与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记

摘要

本发明提供了一种与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该标记片段大小为194bp；本发明还提供了用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，引物对序列分别如SEQ ID NO.2、3所示；本发明同时提供了上述分子标记或引物对在检测和定位大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01方面的应用。本发明的分子标记进一步定位了大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01，标记的特异性强、稳定性高。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种与大白菜TuMV抗性基 因TuRBCS01紧密连锁的分子标记。

背景技术

芜菁花叶病毒病（Turnip mosaic virus,简称TuMV）属马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马 铃薯Y病毒属(Potyviruse Y)，主要通过蚜虫或汁液接触传毒。TuMV是马铃薯Y病毒科中 寄主范围最广、危害最大的病毒，在世界范围内分布相当广泛，除南极洲外，各大洲均有 分布，而且寄主范围十分广泛，可侵染43个科156个属的318种的双子叶植物(包括十字花 科、菊科、藜科、豆科、石竹科等)和部分单子叶植物（Walsh and Jenner2002）。在我国大 白菜生产中，平均每年造成5%的产量损失，有些年份减产10%以上，病害严重的地块几乎 绝收。该病防治困难，化学防治效果不理想，最有效且可持续的防治措施就是培育抗病品 种（Hughes et al.2002）。利用分子标记辅助选择或通过基因工程手段改良或创新种质，可 大大加快育种进程，是现代育种的发展趋势。

研究表明，大白菜芜菁花叶病毒的遗传规律十分复杂（谭其猛1980；Provvidenti1980； Leung and Williams1983；钮心恪1984；Suh1995；闫瑾琦2000；Yoon et al.1993；韩和平 2003；Rusholme等2007；潘春清2007；张晓伟等2009；屈淑平等2009；Li et al.2011； 李巧云等2012；钱伟等2012），在多个位点上存在多种变异。

已定位在白菜上的TuMV抗性基因TuRB0lb(Rusholme et al.2000)、retr01和ConTR0l （Rusholme et al.2007）以及retr02（Qian et al.2013）分别位于第6、4、8和4号染色体 上。

本研究室已经对大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)及大白菜及芸薹属中与抗性有关的EST 序列进行了研究（大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)EST-SSR信息分析与引物筛选，中国农学 通报2012,28(10):121-126），为研究大白菜抗性进行奠定了基础。随后，本研究室以抗病材 料‘8407’和感病材料‘冠291’为亲本，构建分离群体，利用上述的方法，鉴定出一个 新的TuMV抗性基因，命名为TuRBCS01；已利用BSA法将该基因定位于白菜A基因组4 号染色体上的两个标记SAAS_mDN192117a_159(6.3cM)和SAAS_mGT084561_233(6.1cM) 之间约4.61Mb的区域（6423740～11033899）（大白菜抗芜菁花叶病毒（TuMV）基因分子 标记筛选与定位，青岛农业大学硕士学位论文，张晓亮，2012年6月）。与其它定位在白菜 4号染色体上的TuMV隐性抗性基因retr01和retr02不同的是，该TuRBCS01基因为显性基 因，位于白菜基因组4号染色体上8284905-10261992之间约1.98Mb的区域。相对于隐性 抗病基因，显性基因在育种上的应用更为便捷，只需亲本之一为抗病材料即可直接应用。 鉴于此，对显性TuMV抗性基因TuRBCS01进行精细定位，获得与TuRBCS01紧密连锁甚 至共分离的分子标记，将为TuRBCS01的克隆奠定基础，同时为基因TuRBCS01的辅助选择 提供更有效的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标 记。

本发明提供了一种与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记，该分子 标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该标记片段大小为194bp。

本发明还提供了一种扩增与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记的 引物对，该引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所 示。

本发明还提供了一种与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记的检测 方法，该方法以抗、感TuMV的大白菜材料的基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到能 同时鉴定父本、母本及其杂合体基因型的特异谱带，该特异谱带包括携带抗性基因的植株 特异谱带和不携带抗性基因的植株特异谱带，所述携带抗性基因的植株谱带为核苷酸序列 如SEQ ID No.1所示的分子标记。

所述不携带抗性基因的植株谱带的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明通过对上述抗病标记及基因TuRBCS01另一侧标记的测序及序列比对，将基因 TuRBCS01定位于白菜基因组4号染色体上SSR标记BrSSR4055和InDel标记BrID10723 之间（8,284,905-10,261,992）约1.98Mb的区域。利用上述标记及物理位置信息，设计新的 SSR、InDel或SNP引物，可实现对该基因的进一步精细定位或图位克隆。

本发明具备的有益效果在于：

1）本发明的分子标记进一步定位了大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01。标记的特异性 强、稳定性高，并且标记的筛选方法简便快捷，对检测设备和引物模板质量要求不高，具 有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化的优点。非常适合现 代农业中的分子育种趋势。

2）本发明为大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01的图位克隆提供了非常重要的分子遗传 学信息。

3）本发明的大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01的分子标记引物应用于育种工作中，将 大大降低TuMV流行对大白菜生产造成的经济损失，有益于降低生产成本，具有很大的应 用潜力和较高的经济价值。

4）本发明筛选出与基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记，可以有效的用于基因 TuRBCS01的标记辅助选择，所述分子标记与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01的连锁距离 为1.3cM，利用该标记在白菜基因组中的物理位置信息，可以进行基因TuRBCS01的精细 定位，或通过染色体步移法接近该基因，从而提高选择的准确性，缩短育种年限，同时也 为基因TuRBCS01的克隆打下基础。

附图说明

图1为本发明所涉及的引物BrSSR4055F/BrSSR4055R在两亲本及抗、感池中的扩增 结果，P1是亲本‘8407’，P2是亲本‘冠291’，A是感池，B是抗池。因为抗病基因是显 性基因，用的群体又是BC1群体，所以抗池是杂合谱带。

图2基因TuRBCS01的标记连锁图，左侧数字代表连锁距离，单位是cM。

图3为引物组合BrSSR4055F/BrSSR4055R在‘冠291’ב8407’ב冠291’回交 群体部分单株中的扩增结果。P1是亲本‘8407’，P2是亲本‘冠291’，49-63是15个回交 单株，其中编号为49、53、55、57、58、60、61、62、63的单株扩出的是感病谱带，编号 为50、51、52、54、56、59的单株扩出的是抗病杂合谱带。

图4为利用引物组合BrSSR4055F/BrSSR4055R扩出的抗病标记和感病标记的序列比 对结果。图中示出两序列在多个位置有差异，分别为感病标记在32-43处缺失部分重复序列 CATCATCATCAT，在71、72、81、92、97和131处分别有C→T、C→A、C→T、T→A、 A→T和G→C的碱基替换，在102-107处缺失部分短重复序列TTCTTC；‘8407’为抗病亲 本，‘冠291’为感病材料，Consensus为两序列的一致序列。

其中上述的BrSSR4055F/BrSSR4055R引物序列分别为SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。

具体实施方式

具体结合实施例对本发明作进一步的说明，但不限于实施例所述的内容。

实施例1与基因TuRBCS01紧密连锁分子标记的筛选

植物材料：本发明所用的抗病亲本材料为大白菜国家级TuMV抗源材料‘8407’，感病 材料为‘冠291’，分离群体为‘冠291’ב8407’ב冠291’回交群体。将上述材料播于 8cm塑料育苗钵中，置于防虫温室内培养。培养条件为：白天温度20-28℃，夜间温度15-19℃， 半遮光9000-10000lux，湿度为60%左右，及时浇水，定期防治蚜虫。

毒源材料：TuMV的C4株系，引自中国农科院蔬菜花卉研究所，用前一个月在感病材 料上繁毒培养。

TuMV接种鉴定：待供试材料长到三叶一心时，分别对两亲本及BC1代群体接种 TuMV-C4。接种方法采用摩擦接种和剥叶接种相结合的方法，具体如下：首先，对所有单 株进行摩擦接种，方法参见李巧云等（2009），2-3周后进行抗病性鉴定。根据抗病性鉴定 结果，再对那些未发病的单株进行剥叶接种，方法是：剥除大部分外叶，只留最里面的三 片叶子，然后对新长出的两片叶摩擦接种TuMV-C4。2-3周后再进行抗病性鉴定和剥叶接 种，直至感病亲本所有单株全部发病。单株TuMV抗病性鉴定采用生物学观察的方法，鉴 定标准参照GB/T19557.5-2004。综合分析多次的鉴定结果，确定每个单株的抗性，进而计 算群体的病情指数或抗、感单株的分离比例，分析其抗性归类及抗性遗传。结果表明，在 157个单株中，抗病单株75株，感病单株82株，χ²_c=0.31<χ²_0.05=3.84，符合1:1的分离比 例。

引物来源：根据张晓亮（2012）中对大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01的初步定位结 果，参考白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/上的标记信息，在该基因两侧标记 SAAS_mDN192117b_196和SAAS_mGT084561a_233之间搜索到标记8个，分别为 BrID10645、BrID90211、BrID90209、BrID10639、BrID10637、BrID90219、BrID10723和 BrID10747。根据上述两标记之间的基因组序列设计SSR引物31对，编号为 BrSSR4040～BrSSR4070。引物设计具体方法为选取600bp左右上述基因组序列，登陆网站 http://www.gramene.org/gremene/searches/ssrtool，利用软件SSRIT（Simple Sequence Repeat  Identification Tool）在线筛选SSR。筛选标准为：单核苷酸重复不少于10次，双核苷酸重 复不少于6次，三核苷酸重复不少于4次，四、五、六及以上核甘酸重复不少于3次。根 据SSR两端的序列，利用primer premier5.0软件设计引物。引物由华大基因生物公司合成。 上述8个标记对应的引物序列及自己设计的31对引物序列（表1，其中上位序列为正向， 下位序列为反向）用于基因TuRBCS01紧密连锁分子标记的筛选。

表1用于标记筛选的31对SSR引物序列

基因组DNA的提取和检测：本发明中所用材料的基因组DNA用改良的CTAB法提取， 具体步骤如下：

①.称取0.2g幼嫩叶片，用双蒸水洗净后放入EP管，加液氮迅速研磨成粉末，加入650ml 预热(65℃)的提取缓冲液2×CTAB，充分混匀，65℃水浴lh，其间每15min轻柔摇匀一次。

②.将离心管取出冷却至室温，12000rpm离心10min。（注意温度保持在18℃以上）

③.取上清，加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：l)，充分混匀，冰浴15min，低温4℃ 12000rpm离心10min。

④.取上清，加入2倍体积的预冷异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置10～20min。低温4℃ 12000rpm离心10min。

⑤.小心弃去上清，加入70%乙醇800μL洗涤沉淀2次，轻弹管壁将沉淀弹松。室温下 微干，溶于600μL ddH2O中。

⑥.除去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀2次，吹干后溶于30-50μL ddH2O中备用。

提取的基因组DNA用0.8%的琼脂糖胶电泳检测，并用分光光度计测定浓度和质量。然 后用去离子水将其稀释至50ng/μL。

抗、感池的构建：选取BC1分离群体中的极端抗病单株和极端感病单株各10株的基因 组DNA，各自混合后构建抗、感池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析；图1为本发明 所涉及的引物BrSSR4055F/4055R在两亲本及抗、感池中的扩增结果。

PCR扩增及扩增产物检测：PCR扩增反应体系为：20μL反应体系中包括正、反向引物 各0.5μM，0.25mM dNTPs，Taq DNA聚合酶0.5U，70ng模板DNA，10×PCR Bufffer （含Mg²⁺）2.0μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，57℃退火45s， 72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物在8%的聚丙烯酰 胺凝胶（非变性）上检测，每孔点样2μl，175V恒压电泳1.5-2h。电泳后银染检测结果。 结果表明，以两亲本基因组DNA为模板，利用白菜基因组中目的区域内的8个标记对应的 引物进行扩增，最终8对引物均能成功扩增，但只有引物BrID10723在两亲本之间扩出多 态性，进一步在抗、感池中扩增，也能扩出一致多态性，最后在BC1群体157个单株中进 行验证，结合抗病性鉴定结果，证实该位点与基因TuRBCS01存在连锁关系，在157个单 株中，152个单株的抗病性鉴定结果与引物BrID10723的扩增结果一致，只有47号、54号、 67号、83号和152号5个单株发生了交换。利用31对SSR引物扩增两亲本基因组DNA， 结果表明，能够成功扩增的有29对，其中有7对引物在两亲本间扩出多态性，进一步在抗、 感池中扩增，只有三对引物BrSSR4041、BrSSR4055和BrSSR4068在亲本和抗、感池间扩 出一致多态性，利用这三对引物扩增BC1群体157个单株的基因组DNA，结果显示上述三 个位点与基因TuRBCS01存在连锁关系，利用引物BrSSR4041的扩增结果表明，在157个 单株中，只有48号、54号、83号、111号和142号5个单株发生了交换；利用引物BrSSR4055 进行扩增，则只有48号、54号、83号和88号4个单株发生了交换；利用引物BrSSR4068 进行扩增，14号、15号、47号、54号、83号和120号6个单株发生了交换；图3为引物 组合4055F/4055R在‘冠291’ב8407’ב冠291’回交群体部分单株中的扩增结果， 其中编号为49、53、55、57、58、60、61、62、63的单株扩出的是感病谱带，编号为50、 51、52、54、56、59的单株扩出的是抗病杂合谱带。

数据统计与分析：筛选出在两亲本和抗、感池间具有多态性的引物，在BC1群体157 个单株中进行验证，并对各单株带型进行统计，感病谱带记做“A”，抗病谱带记做“H”, 谱带不清或无扩增谱带记做“-”。用JoinMap4.0软件进行遗传连锁分析，计算连锁距离， 确定各标记与基因的相对位置。结果如图2所示，其中引物BrSSR4055扩增位点与基因 TuRBCS01的连锁距离只有1.3cM，为紧密连锁关系；表2为上述BC1群体部分单株的抗 病性鉴定结果和利用引物组合BrSSR4055F/BrSSR4055R的扩增结果。

表2BC1群体部分单株的抗病性鉴定结果和引物BrSSR4055的扩增结果

单株编号 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 TuMV抗性 S R R R S S S R S S R S S S S 引物BrSSR4055扩增带型 A H H H A H A H A A H A A A A

注：R表示抗病，S表示感病，A表示感病谱带，H表示抗病杂合谱带

实施例2标记测序及基因定位

PCR产物的克隆测序

电泳确认目的谱带被扩增后，再用高保真酶扩增，取1μl PCR扩增产物加1μl pEasy-Blunt 载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在 含50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取 阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。引物BrSSR4055在抗病亲本 ‘8407’中扩出的谱带测序结果如SEQ ID No.1所示，大小为194bp，在感病亲本‘冠291’ 中扩出的谱带如SEQ ID No.4所示，大小为176bp。

序列比对与分析

将上述标记序列与已发表的白菜全基因组序列（http://brassicadb.org/brad/）进行比对， 确定各标记在染色体上的具体位置，再根据各标记与大白菜TuMV抗性基因的关系，实现 对目的基因的定位。如图2所示，基因TuRBCS01位于两标记BrID10723和BrSSR4055之 间。将抗病标记BrSSR4055的序列与白菜基因组序列(v1.5)进行比对，结果显示该标记位于 白菜4号染色体上8,284,712-8,284,905之间。将抗病标记BrID10723的序列（详见 http://brassicadb.org/brad/）与白菜基因组序列（v1.5）进行比对，结果显示该标记位于4号 染色体上10,261,992-10,262,091之间。感病亲本扩增谱带与白菜基因组序列进行比对，未出 现突变。因此，基因TuRBCS01位于白菜基因组4号染色体上8,284,905-10,261,992之间约 1.98Mb的区域；图4为利用引物组合BrSSR4055F/BrSSR4055R扩出的抗病标记和感病标 记的序列比对结果。图中示出两序列在多个位置有差异，分别为感病标记在32-43处缺失部 分重复序列CATCATCATCAT，在71、72、81、92、97和131处分别有C→T、C→A、C→T、 T→A、A→T和G→C的碱基替换，在102-107处缺失部分短重复序列TTCTTC。

两个基因（retr02和TuRBCS01）均定位于A04染色体上，但比较两个基因的物理位置， 基因retr02被定位于scaffold000104上，位于InDel标记BrID90211(8,150,733-8,150,926， v1.5)的上游(Qian et al.2013)；而基因TuRBCS01的物理位置为8,284,905–10,261,992（v1.5）， 位于标记BrID90211的下游，因此，这两个基因位于不同的区域，进一步证明基因TuRBCS01 是一个新基因。

本发明所采用的BrSSR4055F/BrSSR4055R用于扩增抗病亲本扩出的SEQ ID No.1谱 带的引物对。利用上述对基因TuRBCS01的定位结果，可进行该基因的进一步精细定位及 图位克隆；利用该基因两侧紧密连锁的分子标记，可在育种过程中进行该基因的分子标记 辅助选择，有助于抗TuMV大白菜品种的选育；利用上述基因TuRBCS01两侧的紧密连锁 标记为前景标记，选取白菜基因组中各个染色体上的部分标记为背景标记，构建珍贵育种 材料（如‘冠291’）的近等基因系，可改良或创新种质。