利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法

摘要

本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并按特定比例接种到柞蚕蛹或者米饭培养基获得高产子实体。同时传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，利用新的接种方法对蛹虫草菌株进行复壮和提高 子实体产量的方法。

背景技术

真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。据目前所知真菌交配系统包括同宗配合和 异宗配合两种。由同一孢子萌发的菌丝间能通过自体结合而产生有性孢子，这一自交可育的生殖方式称为 同宗结合，同宗结合还包括初级同宗结合和次级异宗接合两种。必须由不同性别的菌丝接合产生的双核菌 丝才具有结实性，可产生有性孢子，这种自交不育的有性生殖方式称为异宗结合，异宗接合还包括两极性 和四极性异宗接合。对真菌交配型的研究及减缓菌株退化，改良菌种具有重要作用。

蛹虫草(Cordyceps militaris)具有极高的药用价值，是一种异宗配合的子囊菌，异核体所产生的有性 后代中具有两种可亲和的交配型，即mat-alpha和mat-HMG两种交配型。研究表明，当菌株只含有其中一 类交配型不能够完成有性生活史，只有当同时含有这两种交配型时才能完成有型生活史，具备形成具有子 囊壳的子实体。因此，研究蛹虫草菌株在生长过程中所需的两种交配型的最优比例，对提高蛹虫草子实体 产量、退化菌株的复壮和减缓菌株菌株退化具有重要意义。

近年来，对蛹虫草交配型的报道和研究日益增多，但是有关蛹虫草两种交配型比例与菌株生长状况之 间关系的研究报道很少。继2005年Yokoyama等成功获得蛹虫草的mat-alpha和mat-HMG两种交配型基 因的全长序列后(序列号分别是AB194982和AB084257)，zhang等2013年利用子囊孢子弹射获得蛹虫草 单孢株后，PCR检测单孢株的交配型，将不同交配型单孢菌株混合培养得到的子实体产量是单一交配型 (mat-alpha或mat-HMG)菌株的5倍。但是Zhang等利用子囊孢子弹射获得单孢株的方法比较繁琐，且 准确度较低，同时Zhang等并没有找到高产子实体的两种交配型菌株的最优比例。

本发明通过对蛹虫草分生孢子单孢分离获得单孢菌株，PCR检测单孢株的交配型得到mat-alpha和 mat-HMG两种交配型菌株，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于柞蚕蛹上获得高产的子 实体，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于米饭培养基上获得高产的子实体，传代多次的 菌株单孢分离获得两种交配型单孢株后，按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米 饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。

本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并按特定比例接种到柞蚕蛹或 者米饭培养基获得高产子实体，这种方法在国内外未见报道。同时传代多次的菌株按照mat-alpha与 mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产 量，这一方法在国内外也未见有报道。

发明内容

本发明是提供了一种快速提高子实体产量的方法，同时克服了菌株传代多次导致子实体产量迅速降低 的问题。本方法可以直接用于生产，是一种提高子实体产量快速而又简洁的方法。

本发明通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG 两种交配型单孢株。

本发明利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养5 天后测摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型单孢株菌丝质量比。

本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种于柞蚕蛹上获得高产的子实体。

本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种于米饭培养基上获得高产的子实体。

本发明通过对传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种到柞蚕蛹或者米饭 培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。

附图说明

图1为孢子在20h刚萌发伸长，箭头所指为孢子。

图2为对不同单孢菌株的交配型PCR产物的检测，上面为mat-alpha(180bp)、下面为mat-HMG(210bp)。

图3为蛹虫草菌株接种到柞蚕蛹，从左到右依次为mat-alpha与mat-HMG菌株1二12的质量比接种、 原始蛹虫草混合菌株接种、单交配型菌株接种。

图4为蛹虫草菌株接种到米饭培养基，接种菌株顺序同图2。

图5为传代多次的蛹虫草菌株接种到柞蚕蛹，从左到右依次为：对传代多次蛹虫草菌株单孢分离获得 的mat-alpha与mat-HMG菌株按照1：12的质量比接种、传代多次的蛹虫草混合菌株接种、传代多次蛹虫 草菌株单孢分离后获得的单交配型菌株接种。

图6为传代多次的蛹虫草菌株接种到米饭培养基，接种菌株顺序同图4。

图7为按不同mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比例接种到柞蚕蛹体后生物转化率(横坐标为mat-alpha 与mat-HMG比例，纵坐标为生物转化率)。

具体实施方式

1、蛹虫草单孢株的获得

a、将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到PPDA培养基上，25℃培养15天，取少量分生 孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成 200个孢子/mL的孢悬液。

b、将直径为5mm的无菌玻璃纸圆片放置于90mm PPDA培养基平板上，用微量移液器取5μL孢子悬 浮液滴加在5mm的圆形玻璃纸中央。

c、25℃恒温箱培养20h至孢子刚萌发伸长，利用倒置显微镜依次查看圆片上孢子萌发情况，将只带 有一个孢子且已萌发出芽管的圆片转接至新的PPDA培养基平板中央，每个平板接1个孢子，25℃恒温箱 继续培养至单菌落，即为单孢株。

2、单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养

a、利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型，PCR引物参照2009年张等专利： mat-alpha(MAT-1F CGCATTCAGAAGTGAGTGCA MAT-1R ATATACCTTCGCGATCATTG)、mat-HMG (MAT-2F CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC MAT-2R GGGATGCCGTTCGAGGAGAG)。分别取 mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光25℃、200rpm/min，培养5d。

b、利用打散器打散菌液，分别检测两种摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型 单孢株菌丝质量比。

3、柞蚕蛹活体接种及子实体的培养

a、按照mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比为1：12将两种菌液混合均匀，用无菌注射器吸取混合菌液 注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射400uL。

b、将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个。避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、 22℃光照17h培养5d，最后22℃光照培养45d。

4、米饭培养基接种及子实体的培养

a、按照mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比为1：12将两种菌液混合均匀，用移液器吸取混合菌液均匀 喷洒到米饭培养基表面，每瓶米饭培养基喷洒5ml。

b、将接种好的米饭培养基罐头瓶，避光16℃培养15d，然后换做16℃避光7h、22℃光照17h培养5d， 最后22℃光照培养40d。

5、按不同mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比例接种到柞蚕蛹体后生物转化率计算

a、将按不同比例接种获得的子实体及柞蚕蛹分别放到60℃、24h烘干。

b、参照2012年Shrestha B等方法分别计算出不同接种比例的生物转化率(BE)，公式为：生物转化 率(BE)＝子实体重量/(子实体干重量+蚕蛹干重量)×100％。

通过分析不同接种比例获得生物转化率可以看出，mat-alpha与mat-HMG菌丝接种质量比为1：12时， 生物转化率值远高于原始菌株和其它接种比例菌株。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动 想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限 定的保护范围为准。