一株高产克拉维酸的棒状链霉菌及其应用

摘要

本发明公开了一株高产克拉维酸的棒状链霉菌及其应用。本发明所提供的高产克拉维酸的棒状链霉菌具体为棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7915。本发明以棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116为出发菌株，对其进行代谢工程改造，诱变后得到棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915。实验证明，发酵培养该菌株，其产克拉维酸的量达到2.25g/L发酵液，较出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116提高了约51%，可见棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915具有广阔工业应用的前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株高产克拉维酸的棒状链霉菌及其应用。

背景技术

随着抗生素的大量使用，病原菌耐药性问题日益严重。青霉素、头孢菌素等β-内 酰胺类抗生素的滥用导致部分病原菌产生β-内酰胺酶，从而降解该类抗生素产生耐药 性。克拉维酸（clavulanic acid），又称棒酸，是棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus） 产生的次级代谢产物。克拉维酸单独作用时抗菌活性很弱，但它具有独特的3R，5R 立体构像，使其具有光谱的、不可逆的β-内酰酶抑制活性，也是第一个被发现并成功 应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂。临床应用中，克拉维酸常与β-内酰胺类抗生素如阿 莫西林（amoxicillin）、替卡西林（ticarcillin）联合用药，制成酶抑制剂-抗生素的联合 制剂，可在不同程度上保护β-内酰胺类抗生素不被β-内酰胺酶分解失活，从而提高该 抗生素对产酶耐药菌的抗菌活性，提高临床疗效。由于其重要的临床应用价值，克拉 维酸的市场需求广大。目前克拉维酸的工业生产主要依靠微生物发酵。因此，改造克 拉维酸产生菌获得高产工程菌具有重要的工业应用价值。

野生型棒状链霉菌的克拉维酸产量很低，远远不能满足工业发酵的需要，所以目 前工业应用的菌株往往都是通过多轮物理、化学等诱变筛选得到的诱变株。随着对克 拉维酸生物合成基础研究的深入，多种理性代谢工程改造手段成功的提高了野生菌株 的克拉维酸产量，但还是无法超越工业上广泛应用的诱变菌株。因此，以工业应用的 诱变菌株作为出发菌株，通过代谢工程改造的手段提高其克拉维酸产量具有重要的实 际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产克拉维酸的棒状链霉菌及其应用。

本发明所提供的棒状链霉菌具体为棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus） 16CF10。该菌株是以棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116为出发菌株，对其 进行代谢工程改造，诱变后得到的新菌株。该菌株已于2013年07月12日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No.7915。

本发明的再一个目的是提供一种菌剂。

本发明所提供的菌剂的活性成分为所述棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus） 16CF10 CGMCC No.7915。

所述棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915或所述菌 剂在制备克拉维酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的还一个目的是提供一种制备克拉维酸的方法。

本发明所提供的制备克拉维酸的方法，可包括如下步骤：发酵培养所述棒状链霉 菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915，收集发酵产物，获得克拉维 酸。

在上述方法中，所述发酵培养的培养基（发酵培养基）的组成如下：黄豆粉20 ±2g/L，糊精10±1g/L，甘油15±1mL/L，KH₂PO₄0.6±0.1g/L，3-(N-吗啡啉)丙磺 酸（MOPS）8±1g/L，微量元素溶液1±0.2mL/L，余量为水；pH为7.0±0.2；所述微 量元素中，溶剂为水，溶质及其浓度如下：FeSO₄·7H₂O1.0±0.2g/L，MnCl₂·4H₂O1.0 ±0.2g/L，ZnSO₄·7H₂O1.0±0.2g/L，CaCl₂·3H₂O1.3±0.2g/L。

在本发明中，所述发酵培养的培养基（发酵培养基）的组成具体如下：黄豆粉 20g/L，糊精10g/L，甘油15mL/L，KH₂PO₄0.6g/L，3-(N-吗啡啉)丙磺酸（MOPS）8 g/L，微量元素溶液1mL/L，余量为水；pH为7.0±0.2；所述微量元素中，溶剂为水， 溶质及其浓度如下：FeSO₄·7H₂O1.0g/L，MnCl₂·4H₂O1.0g/L，ZnSO₄·7H₂O1.0g/L， CaCl₂·3H₂O1.3g/L。

在上述方法中，在发酵培养前，还包括利用种子培养基培养所述棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915获得种子液的步骤，再将所述 种子液接种到上述发酵培养基中进行发酵培养。

所述种子培养基与所述发酵培养基的组成完全相同。

所述“利用种子培养基培养所述棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10  CGMCC No.7915”，培养温度为28℃，培养时间为48h，培养方式为旋转震荡培养（转 速为250rpm，旋转半径与NBS Excella E25型号摇床的旋转半径相同）。

在上述方法中，所述发酵培养可为摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养的培养时间 为48-96h（如72h）；所述摇瓶发酵培养的培养温度为28℃；所述摇瓶发酵培养的震荡 转速为200-300rpm，如250rpm，（旋转半径与NBS Excella E25型号摇床的旋转半径相 同）。

在本发明的一个实施例中，进行所述摇瓶发酵培养时，所用摇床的型号为NBS  Excella E25。

在上述方法中，所述发酵培养也可为发酵罐发酵培养；所述发酵罐发酵培养的培 养时间为6-7天（如6天）；所述发酵罐发酵培养的培养温度为28℃；所述发酵培养 过程中的通气量为0.5-1.0V／V·min，如0.5V／V·min（所述通气量以每分钟内通过单 位体积培养液的空气体积比来表示）；所述发酵培养过程中的搅拌转速为300-500rpm， 如400rpm。

在本发明的一个实施例中，进行所述发酵罐发酵培养时，所用发酵罐的型号为 NBS BioFlo/CelliGen 115。

本发明的又一个目的是提供所述菌剂的制备方法。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915作为活性成分，得到所述菌剂。

本发明以棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116为出发菌株，对其进行代 谢工程改造，诱变后得到棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No. 7915。发酵罐发酵培养该菌株144h（6天），发现其产克拉维酸的量达到2.25g/L发酵 液，较出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116提高了约51%，该菌株 具有广阔工业应用的前景。

保藏说明

菌种名称：棒状链霉菌

拉丁名：（Streptomyces clavuligerus）

菌株编号：16CF10

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年07月12日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7915

附图说明

图1为摇瓶发酵培养棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No. 7915发酵72h后发酵液中克拉维酸产量的测定结果。以发酵液中克拉维酸色谱峰的峰 面积表示。

图2为棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915菌株发 酵液和克拉维酸标准品溶液的高效液相色谱图。其中，1表示棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915菌株发酵液；2表示克拉维酸标准品溶液。

图3为发酵罐发酵培养过程中不同时间点取样的发酵液中克拉维酸产量及棒状链 霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915的生长情况测定结果。其 中，A表示出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116发酵液中克拉维酸 色谱峰的峰面积；B表示棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No. 7915发酵液中克拉维酸色谱峰的峰面积；C表示出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）70116利用二苯胺法测定生物量的光吸收值（A595）；D表示棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915利用二苯胺法测定生物量的光 吸收值（A595）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116：为“李佳.1.报告基因法筛选克拉 维酸高产菌2.报告基因法比较两种放线菌启动子的活性.首都师范大学，硕士论文， 2009”一文中记载的“棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）工业菌株70116”，为 海正药业赠送。

克拉维酸标准品：Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为33454。

实施例1、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10的获得及鉴定

一、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10的获得

利用组成型表达的红霉素启动子（ermE*p）通过整合型载体对靶基因glpF1和 ceas2在工业菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116中分别进行过表达， 研究其对克拉维酸产量的影响。结果表明这些靶基因的单独过表达都有利于工业菌株 中克拉维酸产量的提高。

接着，本发明的发明人构建同时监测双靶点表达的报告质粒，将靶基因glpF1与 ceas2两两组合后构建载体导入工业菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116。 接着通过NTG诱变后筛选报告基因同时高表达的诱变株，得到其中一株重组菌，将其 命名为菌株16CF10。

二、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一得到的菌株16CF10：

1、形态学特征鉴定

接种YD固体培养基，培养过程中观察形态变化。3天左右长出基内菌丝，5-7天 产生白色气生菌丝，10-14天产生灰绿色孢子。

2、生理生化特性分析

革兰氏阳性细菌。

3、RpoD基因和gap1基因序列同源性分析

对菌株16CF10的rpoD基因和gap1基因进行序列测定，其RpoD基因的测序结 果为序列表中序列1，其gap1基因的测序结果为序列表中序列2。同时对出发菌株棒 状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116的rpoD基因和gap1基因序列进行测序。

在线BLAST比对的结果表明，菌株16CF10的rpoD基因和gap1基因的序列与 出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116的rpoD基因和gap1基因序列 同源性为100%，同时与NCBI上公开的野生型棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus） ATCC 27064菌株的rpoD基因（GenBank：ADWJ01000053.1）和gap1基因（GenBank： DQ178995.1）序列同源性也为100%。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和rpoD和gap1基因序列同源性分析结果，将 步骤一得到的菌株16CF10鉴定为棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）。该菌株已 于2013年07月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7915。

实施例2、发酵棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915 生产克拉维酸

固体YD培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：酵母提取物（Difco公司产品） 4.0g/L；麦芽糖提取物（OXID公司产品）10g/L；葡萄糖4.0g/L；MgCl₂ 2.0g/L； CaCl₂ 1.5g/L；琼脂2.0g/L；pH7.5。

种子培养基（与发酵培养基相同）：黄豆粉20g/L；糊精（国药集团化学试剂有限 公司产品，其产品目录号为69009992）10g/L；甘油15mL/L；KH₂PO₄ 0.6g/L；3-(N- 吗啡啉)丙磺酸(MOPS)8.0g/L；微量元素1mL/L；pH7.0±0.2。各浓度为相应组分在 培养基中的终浓度。其中，微量元素配方如下（100ml）：FeSO₄·7H₂O 100mg； MnCl₂·4H₂O 100mg；ZnSO₄·7H₂O 100mg；CaCl₂·3H₂O 130mg；余量为水。

一、摇瓶培养棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915 生产克拉维酸

1、种子液培养

将实施例1得到的棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No. 7915接种到固体YD培养基上，于28℃培养7天后收集孢子接种到种子培养基中， 250rpm（摇床型号NBS Excella E25），28℃培养48h后得到种子液。同时设置出发菌 株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116作为对照。

2、摇瓶培养

将步骤1得到的种子液接种到摇瓶（250mL摇瓶中含50mL发酵培养基）中进行 发酵培养，接种量为5%（体积分数）。

发酵条件：温度28℃，旋转震荡培养，转速250rpm（摇床型号NBS Excella E25）， 发酵72h。

发酵结束后测定发酵液中克拉维酸产量。实验重复三次，结果取平均值。

3、测定方法

采用高效液相色谱法测定发酵液中克拉维酸的产量，具体如下：

A.色谱条件

色谱条件：色谱柱为反相C18柱；流动相为6%（体积百分含量）甲醇+94%（体 积百分含量）0.1M磷酸二氢钠水溶液（冰醋酸调节pH3.68）；洗脱程序为等度洗脱； 流速为1ml/min；进样体积为50μL；检测波长为312nm。

B.待测发酵液中克拉维酸含量的测定

发酵样品衍生处理：配置咪唑试剂（咪唑试剂：溶解8.25g咪唑到65ml水中， 用5M盐酸调pH到6.8±0.05后，用水增容至100ml），待测发酵液与等体积咪唑试剂 混合后，37℃反应30min后HPLC分析克拉维酸产量。

将经过如上处理的待测发酵液按照步骤A所述的色谱条件进行高效液相色谱分 析，以浓度确定的克拉维酸标准品溶液（用甲醇溶液配制）作为外标，根据克拉维酸 标准品溶液的浓度、对应色谱峰峰面积，以及待测发酵液中保留时间与克拉维酸标准 品一致的色谱峰的峰面积，计算待测发酵液中的克拉维酸含量。

4、测定结果

发酵液中克拉维酸（与克拉维酸标准品保留时间一致的组分，保留时间为12.5 min）色谱峰的峰面积如图1所示。计算所得发酵液中克拉维酸的含量结果如表1所示。 结果显示，棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915发酵液 中的克拉维酸产量为1.36g/L发酵液，这相比作为对照的出发菌株棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）70116的产量（0.79g/L发酵液）提高了约72.2%，经统计 学分析，两者差异极显著。

表1摇瓶发酵培养棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915

所得克拉维酸产量结果（单位：g/L发酵液）

菌株 重复1 重复2 重复3 平均值 16CF10 1.30 1.40 1.38 1.36 70116 0.78 0.73 0.86 0.79

二、发酵罐培养棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915 生产克拉维酸

1、种子液培养

将实施例1得到的棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No. 7915接种到固体YD培养基上，于28℃培养7天后收集孢子接种到种子培养基中， 250rpm（摇床型号NBS Excella E25），28℃培养48h后得到种子液。同时设置出发菌 株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116作为对照。

2、发酵培养

将步骤1得到的种子液接种到发酵罐（7L发酵罐含3L发酵培养基，发酵罐型号 NBS BioFlo/CelliGen115）中进行发酵培养，接种量为5%（体积分数）。

发酵条件：温度28℃，搅拌培养，搅拌转速为400rpm，通气量0.5V／V·min（以 每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比表示），发酵6天。

发酵过程中每隔24h取样一次测定发酵液中克拉维酸产量及棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915的生长情况。实验重复三次， 结果取平均值。

3、测定方法

（1）发酵液中克拉维酸产量的测定

采用高效液相色谱法测定发酵液中克拉维酸的产量，具体如下：

A.色谱条件

色谱条件：色谱柱为反相C18柱；流动相为6%（体积分数）甲醇+94%（体积分 数）0.1M磷酸二氢钠水溶液（冰醋酸调节pH3.68）；洗脱程序为等度洗脱；流速为1 ml/min；进样体积为50μL；检测波长为312nm。

B.待测发酵液中克拉维酸含量的测定

发酵样品衍生处理：配置咪唑试剂（咪唑试剂：溶解8.25g咪唑到65ml水中， 用5M盐酸调pH到6.8±0.05后，用水增容至100ml），待测发酵液与等体积咪唑试剂 混合后，37℃反应30min后HPLC分析克拉维酸产量。

将经过如上处理的待测发酵液按照步骤A所述的色谱条件进行高效液相色谱分 析，以浓度确定的克拉维酸标准品溶液（用甲醇溶液配制）作为外标，根据克拉维酸 标准品溶液的浓度、对应色谱峰峰面积，以及待测发酵液中保留时间与克拉维酸标准 品一致的色谱峰的峰面积，计算待测发酵液中的克拉维酸含量。

（2）棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915的生长情 况测定

采用二苯胺法测定生长状况，培养物与二苯胺试剂反应后在595nm处进行吸光度 测定，以此反应棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915的 生长情况。具体操作参见“Zhao,Y.,et al.(2013).A simplified diphenylamine colorimetric  method for growth quantification.Appl Microbiol Biotechnol,97(11):5069-5077”一文。

4、测定结果

（1）发酵液中克拉维酸产量

棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915菌株发酵液和 克拉维酸标准品溶液的高效液相色谱图如图2所示，从图中可以看出，棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915菌株发酵液中具有明显的与克 拉维酸标准品保留时间一致（12.5min）的色谱峰。

不同时间点取样的发酵液中克拉维酸（与克拉维酸标准品保留时间一致的组分， 保留时间为12.5min）色谱峰的峰面积如图3中的A和B所示。计算所得发酵液中克 拉维酸的含量结果如表2所示。结果显示，棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus） 16CF10 CGMCC No.7915和作为对照的出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）70116发酵液中的克拉维酸含量均在发酵培养的144h时达到最大值，此 时，棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915发酵液中的克 拉维酸产量为2.25g/L发酵液，这相比作为对照的出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）70116的产量（1.49g/L发酵液）提高了约51%，经统计学分析，两者差 异极显著。

表2发酵罐发酵培养棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915

所得克拉维酸产量结果（单位：g/L发酵液）

（2）棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915的生长情 况

不同时间点取样的发酵液中棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10  CGMCC No.7915以及出发菌株棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）70116的生长 情况结果如图3中的C和D所示，从图中可以看出，与出发菌株棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）70116相比，棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10  CGMCC No.7915的生长曲线与之差异不显著，且在发酵培养96h时发酵液中棒状链 霉菌（Streptomyces clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915和出发菌株棒状链霉菌 （Streptomyces clavuligerus）70116的含量均达到最大，维持到120h后菌株含量又均 开始下降（但发酵液中克拉维酸的含量仍在增加）。

综合以上结果表明：经过本发明的发明人改造得到的棒状链霉菌（Streptomyces  clavuligerus）16CF10 CGMCC No.7915菌株其生长情况基本未受影响，克拉维酸产量 明显提升，从而提高了菌株产克拉维酸的能力。