人胚肺成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用

摘要

本发明公开了人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用，人二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感，采用Walvax-2生产甲肝疫苗，可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲肝病毒纯化疫苗。

说明书

发明所属领域：

本发明属于疫苗技术领域，具体地说，本发明涉及人二倍体成纤维细胞株在 制备甲肝疫苗中的应用，以及人二倍体成纤维细胞株在治疗甲型肝炎病的疫苗中 的应用。

背景技术：

甲型肝炎（hepatitis A）又被称为甲肝，是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus， HAV）引起的肝脏炎症病变为主的传染性疾病，是我国重要的卫生问题。以粪- 口传播为主，任何年龄均可患病，但主要为儿童及青少年，病死率低，重症病人 多为儿童。

HAV属于小核糖核酸病毒科，单列属。无包膜，直径为27nm～32nm，二 十面立体对称的球形颗粒。具有嗜肝性，对环境耐受性强，耐酸、耐热，对20% 乙醚及氯仿等不敏感。甲醛、β-丙内脂、高压均可使其灭活。HAV有多个基因 型及一个血清型。

1978年Provost和Hilleman从绒猴肝脏组织中提取得到HAV，1979年体外 培养甲型肝炎病毒成功，至20世纪90年代中期，甲肝减毒活疫苗及甲肝灭活疫 苗正式投入生产，甲肝疫苗的研究经历了漫长的时间及无数的实验。到目前为止， 甲肝疫苗已经被证实是安全且有效的。

全世界每年需要近1亿人份的HAV疫苗，因此需要大规模及高产量的HAV 疫苗的生产。我国《中国药典》2010版三部规定“冻干甲型肝炎减毒活疫苗”及“甲 型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞）”的细胞培养基质为2BS株及KMB17株或其 他经批准的人二倍体细胞株。2BS株及KMB17株均为我国自行研制的人源二倍 体成纤维细胞，属于贴壁生长细胞。此类细胞生长和正常功能表达的前提条件是 附着培养容器表面生长。当生产需要量少时，可采用转瓶、细胞培养瓶等进行培 养，但这些培养容器表面积小，培养量少，不利于工业大规模生产。现阶段许多 类型的细胞工厂投入疫苗生产，细胞工厂可大量增加培养表面积，提高每个单元 的生产能力，并很好的解决细胞贴壁生长及病毒滴度问题。但工业大规模生产仍 需要大批量的细胞工厂，高成本限制了其工业生产的扩大及商业开发的潜能。因 此经济上，使用生物反应器培养病毒是病毒性疫苗生产的最佳方法。

使用微载体的生物反应器培养过程中，微载体为细胞生长提供了大量的表面 积，实现了高密度培养，是一个高效的生产系统。该系统可以提供均质的细胞培 养环境，更易于细胞稳定的生长及产物的高效表达。脊髓灰质炎及狂犬疫苗的生 物反应器培养方式投入生产，证明了此方法在工艺放大时的优势及商业上的潜 力。

美国专利WO95/24468公开了微载体培养MRC-5细胞生产HAV的方法， 在细胞-病毒培养物中收获了一定量的甲肝病毒。瑞士专利WO2003/049767公布 了一种用微载体无血清培养Vero细胞大规模生产甲型肝炎病毒的方法。中国专 利CN101406699A公布了一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方 法。

从现有技术来看，无论是MRC-5、2BS或是KMB-17，均在病毒疫苗生 产中使用多年，安全性不容置疑。但缺点是细胞未推广使用及细胞代次高，限制 了病毒产量的提高和进一步使用。人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在中国专利 201210371784.X已公开，但此细胞是否对甲肝病毒敏感及是否可利用其生产甲肝病 毒疫苗不得而知。

发明内容：

本发明的一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的 应用，人胚肺二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感，使用此细胞生产甲肝病毒疫 苗可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲 肝病毒纯化疫苗。

本发明的另一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备治疗甲型肝 炎病疫苗中的应用

本发明公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的 应用。

本发明还公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗甲型肝炎 病的疫苗中的应用。

本发明的人胚肺二倍体成纤维细胞株在中国专利201210371784.X已公开，为人 胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201055，保藏日期是2010年7 月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学 校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。

Walvax-2细胞株对甲型肝炎病毒株敏感，且病毒产量高。将甲肝病毒接种 至Walvax-2细胞上，在34～35℃常规培养下，就能生产高滴度的病毒疫苗原液； 病毒原液通过抽提、浓缩、纯化、灭活并加入保护剂，就形成甲肝病毒灭活疫苗 原液。疫苗原液分装后冻干即为冻干甲型肝炎灭活疫苗。

Walvax-2细胞株对现在流行的疫苗株敏感如H2株，YN5株，L-A-1株。在 本发明中采用的甲型肝炎病毒，为甲型肝炎病毒YN5株，按专利程序要求在2001 年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO:V200104， 此病毒在专利02106985.9中已公开，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保 藏中心按章索取；人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,CCTCC NO：C201055 按专利法要求寄存在中国典型培养物保藏中心，处于公开状态，科学工作者可向 该菌种保藏中心索取；MRC-5（ATCC CCL171），WI-38（ATCC CCL75）登载 于美国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保 藏中心索取。本发明中对照细胞KMB-17，2BS登载于中国典型培养物保藏中心 的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。

本发明中，HAV是指甲肝病毒。

采用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2生产的甲肝病毒灭活疫苗与 MRC-5，WI-38，KMB-17，2BS细胞生产的甲肝病毒灭活疫苗相比，本发明的 优点主要体现在以下几个方面：

1）对现用于甲肝病毒灭活疫苗用毒种具有很好的敏感性，适应性，病毒产量高， 制成的疫苗免疫原性好。

2）人胚肺二倍体成纤维细胞株适应在细胞工厂或生物反应器工艺上或在微载体 上进行很好的适应，适合大规模生产和应用。

3）人源Walvax-2细胞基质培养HAV，避免了非人源宿主细胞蛋白残留，降低 了培养过程中的外源因子污染，疫苗有更高的安全性。

4)所制备的疫苗安全性高，免疫效果好，使用方便，纯度高，本发明的生产方 法制备的甲肝灭活疫苗产生的ED50显著低于GSK的甲肝灭活疫苗。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于 说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1Walvax-2细胞株的制备

1.1.实验材料的获得：在获得国家卫生管理部门和伦理委员会的批准后，对捐 赠孕妇的夫妇年龄、职业及健康状况，胎儿父母系三代进行调查，选择无 肿瘤疾病历史，无先天性异常和遗传缺陷家族史的胎儿。征得胎儿父母及 其亲属同意后，签订《捐赠者同意书》。

1.2.初代培养：胚胎水囊引产后及时送往实验室，无菌条件下取出肺组织，撕 去肺组织表面的膜，剪切成1～2mm³的组织块，PBS清洗3～4次；将组 织块移入三角瓶；加胰蛋白酶消化30min，加血清中和，1000rpm离心5min 弃胰蛋白酶，用细胞完全培养基悬浮细胞，于37℃，5%CO2条件下培养。 培养基成分：MEM+10%胎牛血清，继续培养5天。

1.3.传代培养：弃除培养瓶内的培养液，PBS洗细胞面，用胰蛋白酶消化后加 入完全培养液终止消化；以1:2或1：4的分种比例进行传代；待细胞长成 致密单层后继续传代，直至生命线。

1.4.细胞冻存：细胞生命线传代过程中，在第6代，第8代，第10代，第14 代，第20代分别大量冻存细胞做种子细胞库或工作细胞库。其中第6代为 原始细胞细胞库，第14代为主细胞库，第20代为工作细胞库.冻存细胞后 进行复苏，检测其活性继续传代至生命线，传代58次。

1.5.细胞传代消化：细胞培养3-4天后，PBS洗细胞面后胰蛋白酶消化5-10min， 去胰蛋白酶，加入20～30ml培养液终止消化；分瓶继续在37℃，5%CO₂条件下培养。

1.6.细胞特性研究：传代过程中，对细胞生物学特性进行研究。本发明从所建 系且符合国家药典要求的细胞中筛选到一株人胚肺二倍体成纤维细胞株， 命名为Walvax-2，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物 保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201055，保藏日期是2010年7月13 日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学 校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。

1.7.Walvax-2细胞株对多种人类病毒敏感，如手足口病的病毒，狂犬病病毒， 甲型肝炎病毒。特别是甲型肝炎病毒，病毒不但易感，且病毒产量高。将 病毒分别接种Walvax-2细胞株，在35-37℃常规培养下，就能生产大量的 病毒疫苗原液；病毒原液通过灭活，浓缩，去杂质，加入佐剂，就形成甲 型肝炎灭活疫苗。

实施例2用Walvax-2细胞株制备甲型肝炎灭活疫苗

2.1细胞工厂制备Walvax-2细胞

Walvax-2细胞20代复苏于T75瓶中，细胞活率99%以上，37℃±0.5℃密闭 培养，直至细胞覆盖培养生长面，用0.25%胰蛋白酶消化，以1:2的分种率传代 培养，至可用于生物反应器中大规模生产细胞量。将细胞消化后收集至三角瓶中 等待接种病毒。细胞培养液中细胞生长培养基为含体积百分比为10%新生牛血清 的MEM营养液。

2.2Walvax-2细胞接种HAV病毒

收集好的Walvax-2细胞取样计数，调细胞浓度并接种甲型肝炎病毒YN5株 CCTCC NO:V200104，感染复数MOI为0.5，于37℃条件下吸附30min，并不 时摇动，使病毒充分接触细胞。

2.3Walvax-2细胞大规模生产HAV

提前将硅化好的生物反应器及微载体高压灭菌，通过补液泵将细胞培养液灌 入反应容器中，溶液的加入量为反应器体积的70%，微载体10g/L溶液，pH在 6.5～7.5之间，搅拌速度为40rpm，平衡反应器及微载体系统，使环境适于培养 Walvax-2细胞。

将实施例2中2.2的HAV病毒吸附后的Walvax-2细胞转入生物反应器中培 养，接种浓度为10⁵个/ml。以临界离底速度搅拌，使细胞吸附于微载体后，调整 转速为40rpm，培养Walvax-2细胞在微载体上形成单层，培养系统为细胞培养 液，通过灌注方式培养。待每个微载体的细胞贴壁率达80%以上时，将培养系统 调整为病毒维持液继续培养。病毒维持液中病毒生长培养基为含体积百分比为 2%新生牛血清的MEM营养液。初期维持0.3～1.0培养体积/天，随着细胞病毒 在生物反应器中培养时间的增加，逐步增加更换的溶液体积，调整至0.5～2.5 培养体积/天。维持液的更换速度可依据溶液系统中乳酸及葡萄糖含量等检测结 果的变化调整。以15L生物反应器为例，参数为pH为7.0～7.4，溶氧浓度为50%， 搅拌速度为45rpm，温度为35℃±0.5℃，培养28天收获。结果如表1所示，甲 肝病毒滴度随培养时间的增长而提高，在28天的时候滴度达到最高。

表1生物反应器培养Walvax-2细胞及上清液中HAV滴度

2.4灭活甲肝疫苗的制备

在本发明提供的甲肝灭活疫苗制备工艺，收集生物反应器培养消化后获得的 细胞病毒液，冷却至4℃。并在4℃条件下超声破碎细胞，超声频率为600～750 赫兹，每次超声时间为10s，间隔4s。细胞破碎率达95%以上时即可。收集细胞 病毒混合液，离心6000rpm，20min，收集上清液。向上清液中加入氯仿抽提， 体积比为1:1，混匀，4℃条件下抽提液离心，8000rpm，5～10min，离心后明显 可见混合液分为上下两层，收集上层清液。根据抽提效果抽提3～5次，收集抽 提后溶液。

采用100kDPall膜对抽提后收集的溶液超滤浓缩至原体积的1/5，然后再采 用0.01M的PBS恢复到原体积，继续采用0.01M的PBS超滤浓缩至原体积的1/5， 如此操作，反复3次，最后一次浓缩到原体积的1/10，浓缩液过滤澄清。0.2M 的NaCl平衡Sepharose4Fast Flow琼脂糖凝胶柱（GE XK50/100），流速为13 ml/min，平衡5～10个柱体积后，测定出液端pH，pH在7.0～7.4之间，即可上 样。

将上述浓缩液加入已平衡好的Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱上，上样量为 80ml，用0.2M的NaCl流洗，流速约8ml/min，在线检测波长为280nm的紫外 吸光值变化，分段收集峰的流出液。经ELISA试验检测，收集纯化后的HAV病 毒液，加入终浓度为200μg/ml甲醛灭活，以1:4000比例,37～40℃灭活12天。 灭活病毒原液经0.2μm除菌过滤，即为灭活的HAV原液。

在本发明中公开的甲肝灭活疫苗，调整HAV含量并添加保护剂，分装，最终 使每剂疫苗含纯化的灭活HAV病毒4800EU/ml。

在本发明中冻干甲肝疫苗采用常规冻干方法，将原液与保护剂的混合液，分 装在1.0ml/支的西林瓶中，-40℃预冻8小时，-10～-28℃真空干燥24小时，20～ 28℃干燥6小时，西林瓶封口压盖。

实施例3不同浓度甲肝灭活疫苗的免疫原性检测

采用小鼠体内效力检测甲肝灭活疫苗的免疫原性。ED50为半数有效量，指疫 苗在一群动物中引起半数动物特异性抗体阳性反应的剂量。同一种动物在不同疫 苗或相同疫苗不同含量中，ED50值越低越说明某动物产生特异性抗体的能力越 高。

采用本发明的生产方法制备一批甲肝灭活疫苗，批号为20110403，病毒滴度 为40960EU/ml，调整甲肝抗原含量分别为2000EU/0.5ml、2400EU/0.5ml、2800 EU/0.5ml及3200EU/0.5ml。小鼠选取4～6周龄的ICR小鼠260只（SFP级）。 每个抗原浓度的甲肝灭活疫苗（含Al(OH)3佐剂（1.0mg/ml）与不含Al(OH)3 佐剂）分别作4倍系列稀释，各稀释3个稀释度，每个稀释度免疫10只小鼠。 同时设阴性对照组－第9组，10只小鼠免疫生理盐水；佐剂对照组－第10组， 10只小鼠免疫1.0mg/ml的Al(OH)3佐剂。各组接种样品体积均为0.5ml/只，免 疫28天后采集并分离血清，-4℃保存备用。采用甲型肝炎病毒抗体（HAV Ab） 酶联免疫试剂盒检测，诊断试剂由北京万泰生物药业有限公司生产。

结果如表2所示，当甲肝病毒抗原含量为2400EU/0.5ml时，ED50最低，即 特异性抗体应答能力最强。1.0mg/ml Al(OH)3佐剂可提高本方法制备的甲肝灭 活疫苗在小鼠体内的效力检测结果。

表2不同抗原量的甲肝灭活疫苗在小鼠中的体内效力检测结果

实施例4甲肝灭活疫苗与现有甲肝疫苗的小鼠体内效力对比

选取4～6周龄的ICR小鼠190只，随机分成七组。前三组作为试验疫苗组， 30只/组，后三组作为对照疫苗组，30只/组，第七组为阴性对照组，10只/组。 实验疫苗组小鼠接种的疫苗采用本发明所述的甲肝灭活疫苗，采用甲肝病毒 HZD接种新人源二倍体细胞Walvax-2细胞，经过生物反应器培养，收获，纯化， 灭活并加入Al(OH)3佐剂制成，0.5ml/支，含灭活甲肝病毒2400EU，Al(OH)3 终浓度为1.0mg/ml，连续生产三批，批号为：20111007、20111108及20111209。 每个批号的甲肝灭活疫苗（含Al(OH)3佐剂1.0mg/ml）作4倍系列稀释，共稀 释3个稀释度，每个稀释度免疫10只小鼠，共90只。对照疫苗组小鼠接种的疫 苗为史克公司（GSK）生的甲肝灭活疫苗（批号为YHAVB440BA（2次试验） 及YHAVB483AA），0.5ml/支，每个批号的甲肝疫苗作4倍系列稀释，共稀释3 个稀释度，每个稀释度免疫10只小鼠，共90只。每支抽取0.5ml免疫小鼠，含 甲肝灭活病毒720El.U/0.5ml。阴性对照组，10只小鼠，每支免疫0.5ml生理盐 水，结果见表3。

对结果进行统计学分析，结果显示两种甲肝灭活疫苗的抗体反应明显不同， 本发明的生产方法制备的甲肝灭活疫苗产生的ED50显著低于GSK的甲肝灭活 疫苗（P<0.05）。由于ED50检测值越低说明ICR小鼠的抗体应答水平越高，因 此本发明的甲肝灭活疫苗的特异性抗体应答能力强于GSK的甲肝疫苗。

表3冻干甲肝灭活疫苗的小鼠体内效力检测与现有甲肝疫苗效力对比