤原代进行细胞培养的过程中，成功 建立了一株发生于成人的髓母细胞瘤细胞系，并对其细胞生物学特性进行了研究，该细胞系 在体外能够长期传代培养，在裸鼠体内1×10⁴即能起始肿瘤的发生，既有助于满足对髓母细 胞瘤的深入研究需要，又是研制抗髓母细胞瘤药物的有力工具，具有潜在良好的应用前景。

生物材料保藏

成人的髓母细胞瘤细胞系XQ625，于2013年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心 （简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学），保藏号为CCTCC No：C2013171。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为髓母细胞瘤原代标本的HE染色，其中A-E分别为MB1-MB5肿瘤组织HE染色， 放大倍数×200；F-J分别为MB1-MB5肿瘤组织HE染色，放大倍数×400。

图2为髓母细胞瘤原代细胞的倒置相差显微镜观察，其中A-E分别为MB1-MB5髓母细 胞瘤原代细胞培养的形态特征，放大倍数×100。

图3为不同代数P1、P21和P41的髓母细胞瘤细胞XQ625的倒置相差显微镜观察，其中 A-C分别为XQ625细胞P1、P21和P41的形态特征，放大倍数×100；D-F分别为XQ625细 胞P1、P21和P41的形态特征，放大倍数×200。

图4为髓母细胞瘤细胞XQ625的生长曲线和细胞周期检测，其中A为CCK8检测XQ625 细胞的生长曲线，B为细胞周期试剂盒流式检测XQ625细胞的细胞周期。

图5为髓母细胞瘤细胞XQ625的核型分析结果。

图6为髓母细胞瘤细胞XQ625的裸鼠皮下成瘤，其中A为不同数量级XQ625细胞所成 瘤的大小，B为不同数量级XQ625细胞所成瘤的重量。

图7为XQ625移植瘤HE染色及免疫组化染色，其中A为HE染色，B-J分别为vimentin、 Ki67、CD99、CgA、GFAP、Pan-CK、Syn、LCA、EMA、Desmin、S-100免疫组化染色，放 大倍数均为×400。

图8为XQ625移植瘤电镜观察，其中A显示瘤细胞较小，大小形态比较一致，核浆比 大，可见一核分裂相；B显示瘤细胞核膜较光滑，可见核仁，胞浆少，胞浆内细胞器少，可 见核糖体及线粒体。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例中使用的主要设备如下：

设备名称 生产商(产地) 光学显微镜，BX-40型 Olympus公司(日本) 光学显微镜，带采图系统 Leica公司(德国) 透射电子显微镜，TECNAI10型 Philip公司(荷兰) 倒置相差显微镜，CK40-F200型 Olympus公司(日本) FACS Calibur型流式细胞仪 BD公司(美国)

主要试剂如下：

部分试剂的配制方法如下：

①DMEM完全培养基：取1袋DMEM培养基干粉(1L装)，用800ml超纯水溶解，加入 2.38g HEPES和3.5g NaHCO₃，再加入青霉素-链霉素混合液(双抗,100×)10ml（青霉素、链霉 素终浓度分别为100U/ml、100μg/ml），用超纯水定容至900ml，搅拌使完全溶解，调整pH 至7.2-7.4，得到DMEM基础培养液；再加入100ml FBS，充分混匀，真空抽滤，0.22μm微 孔滤膜过滤除菌，即得DMEM完全培养基，4℃保存备用。

②胰酶消化液（含有0.25%胰酶和0.02%EDTA）：称取0.25g胰酶及0.02g EDTA，用 0.01M PBS(pH=7.4)溶解并定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

③I型和IV型胶原酶混合液：称取100mg I型胶原酶和100mg IV型胶原酶，用DMEM/F12 培养基溶解并定容至100ml，调节pH至7.2-7.4，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。

④枸橼酸钠抗原修复液(pH6.0)：将枸橼酸钠14.7g溶于500ml去离子水中制得A液；将 枸橼酸10.5g溶于500ml去离子水中制得B液；取41ml A液和9ml B液混合，用去离子水定 容至500ml，即得。

一、髓母细胞瘤原代标本临床病理信息

新鲜髓母细胞瘤手术切除标本取自中国人民解放军第三军医大学第二附属医院神经外 科。病例依据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类进行诊断，每例标本由两名病理医生出具 诊断报告。临床病理信息如表1所示：

表1  髓母细胞瘤原代标本临床病理信息

编号 手术日期 性别 年龄 部位 病理诊断 MB1 2011-7-26 男 6岁 小脑蚓部 促结缔组织增生型髓母细胞瘤 MB2 2011-9-13 男 10岁 第四脑室 经典型髓母细胞瘤 MB3 2011-10-17 女 9岁 第四脑室 结节型髓母细胞瘤 MB4 2012-06-25 男 24岁 小脑蚓部 经典型髓母细胞瘤 MB5 2012-07-20 男 6岁 小脑蚓部 经典型髓母细胞瘤

上述5例髓母细胞瘤原代标本的HE染色结果如图1所示，可见瘤细胞小，核深染，胞 浆少，核浆比较大，部分区域可见典型的Homer-Wright菊形团结构。

二、原代髓母细胞瘤细胞培养

将5例髓母细胞瘤原代标本分别置于预冷的DMEM完全培养基中，用无菌眼科剪剪成约 1mm3大小的碎块，800g离心5min，弃上清，沉淀用10ml I型和IV型胶原酶混合液重悬， 37℃消化30min，再800g离心5min，弃上清，沉淀用DMEM完全培养基重悬，37℃培养，3 天后可见肿瘤细胞贴壁生长，待长至60%-70%融合度后用胰酶消化液消化传代。

结果从5例髓母细胞瘤原代标本中成功分离培养获得5例原代髓母细胞瘤细胞（MB1～ MB5）。倒置相差显微镜下观察，5例原代髓母细胞瘤细胞的形态差别不大（图2），在有血清 的情况下可见培养细胞胞浆丰富，部分区可见细胞呈胶质细胞的形态特征，有较多的细长突 起（图3），说明培养的原代髓母细胞瘤细胞出现了向胶质细胞方向分化的特征。随着传代次 数的增加（约十几代），有4例原代髓母细胞瘤细胞均出现了明显的分化以及不同程度的细胞 生长停滞，仅1例原代髓母细胞瘤细胞（MB4）可以连续传代。

三、髓母细胞瘤细胞系的建立及其特性研究

由原代髓母细胞瘤细胞MB4体外连续传代建立了稳定的髓母细胞瘤细胞系XQ625。

1、细胞形态观察

不同代数P1、P21和P41的XQ625细胞镜下形态观察，可见P1细胞有较多的细长突起， 呈胶质细胞样分化的特点，随着培养代数的增加，具有胶质细胞样分化特征的细胞越来越少； P21细胞少数呈星形细胞样形态，有较多的胞浆突起，其余大多数呈小的圆形、椭圆形和多 边形的形态特征，核浆较大；P41细胞已不见细长突起，为较均一的细胞形态（图1-3）。

2、细胞生长曲线

收集对数生长期的P41XQ625细胞，调整细胞浓度至1×10⁴个/ml，96孔板每孔加入细胞 悬液0.1ml，置37℃、5%CO₂培养箱中培养8天，每隔24小时用CCK-8试剂盒测定波长450nm 的吸光度值，绘制细胞生长曲线。结果见图4A，细胞的倍增时间为42小时。

3、细胞周期分析

用胰酶消化P41XQ625细胞成单细胞悬液，1000g离心3-5min，弃上清，细胞沉淀用冰 浴预冷的PBS洗涤并重悬，加入冰浴预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定12小时，再 1000g离心3-5min，弃上清，细胞沉淀用冰浴预冷的PBS洗涤并重悬，加入碘化丙啶染色液 （细胞周期检测试剂盒），37℃避光孵育30min，用流式细胞仪检测，激发波长为488nm， 用分析软件进行细胞周期分析。结果见图4B，G₁期细胞占53.93%，G₂期细胞占16.07%，S 期细胞占30.00%。

4、核型分析

取对数生长期的P41XQ625细胞，终止培养前2-4小时加入终浓度为0.2μg/ml的秋水仙 素使细胞分裂停止在中期，终止培养后，1000g离心10min，弃上清，沉淀加入预热至37℃ 的0.075M KCl低渗液，37℃低渗30min使细胞膨胀及染色体分散，再加入固定液即体积比为 3:1的甲醇-冰醋酸混合液进行预固定，1000g离心10min，弃上清，沉淀再加入固定液，室温 固定30min，1000g离心10min，弃上清，沉淀用固定液重悬后，滴2-3滴于冰水浸泡过的载 玻片上，80℃烤片15min，置Giemsa染液中染色8min，水洗去浮色，干燥，置显微镜下观 察染色体标本分裂相的多少及分散情况。结果见图5，计数染色体数为60-62条。核型分析结 果为：60,XX,der(1)t(1;3)(p22;p11),der(1)t(1;4)(q42;q31,3),+1,+1,del(2)(q?)der(2)(p?), der(3)(q?),der(5)t(3;5)(q23;p15),del(6)(q11),+6,+7,der(9)?,der(10)t(2;15),der(12)t(11; 12)(q23;q13),+12,der(13)t(9;13)(q12;p10),+14,-15,+16,-21,+der(19)t(19;21),+i(11)(p10), +i(11)(p10),+i(11)(p10),+add(22)(q13),+mar,+mar,+der(?),+der(?)。

四、髓母细胞瘤细胞系XQ625的成瘤能力

为了检测XQ625细胞是否具有体内成瘤能力，将不同数量级的P41XQ625细胞打到裸 鼠腋下。结果如表2所示，1×10⁴个XQ625细胞在裸鼠体内即能起始肿瘤的发生。不同数量 级XQ0625细胞所成瘤大小及重量见图6。

表2  XQ625细胞成瘤实验

细胞数量 成瘤动物数/实验动物数 5×10⁵5/5 1×10⁵5/5 5×10⁴5/5 1×10⁴2/5 5×10³0/5

1、XQ625移植瘤的HE及免疫组化染色

免疫组化染色方法如下：将移植瘤组织石蜡块制备成厚度为4-7μm的组织切片，置烤片 灯下烘烤20min后，脱蜡，水化，用3%H₂O₂溶液于37℃浸泡30min阻断内源性过氧化物 酶，0.01M PBS漂洗3次，用枸橼酸钠抗原修复液浸泡并进行微波修复（先800W、3min加 热至溶液沸腾，再用150W维持沸腾状态17min），修复完毕后室温自然冷却，0.01M PBS 漂洗3次，加入一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS漂洗3次，再加入HRP标记二抗，37℃孵 育30min，0.01M PBS漂洗3次，DAB显色液显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，镜检。 结果如图7所示，XQ625移植瘤HE染色镜下组织学形态可见瘤细胞弥散分布，间质成分少， 细胞小而圆，胞浆少，核分裂相易见；免疫组化染色显示Vimentin阳性，Ki67约95%细胞阳 性，其余免疫组化标记CD99、CgA、GFAP、Pan-CK、Syn、LCA、EMA、Desmin和S-100 均为阴性。

2、XQ625移植瘤的透射电镜观察

取小于1mm³的移植瘤组织，用2.5%戊二醛固定24小时，0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗3 次，1%锇酸固定液固定2-3小时，0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，再于4℃依次用50%乙醇、 70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇-90%丙酮混合液（体积比1:1）、90%丙酮各浸泡15min，丙 酮室温漂洗3次，再依次用丙酮+包埋液（体积比2:1）室温包埋3-4小时，丙酮+包埋液（体 积比1:2）室温包埋过夜，包埋液37℃包埋2-3小时，再依次置37℃烘箱干燥过夜，45℃烘 箱干燥12小时，60℃烘箱干燥48小时，最后切片（厚度70nm），3%醋酸铀-枸橼酸铅双染 色，镜检。结果如图8所示，电镜可见瘤细胞较小，大小形态比较一致，核浆比大，核为圆 形、卵圆形，核膜光滑整齐，也有细胞核周界呈齿状曲折，可见核仁，核分裂相易见；细胞 周界有的整齐平直，也有的曲折，相邻细胞质膜彼此镶嵌；胞浆少，胞浆内细胞器少，可见 核糖体及线粒体，未见微管或胶质微丝束等向胶质细胞方向的分化。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。