抗氧化、抗炎、抗辐射、金属螯合的化合物及其用途

摘要

本发明涉及具有组合的抗氧化、抗炎、抗辐射和金属螯合性质的有效化合物。具体地，本发明涉及具有所述性质的短肽，并涉及这样的短肽在临床和化妆品应用中的方法和用途。

说明书

发明领域

本发明涉及具有组合的抗氧化、抗炎、抗辐射和金属螯合性质的有效 化合物。更具体地，本发明涉及具有所述性质的短肽，并涉及这样的短肽 在临床和化妆品应用中的方法和用途。

发明背景

正常发挥生物系统功能要求，尤其是，破坏性物质的形成和消除之间 的适当平衡。例如，氧化应激代表在生物系统中破坏性氧化簇，如活性氧 簇（ROS）和活性氮簇（RNS）水平之间的不平衡，以及该生物系统容易 中和或消除氧化簇的能力的不足。这种应激的后果，包括但不限于对细胞 蛋白质、脂类和DNA的有害改变。

氧化应激是与范围广泛的疾病和其他内科疾病相关的，疾病包括例如 阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病和病理学继发性糖尿病、类风湿关 节炎、神经退行性疾病（特别是在运动神经元疾病中）、气道炎症和高反 应性（例如，哮喘）以及一些皮肤病，如白癜风。

在一些情况下，不清楚氧化应激是否是内科疾病的原因或结果。然而， 在许多情况下，降低氧化应激导致在疾病表现上的改善。在许多其他情况 下，降低氧化应激可以防止疾病爆发。除病理状况外，还已知氧化应激参 与一些不受欢迎的组分的老化。

含有硫醇（-SH）的化合物是一类能够中和几类破坏性氧化簇的分子， 从而起到还原剂的作用。这组化合物的活性主要由于它们包含的硫原子， 该硫原子参与对有毒亲电的亲核攻击、清除自由基、通过提供氢原子实现 修复受损的目标、改变细胞的氧化还原状态或影响基因转录或蛋白质功 能。

含有硫醇的化合物包括由包括动物和植物的所有活的生物体产生的 天然分子、以及合成分子。包含硫醇的天然抗氧化剂的实例包括谷胱甘肽、 该谷胱甘肽是哺乳动物中最有效且最重要的抗氧化剂之一，硫氧还蛋白和 半胱氨酸。

包含硫醇的合成氧化还原分子的实例包括，如例如Atlas等人，(2005) Free Radic Biol Med，Vol.38(1)，pp.136-45中所描述的N-乙酰半胱氨酸酰 胺。另一个实例是，例如在Kim等人.(2011)183(8)：1015中所描述的N- 乙酰基半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-酰胺（CB3），该文章在小鼠中使用卵白 蛋白（OVA）吸入模型评估其在呼吸道过敏性疾病中的保护性质。

美国专利第5,874,468号公开了靶向大脑的低分子量、疏水性的抗氧 化剂和抗氧化剂在治疗中枢神经系统神经退行性疾病，例如帕金森症、阿 尔茨海默氏病及克罗伊茨费尔特-雅各布疾病中的用途以及在治疗外周组 织疾病，例如急性呼吸窘迫综合症、肌萎缩性侧索硬化、动脉粥样硬化性 心血管疾病，和在其中过量产生氧化剂的多器官功能障碍中的用途。

美国专利第6,369,106号公开了降低生物体大脑中的氧化应激的方法， 该生物体大脑具有血脑屏障并患有缺血性脑损伤，该方法包括对生物体施 用化合物的步骤，该化合物具有（a）允许化合物跨生物体的血脑屏障的分 子量和膜混溶性性质的组合；（b）发挥抗氧化性质的易氧化的化学基团； 及（c）允许化合物或其细胞内的衍生物在细胞的细胞质中积累的化学成分。

国际专利申请公布号WO2002/034202公开了一种抗氧化化合物，其 特征在于（a）一种肽，所述肽包括至少3个氨基酸残基，3个氨基酸残基 中的至少两个是半胱氨酸残基，每一个具有用于实现抗氧化的易氧化的巯 基；和至少两个肽键，每一个可以被至少一种细胞内肽酶裂解，及（b） 经由第一键将第一疏水的或不带电荷的部分连接到肽的氨基末端且经由 第二键将第二疏水的或不带电荷的部分连接到肽的羧基末端，选择第一疏 水的或不带电荷的部分和第二疏水的或不带电荷的部分以便提供具有用 于膜混溶性性质的抗氧化化合物，该膜混溶性性质允许抗氧化化合物穿过 细胞膜；其中，至少两个肽键被至少一种细胞内肽酶裂解导致产生多个抗 氧化簇，每一个包括具有易氧化的巯基的半胱氨酸残基之一，且每一个抗 氧化剂簇在实现抗氧化方面也是活化的，从而提供多个不同的在发挥抗氧 化作用中协同作用的抗氧化簇。

金属螯合作用是保护生物系统免受有害物质的另一个重要方面。已知 金属，尤其是重金属，当以不适当的量存在时发挥毒性作用。金属离子可 产生自由基反应，从而促进氧化应激。

电离辐射，如紫外线（UV）光、X射线、γ射线、中子束和质子束等， 可以诱导氧化应激、炎症、骨髓损伤（导致白细胞减少、血小板减少和贫 血）、消化系统损伤（包括肠道壁内微绒毛的损失）以及丰富的诱变和细 胞毒性的DNA损伤，这是良性肿瘤、癌症（包括血液系统恶性肿瘤）和 许多其他有害病症和紊乱发展的原因。电离辐射促进自由基的产生，因此， 抗氧化剂可以保护免受电离辐射诱导的损伤。已被表明，抗氧化的硫醇（N- 乙酰半胱氨酸酰胺、谷胱甘肽和硫代脯氨酸）能够保护人血液淋巴细胞中 的细胞DNA免受辐射诱导的损伤(Tiwari等人.Mutat Res.2009，31； 676(1-2)：62-8)。各种来源的天然电离辐射包括宇宙辐射、太阳辐射（包 括紫外线和质子）和高氡气环境。各种来源的人工电离辐射包括医学操作 期间的外部辐射和内部辐射，如诊断成像和扫描、注射或吞食放射性同位 素、核医学和放射治疗等。对意在预防和治疗电离辐射引起的损害的改良 的组合物存在未满足的需求，该组合物适合于口服、局部施用和全身施用。

此外，对处理与细胞内破坏性物质过量或浓度过高相关的病症的更有 效方法仍存在需求。例如，拥有抗氧化、抗炎、抗过敏且金属螯合的化合 物将是非常有益的，该化合物具有效力高、稳定性好、生物利用度和足够 的半衰期的组合以达到预期的效果。

发明概述

本发明提供了具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗辐射和金属螯合性质的 短肽。本发明还提供了这样的短肽在临床和化妆品应用中的组合物、方法 和用途。

本发明公开了非常有效的肽化合物，该化合物包含位于两个半胱氨酸 氨基酸残基之间的独特的二肽序列，且还包含N-和C-末端修饰。通常， 氨基和羧基末端被适当的保护基团保护。合适的氨基末端保护基团包括但 不限于烷基和酰基。合适的羧基末端保护基团包括但不限于酰胺、酯和醇。 本文中所例证的保护基团包括N-乙酰基和C-末端的酰胺基。

如下文中所例证的，发现本发明的肽在体内减少炎症以及过敏反应方 面是非常有效的。令人惊讶的是，发现本发明的肽优于已知的含有硫醇的 分子，如N-乙酰基-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-酰胺（也被称为CB3）和 N-乙酰基-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-酰胺（也被称为CB4）。表明 当全身炎症刺激时，本发明的肽通过显著减少核因子-κB（NF-κB）的核转 位，并增加肺细胞中细胞质IκBα的浓度，在细胞水平上影响炎症相关的 反应。

此外，如下文中进一步所例证的，发现本发明的肽在保护角质形成细 胞免受过氧化氢诱导的细胞毒性、减少体内LPS施用后的ROS形成、逆 转模型细胞中氧化应激诱导的p38和JNK的磷酸化、保护细胞免受UVB 诱导的辐射方面是非常有效的。

本发明的肽能非常有效的跨膜并进入细胞。不希望受任何特殊理论或 作用机理的约束，应期待，本发明的肽的N-和C-末端修饰降低了它们的 极性，从而促进这些肽跨细胞膜、容易进入细胞并在细胞内积累的能力。 此外，修饰可稳定和保护肽免受包括例如酶的、化学的或生化的分子分解 的降解。

在各种应用中可利用本发明的短肽的性质。例如，这样的肽可具有在 治疗和/或预防与氧化应激相关的疾病和紊乱、和/或在治疗和/或预防与炎 症相关的疾病和紊乱、和/或金属离子积累方面的治疗应用。此外，本发明 的肽不仅可用作抗炎剂还可用作抗过敏剂。本发明的肽的性质还可用于抗 老化的治疗和化妆品的应用中，如化妆品组合物。

根据一方面，本发明提供具有选自由下列组成的组的氨基酸序列的 肽：

Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID NO:1)、

Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)；及

Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，提供选自由下列组成的组的四肽：

Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID NO:1)、

Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)；及

Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，肽还包含至少一个肽末端修饰。根据一些实施方 案，肽包括氨基末端修饰。根据其他的实施方案，肽包含羧基末端修饰。 根据又其他的实施方案，肽包含氨基末端和羧基末端修饰二者。每个可能 性代表本发明的单独的实施方案。

原则上，适合于氨基末端修饰的任何基团、和适合于羧基末端修饰的 任何基团，可用于本发明的肽。

在一些实施方案中，氨基末端修饰是氨基末端保护基团。

在一些典型的实施方案中，氨基末端保护基团选自由烷基和酰基组成 的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些示例性实施方案中，氨基末端保护基团是乙酰基。

在本发明的一些实施方案中，氨基末端修饰是提高肽穿透脂质层的能 力和/或提高肽渗透进入皮肤的能力的部分。这样的部分可提供高效力的局 部施用。在一些示例性的实施方案中，提高肽穿透脂质层的能力和/或提高 其渗透进入皮肤的能力的部分是脂肪酸。在一些实施方案中，脂肪酸选自 由棕榈酸、磷脂酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯 酸和油酸组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，氨基末端修饰选自由氨基末端保护基团和脂肪酸 组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，氨基末端修饰选自由烷基、酰基和脂肪酸组成的 组。

在一些实施方案中，羧基末端修饰是羧基末端保护基团。在一些典型 的实施方案中，羧基末端保护基团选自由酰胺基、酯基和醇基组成的组。 每个可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些示例性实施方案中，羧 基末端保护基团是酰胺基。

在一些实施方案中，肽是可由细胞内肽酶裂解的。在进入细胞后，肽 的裂解可产生展现抗氧化、抗炎和金属螯合性质和活性的分子。

在一些附加的或替代的实施方案中，N-和/或C-末端修饰可经由胞内 酶水解。因此，肽进入细胞后，这些修饰可被水解。

在本发明的一些实施方案中，位于两个Cys残基之间的中间二肽选自 由Lys-Met和Met-Lys组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方 案。赖氨酸和甲硫氨酸是用于生物合成肉毒碱分子的前体。在活细胞中， 需要肉毒碱将脂肪酸从细胞质运输进入线粒体，在线粒体产生代谢能量的 过程中发生脂质分解。还已知肉毒碱具有强的抗氧化活性。如上文所述， 在进入细胞后，肽可被肽酶裂解。在一些实施方案中，肽经历裂解，导致 赖氨酸和甲硫氨酸释放。在一些实施方案中，肽施用可促进肉毒碱形成， 并可增加细胞中肉毒碱的量和浓度。在用于增加细胞中肉毒碱的量和浓度 的方法中，可使用这样的肽。

在本发明的一些实施方案中，二肽β-Ala-His位于两个Cys残基之间。 二肽β-Ala-His（β-丙氨酰-L-组氨酸）被称为肌肽。肌肽能够执行多种功能， 包括抗氧化、抗糖化、pH缓冲和二价金属阳离子螯合。在一些实施方案中， 肽经历细胞内裂解，导致游离肌肽的释放。在一些实施方案中，肽施用可 增加细胞中肌肽的量和浓度。在用于增加细胞中肌肽的量和浓度的方法 中，可使用这样的肽。

在一些示例性实施方案中，提供肽N-乙酰基-Cys-Lys-Met-Cys-酰胺 (SEQ ID NO:4)。

在另外的示例性实施方案中，提供肽N-乙酰基-Cys-Met-Lys-Cys-酰胺 (SEQ ID NO:5)。

在仍然另外的示例性实施方案中，提供肽N-乙酰基 -Cys-β-Ala-His-Cys-酰胺(SEQ ID NO:6)。

在本发明的一些实施方案中，肽具有选自由抗氧化、抗炎、抗过敏、 抗辐射、金属螯合或其组合组成的组的活性。每个可能性代表本发明的单 独的实施方案。

在本发明的一些实施方案中，肽具有抗炎活性。在本发明的一些实施 方案中，肽具有抗过敏活性。在本发明的一些实施方案中，肽具有抗氧化 活性。

在本发明的一些实施方案中，肽呈盐的形式。在一些实施方案中，盐 选自由三氟乙酸（TFA）盐、乙酸盐和柠檬酸盐组成的组。每个可能性代 表本发明的单独的实施方案。

根据另一方面，本发明提供包含本发明的肽或其盐的组合物。

在本发明的一些实施方案中，肽被配制成药物组合物。根据这些实施 方案，组合物还包括药学上可接受的稀释剂、溶剂、赋形剂或载体。

在本发明的一些实施方案中，肽被配制成化妆品组合物。根据这些实 施方案，该组合物还包括美容上可接受的稀释剂、溶剂、赋形剂或载体。

任何合适的施用途径可被用于本发明的组合物，包括但并不限于局部 和全身的途径。全身施用包括所有肠内和所有肠胃外途径。合适的施用途 径的非限制性实例包括局部应用、口服、直肠、跨粘膜例如经鼻和口腔、 静脉内、肌内、透皮、皮下、皮内、玻璃体内、囊内（intravesicular）和吸 入途径。

因此，在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于局部施用。在 其他实施方案中，该组合物被配制用于全身施用。

本发明的组合物可用于治疗或预防与氧化应激相关的疾病和紊乱。本 发明的组合物还可用于治疗或预防与炎症和/或过敏相关的疾病和紊乱。此 外，本发明的组合物可用于治疗或预防与晚期糖基化终产物，也被称为非 酶糖基化产物的存在或积累相关的疾病和紊乱。此外，本发明的组合物可 用于治疗或预防与金属离子的存在或积累相关的疾病和紊乱。本发明的组 合物还可用于治疗或预防电离辐射引起的损伤。

因此，根据另一方面，本发明提供了用于治疗与氧化应激、过敏或炎 症中的至少一种相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的患者施 用包含本发明的肽或其盐的组合物。根据某些实施方案，所述方法包括施 用本发明的肽的混合物。

在本发明的一些实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物包含本 发明的至少一种肽或其至少一种盐作为活性成分，以用于治疗与氧化应 激、过敏（慢性和/或急性发作期）或炎症（慢性和/或急性发作期）中的 至少一种相关的疾病或紊乱。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与氧化应激相关的。在一些实施方 案中，与氧化应激相关的疾病或紊乱选自由阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、 糖尿病、类风湿关节炎、缺血-再灌注损伤和白癜风组成的组。每个可能性 代表本发明的单独的实施方案。糖尿病可包括I型和II型糖尿病。每个可 能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与炎症有关的。在一些实施方案中， 与炎症相关的疾病或紊乱是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，与炎症 相关的疾病或紊乱选自由急性炎症、类风湿关节炎、炎症性肠疾病和动脉 粥样硬化组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与过敏相关的。在一些实施方案中， 与过敏相关的疾病或紊乱选自由过敏性气道疾病、过敏性鼻炎、湿疹、皮 炎、胃肠道的食物过敏和眼部过敏组成的组。每个可能性代表本发明的单 独的实施方案。在一些实施方案中，过敏性疾病是哮喘。

根据另一方面，本发明提供用于治疗与晚期糖基化终产物的存在或积 累相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的患者施用包含本发明 的肽或其盐作为活性成分的组合物。根据某些实施方案，方法包括施用本 发明的肽的混合物。

在本发明的一些实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物包含本 发明的至少一种肽或其至少一种盐作为活性成分，以用于治疗和/或预防与 晚期糖基化终产物的存在或积累相关的疾病或紊乱。

在一些实施方案中，与晚期糖基化终产物的存在或积累相关的疾病或 紊乱选自由糖尿病、白内障、心力衰竭、高血压和生胼胝皮肤（callused skin） 组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。糖尿病可包括I型 和II型糖尿病。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在本发明的一些实施方案中，疾病或紊乱是皮肤病和/或化妆品问题。 在一些示例性实施方案中，皮肤病是白癜风。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗炎剂的用 途。

在另外的实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗过敏剂 的用途。

在另外的实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗氧化剂 的用途。

根据另一方面，本发明提供用于治疗与金属离子的存在或积累相关的 疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含本发明的肽 或其盐作为活性成分的药物组合物。

在本发明的一些实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物包含本 发明的至少一种肽或其至少一种盐作为活性成分，以用于治疗与金属离子 的存在或积累相关的疾病或紊乱。

在一些实施方案中，与金属离子的存在或积累相关的疾病或紊乱选自 由肝脏疾病、阿尔茨海默氏病、心力衰竭（心肌梗死）、中风和朊病毒病 组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在化妆品应用中可使用本发明的肽的抗氧化性质，用于皮肤护理和防 护。例如，本发明的肽可被用作抗老化剂。

因此，根据仍然另一方面，本发明提供用于减缓人皮肤的老化过程、 减少人皮肤老化迹象、或两者的方法，该方法包括将包含本发明的肽或其 盐的化妆品组合物应用到皮肤。

在一些实施方案中，减缓人皮肤的老化过程和减少人皮肤老化迹象包 括改善肤色、减少皱纹、去除细纹、提升皮肤紧致度和/或降低皮肤敏感性 和刺激性。

在一些实施方案中，提供化妆品组合物，该化妆品组合物包含本发明 的肽或其盐作为活性成分，以用于减缓人皮肤的老化过程、减少人皮肤老 化迹象，或两者。

根据又一方面，本发明提供用于预防或治疗由电离辐射引起的紊乱或 有害作用的方法，包括给需要其的受治疗者施用包括本发明的肽或其盐的 组合物。根据一些实施方案，该方法包括施用本发明的肽的混合物。根据 一些实施方案，施用组合物以防止或减少辐射的至少一些有害作用。根据 其他实施方案，施用组合物以改善事先暴露于辐射的至少一些有害作用。

根据又一方面，本发明提供用于预防或治疗电离辐射引起的至少一些 有害作用的组合物，该组合物包含本发明的肽或其盐。根据一些实施方案， 该组合物包含本发明的肽的混合物。

根据一些实施方案，电离辐射选自由X-射线辐射、γ-辐射、紫外线辐 射、热辐射、核辐射、宇宙辐射、或其组合组成的组。每个可能性代表本 发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，电离辐射是紫外线辐射。在 一些示例性实施方案中，紫外线辐射是UVB。

根据一些实施方案，在暴露于电离辐射之前24小时内或在大致暴露 于电离辐射的时候、和/或暴露于电离辐射后24小时内施用组合物。根据 替代的实施方案，在暴露于电离辐射之前和/或之后的12小时内、6小时 内、或3小时内或更少时间内施用组合物。每个可能性代表本发明的单独 的实施方案。

从下面的附图、详述、实施例案和权利要求书，本发明的这些和进一 步的方面以及特征将变得明显。

附图简述

图1.肽对角叉菜胶诱导的后爪肿胀的影响。

图2.肽对丙二醛（MDA）活性的影响。

图3A-F.肽对NF-κB的核转位和I-κBα的细胞质稳定性的影响。凝胶 显示4个样品的代表。密度测量结果反映所有样品（每个肽多达8个样品）。

图4A-C.肽对小鼠中卵白蛋白诱导的超敏反应的影响-分析血液和腹 膜渗出物样品。

图5A-H.肽对小鼠中卵白蛋白诱导的超敏反应的影响-分析腹膜渗出 物样品。

图6A-D.肽对过氧化氢诱导的HaCaT角质形成细胞的细胞毒性的影 响。图6A、C-所测肽对HaCaT细胞活力的影响（无过氧化氢）。图6B、 D-所测肽对HaCaT细胞中过氧化氢诱导的细胞毒性的影响。

图7A-C.肽对HaCaT细胞中UVB诱导的细胞毒性的影响。

图8.DY-66对小鼠的肝脏炎症模型中通过注射（i.v）刀豆蛋白A （Con-A）诱导的肝脏炎症的影响。

发明详述

本发明公开了具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗辐射和金属螯合性质的 短肽及其在治疗、预防和化妆品应用中的用途。

本发明的肽显示了令人满意的性质，如进入细胞的能力、在细胞内的 稳定性、高效力和低毒性的组合。

定义

如文中所用的“肽”表示通过肽键连接的氨基酸的序列。术语“四肽”表 示由四个氨基酸组成的肽。通常，本发明的肽以线性的形式被使用，尽管 应当理解，在环化反应不严重干扰肽特征的情况下，还可使用肽的环状形 式。

术语“氨基酸”是指具有氨基基团和羧酸基团的化合物，优选碳主链上 以1,2-、1,3-或1,4-取代模式。该术语包括天然、非天然的和/或化学修饰 的氨基酸残基。天然氨基酸包括见于蛋白质中的那些，是L-氨基酸。非天 然的和/或化学修饰的氨基酸包括，例如，相应的N-甲基氨基酸、侧链修 饰的氨基酸和未见于蛋白质中的生物合成可得到的氨基酸（例如，5-羟基 赖氨酸）。如通常在本领域中已知的，整个说明书和权利要求书中以一个 或三个字母代码代表氨基酸残基。本发明中使用的氨基酸是市售的或可通 过常规合成方法得到的那些。某些氨基酸残基可能需要特殊的方法用于将 其掺入肽，且肽序列的连续、发散的或收敛的合成方法在本发明中是有用 的。

本发明的范围之内还包括肽盐、以及本发明的肽的衍生物。

如本文中所用的术语“盐”是指羧基盐以及是指肽分子氨基的酸加成 盐。羧基盐可通过本领域中已知的方法形成，且包括无机盐，例如钠、钙、 铵、铁或锌盐及类似物，和与有机碱的盐，例如用胺，如三乙醇胺、哌啶、 普鲁卡因及类似物形成的盐。酸加成盐包括，例如与无机酸如乙酸或草酸 的盐。另外的合适的盐实例包括三氟乙酸（TFA）盐、乙酸盐和柠檬酸盐。

通过将肽的靶向的氨基酸残基与能够与末端残基反应的有机衍生剂 反应，可将羧基的酯和酰胺以及氨基的酰基和烷基衍生物引入到分子中。 优选的化学衍生物包括C-末端已被酰胺化或N-末端已被乙酰化的肽。

如本文中所用的本发明的肽的“衍生物”包括可通过本领域已知的方法 从作为残基上的侧链或N-或C-末端基团存在的官能团中制备的衍生物， 且只要这些衍生物保持药学/美容上可接受的，即它们不破坏肽的活性，不 赋予包含它的组合物有毒性质及对其抗原特性不产生负面影响，它们就被 包括在本发明中。例如，这些衍生物可包括羧基的脂族酯、羧基的与氨或 与伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基的经由与酰基基团 （例如，链烷酰基或碳环芳酰基）反应形成的N-酰基衍生物。

“渗透性”是指试剂或物质渗透、弥散或扩散通过障碍、膜、或皮层的 能力。“细胞渗透性”、“细胞渗透”或“渗透性增强”部分是指在本领域中已 知的，能够促进或增强分子渗透穿过膜的任何分子。非限制性实例包括： 疏水部分，如脂质、脂肪酸、类固醇和大块的（bulky）芳香族或脂肪族化 合物。渗透性增强部分可直接或通过间隔物被连接到肽部分中的任意位 置，优选被连接到肽部分的氨基或羧基末端。

如本文中所用的术语“与氧化应激相关的疾病和紊乱”是指氧化应激引 起和/或氧化应激加剧的疾病和紊乱，或者以异常增加的氧化应激为特征的 疾病和紊乱。

如本文中所用的术语“与过敏相关的疾病和紊乱”、“过敏性疾病”、“过 敏性紊乱”可被互换使用，且是指特征为免疫系统对一种或多种通常是无害 的外来物质（称为过敏原）的超敏反应和高反应性的疾病和紊乱。通常， 过敏反应的特征在于通过免疫球蛋白E（IgE）抗体过度激活肥大细胞、嗜 碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

如本文中所用的术语“与炎症相关的疾病和紊乱”和“炎症疾病/紊乱” 可被互换使用，且是指特征为炎症的疾病或紊乱。该术语包括急性和慢性 两种炎症。

如本文中所用的术语，与晚期糖基化终产物（AGE）的存在或积累相 关的疾病和紊乱是指AGE引起和/或AGE加剧的疾病和紊乱，或特征为加 速形成AGE和/或AGE水平异常增加的疾病和紊乱。

术语“晚期糖基化终产物（advanced glycation end-products）”（AGE） 是指从还原性糖（通常是葡萄糖或果糖）与蛋白质、脂质和核酸的游离氨 基的非酶反应中形成的一组异质性分子。某些反应活性的AGE或前体AGE 能够在蛋白质间形成共价交联，这改变它们的结构和功能。

如本文中所用的术语“与金属离子的存在或积累相关的疾病和紊乱”是 指金属离子的存在或积累引起和/或加剧的疾病和紊乱，或特征为金属离子 的量或浓度的异常增加的疾病和紊乱。

如本文中所用的“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”，是指减少、 改善或甚至消除与相关疾病有关的至少一些症状。该术语可包括减少氧化 应激；抑制或减少炎症；抑制或减少过敏反应；降低晚期糖基化终产物的 浓度水平和/或中和或降低晚期糖基化终产物的损伤；和/或降低破坏性的 金属水平和/或中和或降低金属离子损伤。

本发明的肽

根据一方面，本发明提供具有选自由下列组成的组的氨基酸序列的 肽：

Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID NO:1)、

Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)、

Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)、

Cys-γ-Glu-Cys-Cys(SEQ ID NO:7)

Cys-γ-Glu-Cys(SEQ ID NO:8)。

每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，肽选自由下列组成的组：

Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID NO:1)、

Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)；及

Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)。

应理解，Cys代表氨基酸半胱氨酸；Lys代表氨基酸赖氨酸；Met代表 氨基酸甲硫氨酸；β-Ala代表氨基酸β-丙氨酸；且γ-Glu代表氨基酸γ-谷氨 酸/γ-谷氨酸盐。

在一些实施方案中，肽还包含选自由氨基末端修饰和羧基末端修饰组 成的组的至少一种修饰。根据这些实施方案，肽选自由下列组成的组：

Z-Cys-Lys-Met-Cys-Y(SEQ ID NO:9)、

Z-Cys-Met-Lys-Cys-Y(SEQ ID NO:10)；及

Z-Cys-β-Ala-His-Cys-Y(SEQ ID NO:11)，

其中Z代表氨基末端修饰以及Y代表羧基末端修饰。

在一些实施方案中，N-和C-末端修饰降低了本发明的肽的极性，从而 促进这些肽跨细胞膜、容易进入细胞、及在细胞内积累的能力。此外，肽 末端的修饰可例如通过阻断肽酶的作用提高生物稳定性。

氨基和羧基末端的修饰可选自在肽化学领域常规使用的任何氨基和 羧基末端的修饰，这将不会对肽的活性产生不利的影响。

在一些实施方案中，氨基末端修饰包括添加氨基末端保护基团。

例如，可使用本领域中众所周知的方法，通过烷基化或酰基化进行N 末端的保护。合适的N-末端保护基团的非限制性实例包括C₁-C₅支链或非 支链的烷基、酰基，如甲酰基和乙酰基，及其取代形式，如乙酰氨基甲基 （Acm）。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在本发明的一些实施方案中，氨基末端修饰包括将提高肽穿透脂质层 的能力和/或提高肽渗透进入皮肤的能力的部分共价连接到肽的N-末端。 这样的部分可提供高效力的局部施用。在一些示例性实施方案中，部分是 脂肪酸。脂肪酸可选自由棕榈酸、磷脂酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十二 碳六烯酸、二十碳五烯酸和油酸组成的组。每个可能性代表本发明的单独 的实施方案。

在一些典型的实施方案中，氨基末端修饰选自由乙酰基、烷基、酰基 和脂肪酸组成的组。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，羧基末端修饰是羧基末端保护基团。

例如，可使用本领域中众所周知的方法通过酰胺化、还原或酯化，进 行C末端的保护。合适的C-末端保护基团的非限制性实例包括酰胺基、酯 基和醇基。每个可能性代表本发明的单独的实施方案。

肽进入细胞后，它们可经历经由细胞内肽酶的裂解。裂解可产生仍然 具有抗氧化、抗炎、抗糖化和金属螯合性质和活性的分子。

另外，肽的N-和/或C-末端修饰可被水解，这可导致它们在细胞质中 积累。

在一些实施方案中，位于两个Cys残基之间的中间二肽，选自由 Lys-Met和Met-Lys组成的组。在一些实施方案中，提供选自由 Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID NO:1)和Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)组成 的组的肽。

在一些示例性实施方案中，提供肽N-乙酰基-Cys-Lys-Met-Cys-酰胺 (SEQ ID NO:6)。

在另外的示例性实施方案中，提供肽N-乙酰基-Cys-Met-Lys-Cys-酰胺 (SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，二肽β-Ala-His位于两个Cys残基之间。在一些 实施方案中，提供肽Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)。在一些示例性实 施方案中，提供肽N-乙酰基-Cys-β-Ala-His-Cys-酰胺(SEQ ID NO:8)。

在一些实施方案中，二肽γ-Glu-Cys位于两个Cys残基之间。在一些 实施方案中，γ-Glu位于两个Cys残基之间。

在一些示例性实施方案中，提供选自由N-乙酰基-Cys-γ-Glu-Cys-Cys- 酰胺(SEQ ID NO:12)和N-乙酰基-Cys-γ-Glu-Cys-酰胺(SEQ ID NO:13) 组成的组的肽。

在一些实施方案中，肽本身和/或其代谢物具有选自由抗氧化、抗炎、 抗过敏和金属螯合作用或其组合组成的组的活性。每个可能性代表本发明 的单独的实施方案。

本发明的肽可能够螯合各种各样的金属离子。金属离子的非限制性实 例包括Cu、Fe、Cd、Zn、Mg、Hg、Pb、As、Tl、Au。在一些实施方案 中，肽能够螯合选自由Cu和Fe组成的组的至少一种金属离子。每个可能 性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，肽具有抗炎活性。在另外的实施方案中，肽具有 抗过敏活性。

通过肽合成领域的技术人员已知的任何技术可合成本发明的肽。这些 方法包括固相以及液相合成方法。

固相肽合成方案是本领域中众所周知的，并通过John Morrow Stewart 和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(第2版，Pierce  Chemical Company，1984)进一步描述。

本领域技术人员可通过使用自动肽合成仪使用标准的化学反应，例 如，t-Boc化学反应或Fmoc化学反应，合成本发明的任何肽。

方法包括专用固相合成、部分固相合成、片段凝聚、经典溶液合成。

可通过制备型高效液相色谱法(Creighton T.(1983)Proteins，structures  and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.)来纯化合成的肽，并且 合成的肽的组成可通过氨基酸测序来确认。仅包含天然氨基酸的本发明的 一些肽还可使用本领域已知的重组DNA技术来制备。肽和渗透性部分的 共轭可使用本领域中已知的任何方法，通过固相化学反应或液相化学反应 来进行。本发明的一些化合物可方便地使用液相合成方法来制备。本领域 中已知的制备类似本发明的化合物的化合物的其他方法可被使用且被包 括在本发明的范围内。

直接或通过间隔物可将本发明的渗透性增强部分连接到肽部分中的 任何位置。根据特定的实施方案，细胞渗透性部分被连接到肽部分的氨基 末端。任选的连接间隔物可具有各种长度和构象，包括任何合适的化学物， 包括但不限于胺、酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、氧醚、磺酰胺键及类似物。 这样的间隔物的非限制性实例包括氨基酸、砜酰胺衍生物、氨基硫醇衍生 物和氨基醇衍生物。

本文中所公开的肽的环状形式也在本发明的范围内。肽的环化可通过 本领域中已知的任何方法发生，例如通过存在于肽序列中的自由氨基和羧 基，或者通过添加用于环化的氨基酸或部分。环化类型的非限制性实例是： 侧链到侧链的环化、C到N末端环化、侧链到末端环化，以及掺入至少一 个N-ω-取代的氨基酸残基的任何类型的主链环化，如WO95/33765中所 描述的。

本领域中已知的制备类似本发明的肽的肽的其他方法可被使用且在 本发明的范围内。

在一些实施方案中，肽呈盐的形式。合适的盐的非限制性实例包括三 氟乙酸（TFA）盐、乙酸盐和柠檬酸盐。

本发明的组合物

根据另一方面，本发明提供了包含本发明的肽或其盐的组合物。

在一些实施方案中，组合物被配制成药物组合物。根据这些实施方案， 组合物还包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

在其他实施方案中，组合物被配制成化妆品组合物。根据这些实施方 案，组合物还包括美容上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

在一些实施方案中，组合物还包含至少一种多种活性成分。

在一些实施方案中，提供由本发明的肽作为活性成分组成的药物组合 物。在另外的实施方案中，提供由本发明的肽作为活性成分组成的化妆品 组合物。

本发明的组合物中以有效实现预期目的的量，例如，以有效治疗某种 疾病的量存在本发明的肽或其盐，及任选地另外的一种或多种活性成分。

任何合适的施用途径可用于本发明的组合物，包括但并不限于局部和 全身的途径。全身施用包括所有肠内和所有肠外途径。合适的施用途径的 非限制性实例包括局部应用、口服、直肠、跨粘膜例如经鼻和口腔、静脉 内、肌内、透皮、皮下、皮内、血管内和吸入途径。

因此，在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于局部施用。在 其他实施方案中，组合物被配制用于全身施用。

可以常规的方法配制本发明的化妆品组合物和药物组合物。适当的制 剂取决于所选的施用途径。

在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于外用。用于外用的制 剂的非限制性实例包括乳剂、软膏、洗剂、凝胶、泡沫、悬浮液、含水的 或共溶剂的溶液、油膏、脂质体和可喷雾的液体形式。组合物还可形成用 于透皮应用的贴片的一部分。其他适合于本发明的组合物的外用产品形式 包括，例如，乳液、摩丝、唇膏、唇彩、化妆水、面膜、发蜡、溶液和血 清。

在一些实施方案中，化妆品组合物或药物组合物配制为呈固体凝胶或 软凝胶的形式，例如，水醇凝胶和透明凝胶。通常，水相包含一种或多种 胶凝剂，例如纤维素胶凝剂、或合成胶凝剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于口服施用。用于口服 施用的制剂的非限制性实例包括片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体剂、凝 胶剂、糖浆剂、膏剂、悬浮液及类似物，经由患者口服摄取。用于口服施 用的合适的载体在本领域中是众所周知的。可使用固体赋形剂来制备用于 口服使用的组合物，在根据需要加入合适的助剂后任选研磨所得的混合 物，并加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂丸芯。合适的赋形剂的非限 制性实例包括填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇、纤 维素制品如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍 胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠、和/或生理学上可 接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。如果需要，可加入崩解剂，如 交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，如藻酸钠。

为了通过注射施用，可将组合物的活性成分配制在水溶液中，例如， 在生理上相容的缓冲液，包括但不限于汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐 水缓冲液中。注射用制剂可以单位剂量形式存在于例如安瓿中，或存在于 任选地加有防腐剂的多剂量容器中。组合物可呈悬浮液、溶液或油或水媒 介物中的乳剂的形式，并可包含调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。 合适的亲脂性溶剂或媒介物的非限制性实例包括脂肪油如芝麻油，或合成 脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯、或脂质体。含水注射悬浮液可包含增 加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖。任选地， 悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的剂以允许制备 高浓度溶液。可选择地，活性成分可呈粉末形式，用于在使用前与合适的 媒介物例如，无菌、无热原的水基溶液组合。

对于跨粘膜施用，在制剂中使用适合于待被渗透的屏障的渗透剂。这 样的渗透剂在本领域中通常是已知的。

对于口腔施用，组合物可采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入途径施用来说，使用适宜的推进剂，例如，二氯二氟甲 烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，活性成分以气溶胶喷雾剂外 观的形式从加压包或喷雾器中被方便地递送。在加压的气溶胶情况下，可 通过提供递送计量的量的阀门来确定剂量。例如，可配制用于在分配器中 使用的明胶的胶囊和药筒，该明胶的胶囊和药筒包含化合物和合适的粉末 基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于直肠施用，例如，使 用常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯作为栓剂或保留灌肠剂。

各个医生可根据患者的病情选择准确的制剂、施用途径和剂量。

在一些实施方案中，组合物还包含用于化妆品和药物领域的至少一种 添加剂，包括但不限于，脂肪、乳化剂和共乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝 剂、着色剂、香料、润肤剂、湿润剂、防腐剂、维生素、螯合剂、溶剂、 填料、增稠剂、亲水性和亲脂性的滤光剂、染料、中和剂、渗透增强剂和 聚合物。

合适的脂肪的非限制性实例包括矿物油、动物来源的油（羊毛脂）、 合成油（肉豆蔻酸异丙酯、辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂基酯、油酸 癸酯或棕榈酸异丙酯）、硅酮油（环聚甲硅氧烷或二甲聚硅氧烷）和氟化 油。脂肪醇、脂肪酸、蜡和胶类，特别是硅酮橡胶和合成橡胶也可被用作 脂肪。

合适的乳化剂和共乳化剂的非限制性实例包括聚甘油脂肪酸酯、蔗糖 脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、PEG 脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磷酸盐、烷 基聚葡糖苷和二甲聚硅氧烷共聚醇。

合适的亲水性胶凝剂的非限制性实例包括羧基乙烯基聚合物(卡波姆 (cabomer))、丙烯酸类共聚物，例如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物、聚丙 烯酰胺、多糖、如黄原胶、瓜尔胶、天然树胶，如纤维素胶及衍生物、粘 土和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烯酸共聚物。

合适的亲脂性胶凝剂的非限制性实例包括改性的粘土，如膨润土、脂 肪酸金属盐、疏水性二氧化硅和乙基纤维素。

合适的填料的非限制性实例包括滑石、高岭土、云母、绢云母、碳酸 镁、硅酸铝和有机粉末，如尼龙。

合适的染料的非限制性实例包括亲脂性染料、亲水性染料、颜料和化 妆品或皮肤病学组合物中常用的珍珠母，以及它们的混合物。

合适的中和剂的非限制性实例包括苏打、三乙醇胺、氨甲基丙醇和氢 氧化钾。

合适的渗透增强剂的非限制性实例包括醇和二醇（乙醇和丙二醇）、 乙氧基二甘醇、醇类和脂肪酸（油酸）、脂肪酸酯和二甲基异山梨醇。

与化妆品组合物和药物组合物相容的防腐剂的非限制性实例包括苯 甲酸、苯甲酸盐和苯甲酸酯、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯和它们的盐、 二氯苯氧氯酚、咪唑烷基脲、苯氧基乙醇、DMDM乙内酰脲、重氮烷基脲 和氯苯甘醚。

通常，滤光剂是UVA和UVB滤光剂。合适的UVA和UVB滤光剂的 非限制性实例包括有机滤光剂，如二苯甲酮-3,丁基甲氧二苯甲酰甲烷、氰 双苯丙烯酸辛酯、甲氧肉桂酸辛酯、4-甲基亚苄基樟脑、水杨酸辛酯、对 苯二亚甲基二樟脑磺酸和甲酚曲唑三硅氧烷，及非有机的滤光剂，例如氧 化钛和氧化锌。

合适的溶剂的非限制性实例包括水、乙醇、甘油、丙二醇、丁二醇和 山梨糖醇。

如本领域的技术人员已知的，这些各种添加剂的量是化妆品制剂和药 物制剂中常规的使用量。

本发明的方法和用途

本发明的短肽的抗氧化、抗炎、抗过敏和金属螯合活性的组合，使这 样的肽对于治疗多种疾病特别有用。

例如，本发明的组合物可用于治疗与氧化应激相关的疾病、与晚期糖 基化终产物的存在或积累相关的疾病、与金属离子的存在和积累相关的疾 病以及与炎症和/或过敏相关的疾病。每个可能性代表本发明的单独的实施 方案。

在一些实施方案中，本发明的方法包括施用包含本发明的至少一种四 肽的组合物。

因此，根据另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与氧化应激、 过敏或炎症中的至少一种相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其 的患者施用包含本发明的肽或其盐的组合物。

根据某些实施方案，方法包括施用本发明的肽的混合物。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐用于制造用于治 疗和/或预防与氧化应激、过敏或炎症中的至少一种相关的疾病或紊乱的药 物的用途。

在一些实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的肽 或其盐作为活性成分，用于治疗和/或预防与氧化应激、过敏或炎症中的至 少一种相关的疾病或紊乱。

在本发明的一些实施方案中，有关的疾病或紊乱是皮肤病和化妆品问 题。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与氧化应激相关的。可使用本发明 的肽来治疗的与氧化应激相关的疾病和紊乱的实例包括，但不限于，阿尔 茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病（I型和Ⅱ型）、类风湿关节炎、缺血- 再灌注损伤（例如心脏和大脑组织损伤）和白癜风。每个可能性代表本发 明的单独的实施方案。

在一些示例性的实施方案中，疾病是白癜风。根据这些实施方案，提 供了用于治疗患有白癜风的患者的白癜风的方法，该方法包括将包含本发 明的肽或其盐作为活性成分的药物组合物应用于患者的皮肤。

白癜风是慢性疾病，由于黑色素细胞的破坏和/或黑色素细胞功能的缺 陷，引起皮肤斑块的色素脱失。白癜风可由许多原因引起，如遗传、自身 免疫、神经营养和毒性因素。另外，发现氧化应激被牵涉。处理白癜风通 常包括化妆品掩蔽，但主要目的是停止或减缓色素脱失的发展，如果可能 的话，给皮肤恢复一些颜色。目前对白癜风的治疗包括，例如，应用皮质 类固醇激素药膏和免疫调节剂药膏、紫外线（UV）光疗，以及有时通过手 术移植黑色素细胞。这样的治疗通常是长的，引起身体不适，并带来许多 不良效应。不希望被任何特殊理论或机制约束，预期通过本发明的方法治 疗白癜风包括通过本发明的肽中和积累的过氧化氢。因此本发明的方法提 出了对于白癜风的安全且有效的治疗。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与炎症相关的。在一些实施方案中， 与炎症相关的疾病或紊乱是自身免疫性疾病。可使用本发明的肽治疗的与 炎症相关的疾病和紊乱的实例包括，但不限于急性炎症、类风湿关节炎、 炎症性肠病、和动脉粥样硬化。

在一些实施方案中，疾病或紊乱是与过敏相关的。可使用本发明的肽 治疗的与过敏相关的疾病和紊乱的实例包括，但不限于过敏性气道疾病、 过敏性鼻炎、湿疹、皮炎、胃肠食物过敏和眼部过敏。

在一些实施方案中，疾病是炎症、过敏性气道疾病（慢性和/或急性发 作）。在一些示例性的实施方案中，疾病是哮喘。根据这些实施方案，提 供了用于治疗受治疗者的哮喘的方法，该方法包括给受治疗者施用包含本 发明的肽或其盐作为活性成分的药物组合物。

哮喘是气道慢性炎症性疾病，其特征在于在对吸入的过敏原和非特异 性刺激的气道反应性方面的相关增加。大量的数据显示过敏性气道疾病中 氧化应激增加，并表明ROS在该疾病发病中的潜在作用。

根据另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与晚期糖基化终产物 的存在或积累相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的受治疗者 施用包含本发明的肽或其盐作为活性成分的组合物。根据某些实施方案， 方法包括施用本发明的肽的混合物。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐用于制造治疗和 /或预防与晚期糖基化终产物的存在或积累相关的疾病或紊乱的药物的用 途。

在一些实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的至 少一种肽或其至少一种盐作为活性成分，用于治疗和/或预防与晚期糖基化 终产物的存在或积累相关的疾病或紊乱。

可使用本发明的肽治疗的与晚期糖基化终产物的存在或积累相关的 疾病和紊乱的实例包括但不限于，糖尿病（I型和II型）、白内障、心力衰 竭、高血压和胼胝（如足部胼胝）。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗炎剂的用 途。

在一些示例性的实施方案中，本发明提供了肽Cys-Lys-Met-Cys(SEQ  ID NO:1)作为抗炎剂的用途。在另外的示例性实施方案中，本发明提供了 肽Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)作为抗炎剂的用途。在仍然另外的示例 性实施方案中，本发明提供了肽Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)作为抗 炎剂的用途。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗过敏剂的 用途。

在一些示例性的实施方案中，本发明提供了肽Cys-Lys-Met-Cys(SEQ  ID NO:1)作为抗过敏剂的用途。在另外的示例性实施方案中，本发明提供 了肽Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)作为抗过敏剂的用途。在仍然另外的 示例性实施方案中，本发明提供了肽Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)作 为抗过敏剂的用途。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐作为抗氧化剂的 用途。

在一些示例性实施方案中，本发明提供了肽Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID  NO:2)作为抗氧化剂的用途。在另外的示例性实施方案中，本发明提供了 肽Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)作为抗氧化剂的用途。

根据另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与金属离子的存在或 积累相关的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含 本发明的肽或其盐作为活性成分的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或其盐用于制造治疗和 /或预防与金属离子的存在或积累相关的疾病或紊乱的药物的用途。

在本发明的一些实施方案中，提供了药物组合物，该药物组合物包含 本发明的至少一种肽或其至少一种盐作为活性成分，用于治疗和/或预防与 金属离子的存在或积累相关的疾病或紊乱。

可使用本发明的肽治疗的与金属离子的存在或积累相关的疾病和紊 乱的实例包括但不限于，肝病、阿尔茨海默氏病、心力衰竭（心肌梗死）， 中风和朊病毒疾病。

化妆品行业正在不断寻找新的和改进的皮肤护理用的化合物，特别是 具有抗老化作用的化合物。在化妆品应用中可利用本发明的肽的性质用于 皮肤护理和防护。例如，本发明的肽可用作抗老化剂。

因此，根据又一方面，本发明提供了用于减缓人皮肤的老化过程、减 少人体皮肤的老化迹象、或两者的方法，该方法包括将包含本发明的肽或 其盐的化妆品组合物应用于皮肤。

在一些实施方案中，减缓人皮肤的老化过程和减少人皮肤的老化迹象 包括改善肤色、减少皱纹、去除细纹、提升肌肤紧致度和降低皮肤敏感性 和刺激性。

在一些实施方案中，提供化妆品组合物，该化妆品组合物包含本发明 的肽或其盐作为活性成分，用于减缓人皮肤的老化过程、减少人皮肤的老 化迹象、或两者。

在另外的实施方案中，提供化妆品组合物，该化妆品组合物由本发明 的肽或其盐作为活性成分组成，用于减缓人体皮肤的老化过程、减少人体 皮肤的老化迹象、或两者。

本发明的肽可用于预防和/或治疗由电离辐射引起的损伤。

在一些示例性实施方案中，本发明提供了肽Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID  NO:1)在预防或治疗电离辐射引起的损伤中的用途。在另外的示例性实施 方案中，本发明提供了肽Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2)在预防或治疗电 离辐射引起的损伤中的用途。在仍然另外的示例性实施方案中，本发明提 供了肽Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)在预防或治疗电离辐射引起的损 伤中的用途。

因此，根据另一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗由电离辐射引 起的紊乱和有害作用的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含本 发明的肽或其盐的组合物。根据一个实施方案，该方法包括施用本发明的 肽的混合物。

本文中所使用的“电离辐射”包括但不限于X-射线辐射、α辐射、β射 线、γ射线、紫外线（UV）辐射、太阳辐射、热辐射、核辐射、高能电子 辐射、中子辐射、正电子辐射、宇宙辐射、电磁辐射或其组合。

本文中所公开的组合物还可用于防止可在电离辐射暴露后发生的 DNA损伤。不希望受任何理论或机制的约束，已经假定UV-B辐射通过核 酸碱基的直接激发过程和以不依赖于氧的方式进行的进一步反应作用于 DNA。这主要导致在二嘧啶位点以强的序列依赖性的方式形成二聚体光产 物。该光产物主要包含顺式-顺式环丁二嘧啶（cis-syn cyclobutadipyrimidine， CPD）和嘧啶（6-4）嘧啶酮光产物（6-4PP）。UV-A辐射对细胞DNA的 大部分损伤效应包含光敏作用。

本文中将“紫外线（UV）辐射”定义为10和400纳米（nm）波长之间 的辐射。“紫外线（UV）辐射”被进一步描述成紫外线A（315–400nm）、 B（280–315nm）和C（100–280nm）。虽然暴露于工作场所、家庭和晒 黑沙龙中的人工光源也有风险，但是紫外线辐射的主要来源是阳光。来自 太阳的紫外线C（UV-C）通常是无害的，因为它被大气臭氧层筛去。虽然 UV-B在维生素D的合成中是必不可少的组分，但是它也是红斑（晒斑） 皮肤癌和免疫抑制的原因。紫外线A（UV-A）是皮肤老化的原因，且另外 牵涉在动物中皮肤癌的发展和人类中的免疫抑制中。太阳是UV-A的主要 来源，然而使用人工晒黑用的UV-A灯也被表明引起了不良副作用。归因 于紫外线辐射的发病率和死亡率的主要原因是皮肤和眼睛的慢性疾病，但 是其他副作用如红斑（晒斑）、光老化、光照性皮肤病，和痣形成等，也 被人所知(Gllagher和Lee，Prog Biophys Mol Biol.2006，92(1))。

本文中所公开的组合物还可用于治疗与紫外辐射照射相关的副作用 和紊乱，包括和UV有关的皮肤病和眼部疾病。皮肤疾病包括但不限于恶 性黑色素瘤、皮肤的基底和鳞状细胞癌（SCC）、唇癌、耳廓（外耳）癌和 非黑素细胞皮肤癌（NMSC）。和UV辐射暴露有关的眼部疾病包括但不限 于色素层黑色素瘤、白内障、黄斑变性、翼状胬肉、光性角膜炎。

根据其他实施方案，可将本发明的组合物掺入外用的阳光防护制剂或 阳光防护化合物中，即能够阻断或减少UV-A和/或UV-B辐射暴露到皮肤 的任何化合物，以便增强防晒乳的效果和/或减少或防止皮肤损伤。阳光防 护化合物的实例包括遮光剂（常规地，具有2或更高的阳光防护因子（SPF） 的产品）、防晒乳（常规地，物理阻断辐射暴露和/或具有12或更高SPF 的产品）及其组合。

本文中所公开的组合物还可用于治疗在医学操作中暴露于辐射后可 发生的电离辐射损伤，该医学操作使用在同一病人中可进行一次或多次的 针对疾病或紊乱的诊断或治疗的医学成像和医学扫描技术来进行。医学成 像和扫描技术包括但不限于血管造影术、磁共振成像（MRI）、磁共振血管 造影（MRA）、功能性磁共振成像（fMRI）、磁共振波谱（MRS）、计算机 断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）、正电子发射断层扫描-计算 机断层扫描（PET-CT）、正电子发射断层扫描-氟脱氧葡萄糖（PET-FDG）、 X-射线、超声、dexa scan（骨密度）、超声心动图、荧光镜透视检查、乳房 X线照相术（和R2image checker）、放射性标记扫描和核医学等。

使用成像和扫描技术和方法的医学操作包括但不限于关节造影、钡灌 肠、钡餐、改良的钡餐、子宫输卵管造影、静脉内肾盂造影（IVP）、子宫 肌瘤栓塞术（UFE）、上肠胃道摄影（UGI）、排泄性膀胱尿道造影（VCUG）、 主动脉造影、脑血管造影、冠状动脉造影、淋巴管造影、肺血管造影、脑 室造影、胸部荧光屏图像摄影、超声心动图、电阻抗断层成像、荧光镜透 视检查、光散射成像、弥散加权成像、弥散张量成像、正电子发射断层扫 描、闪烁成像、单光子发射计算机断层成像（SPECT）、妇科超声检查、 产科超声检查、超声造影、血管内超声、热敏成像、仿真结肠镜检查、和 一般诊断X射线检查，如腹部、胸部、骨骼和脊柱。

本文中所公开的组合物还可用于治疗和/或预防与辐射疗法相关的副 作用和紊乱。常见的辐射疗法副作用包括但不限于骨髓损伤、脱发、乏力、 皮肤刺激、口腔、咽喉和食道中的疼痛，肿胀，不孕不育和上皮细胞表面 如皮肤、口腔粘膜、咽部、小肠和大肠粘膜和输尿管的损伤，所有取决于 已被治疗的身体区域。可在辐射疗法治疗后数月至数年发生的另外的副作 用包括但不限于纤维化、脱毛（脱发）、淋巴水肿、心脏病、认知衰退、 放射性直肠炎和最常见的癌症。

本文中所公开的组合物还可用于治疗和/或预防可在用核医学诊断和/ 或治疗后发生的副作用和紊乱。核医学使用可定位和/或集中在特定器官 （或组织）或细胞受体中的放射性药物。核医学放射性药物包括但不限于 钙-47、碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铒-169、氟-18、镓-67、镓-68、 氢-3、铟-111、碘-123、碘-125、碘-131、铁-159、氪-81m、氮-13、氧-15、 磷-32、钐-153、硒-75、钠-22、钠-24、锶-89、铊-201、氙-133、钇-90和 锝-99m。

住在核电厂附近的工人和人们、使用特殊技术和材料的诊所和实验室 的医学人员、宇航员、飞行员和飞机的机组人员，经常暴露于不同剂量的 电离辐射。因此，本文中所公开的组合物也可用于治疗和/或预防可在慢性 或一次暴露于核辐射或其他电离辐射后发生的副作用和紊乱。此外，本发 明的组合物可用于治疗和/或预防可在暴露于核和辐射事故的核辐射或核 武器使用后发生的副作用和紊乱。

文中所公开的组合物还可用于治疗和/或预防与在诊断和治疗的医学 操作，例如多种成像和扫描中造影剂（也称为医疗造影剂）的使用相关的 不良效应和紊乱。与碘化造影剂的使用相关的示例性紊乱包括造影剂诱发 的急性肾损伤（CI-AKI）（也被称为造影剂诱导的肾病）。

使用造影剂的诊断和治疗的医学成像操作包括但不限于，血管造影、 经皮冠状动脉介入治疗、静脉造影、排泄性膀胱尿道造影（VCUG）、子宫 输卵管造影（HSG）、静脉尿路造影（IVU）、钡灌肠、钡灌肠双重造影 （DCBE）、吞钡餐、钡餐、钡餐双重造影、钡餐随入小肠造影（barium follow  through）、仿真结肠镜、增强CT造影、增强MRI造影、动态增强MRI造 影和增强超声造影（CEUS）。

造影剂包括，但不限于，放射造影剂、碘、碘化造影剂、泛影葡胺、 甲泛影钠、碘克酸、碘帕醇、碘海醇、碘昔兰、碘普胺、碘克沙醇、钡、 硫酸钡、二氧化钍、钆双胺、钆贝酸、钆喷酸、钆特醇、钆膦维司、钆弗 塞胺、钆塞酸、钆布醇、钆考酸、钆登酯、钆美利醇、钆喷胺、钆特酸、 cliavist、combidex、endorem（菲立磁）、resovist、sinerem、全氟溴烷、阿 马诺嗪、利声显、微气泡造影剂、含钆造影剂、氧化铁造影剂、Mn-DPDP 和天然产品，如蓝莓和绿茶。

根据其他实施方案，在暴露于电离辐射前24小时内或在大致暴露于 电离辐射时和/或在暴露于电离辐射后24小时内施用组合物。可在辐射照 射前24小时内以一个或多个剂量或在大致暴露于电离辐射时以一个或多 个剂量和/或在暴露于电离辐射后24小时内以一个或多个剂量施用药物组 合物。根据替代的实施方案，在暴露于电离辐射之前和/或暴露于电离辐射 之后的12小时内、6小时内、或3小时或更少时间内以一个或多个剂量施 用组合物。

根据其他实施方案，本发明的组合物在暴露于电离辐射前被施用1次 或多次和在暴露于电离辐射后被施用1次或多次。根据其他实施方案，组 合物可在辐射暴露前24小时内，例如在辐射暴露前约1、6、12、18或24 小时，被施用1次或多次，且在辐射暴露后24小时内，例如在辐射暴露 后约1、6、12、18或24小时，再次被施用1次或多次。

对于上述适应症、施用方案以及它们的应用模式，本发明的药物组合 物或化妆品组合物的施用量，将取决于被治疗的个体的特性（年龄、大小、 性别等）以及与待治疗的症状相关的参数。

呈现下列实施例以便更充分地说明本发明的某些实施方案。然而，它 们绝不应该被解释为限制本发明的广泛的范围。本领域技术人员可容易地 设计本文中所公开的要素的许多变体和修改，而不背离本发明的范围。

实施例

实施例1：肽合成

使用Fmoc策略通过固相肽合成（SPSS）合成下列新的五种肽（所有 的五种肽是>98%纯度）：

N-乙酰基-Cys-Lys-Met-Cys-NH₂，本文中标为DY-65(SEQ ID NO:4)；

N-乙酰基-Cys-βAla-His-Cys-NH₂，本文中标为DY-66(SEQ ID NO:6)；

N-乙酰基-Cys-γGlu-Cys-NH₂，本文中标为DY-67(SEQ ID NO:13)；

N-乙酰基-Cys-Met-Lys-Cys-NH₂，本文中标为DY-70(SEQ ID NO:5)；

及

N-乙酰基-Cys-γGlu-Cys-Cys-NH₂，本文中标为DY-71(SEQ ID NO:12)。

通过其中存在耦合-脱保护的反复循环的SPSS制备肽。技术的第一阶 段由用聚合物支撑物（polymeric support）上被保护的氨基酸衍生物组装肽 链组成。技术的第二阶段是从树脂支撑物上裂解肽，同时裂解所有侧链保 护基团以产生粗制的游离肽。

固相连接肽的游离的N-末端胺首先被耦合到单一的N-保护的氨基酸 单位中。然后该单位被脱保护，显示另外的氨基酸被连接到其上的新的N- 末端胺。从树脂裂解后，然后通过使用柱的反相HPLC来纯化肽。

Fmoc脱保护：将0.08mmol的Fmoc-X-Wang树脂装入配有塑料盖的 烧结玻璃柱（fritted column）。用3ml一份的二甲基甲酰胺（DMF）洗涤 树脂两次，每次1分钟。接着，加入3ml DMF中的20%哌啶且允许脱保 护继续15分钟。在这个时间内，轻轻涡动柱以便确保完全混合。反应完 成后（约15分钟内），反应柱被排空，且用3ml DMF洗涤树脂4次。

酰胺键的耦合：在小瓶中，通过与等当量的O-苯并三唑-N,N,N',N'-四 甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、6个当量的DIPEA（N,N'-二异丙基乙基胺） 和3ml DMF组合，将3个当量的Fmoc氨基酸预活化。将该溶液充分溶 解且然后允许反应另外3-5分钟。然后，将该耦合溶液加入到树脂中。将 盖放置在反应柱上且在20分钟的时间每2-3分钟搅拌树脂浆料。

裂解：为了获得呈游离酸形式的肽，使用三氟乙酸（TFA）裂解酯键。 用2-3mL以95:5比例的三氟乙酸和水的溶液处理树脂。然后在25分钟的 时间内搅拌树脂。随后将柱排空且收集滤液到玻璃收集容器。然后在乙醚 中干燥该物质并分析。

此外，下列肽被称为CB3和CB4，也使用Fmos策略经由SPSS合成：

CB3：N-乙酰基-Cys-Pro-Cys-NH₂(SEQ ID NO:14)

CB4：N-乙酰基-Cys-Gly-Pro-Cys-NH₂(SEQ ID NO:15)

实施例2：肽对角叉菜胶诱导的后爪肿胀的影响

检测上述新的五种肽的抗炎活性，且将它们的活性与肽CB3的活性进 行比较。将角叉菜胶注射进入动物的两个后爪的足底下区域前30分钟， 雄性ICR小鼠接受了每一种所测肽(150mg/kg)的i.p.施用。将角叉菜胶以3 mg/ml的浓度溶解在水中且以50μl的体积注射。角叉菜胶注射前和之后以 每次测量间1小时的间隔，通过测微计测量后爪的厚度。肿胀被 计算为在每个时间间隔时测量的后爪的厚度和在时间0时（角叉菜胶注射 前）的尺寸之间的差异。每一组n=6个足垫（3只动物）。

如在图1中可看出，最活跃的肽是DY-65，显示在1、2和3小时后， 与对照组（仅生理盐水）相比肿胀分别减少了40%、27%和34%。与对照 组相比，DY-66、DY-67也观察到肿胀减少，且对于DY-70和DY-71来说， 更小程度的肿胀减少被观察到。与对照组相比，CB3并没有显示出显著的 减少。

实施例3：在酵母聚糖诱导的炎症的小鼠模型中肽对肺中的脂质过氧化的影响

酵母聚糖诱导的休克.雄性BALB/c小鼠被随机分成下列实验组（每 一组8只小鼠）：

（1）酵母聚糖+媒介物组（“ZYM”）。用酵母聚糖500mg/kg腹腔内处 理小鼠。

（2）酵母聚糖+DY-66组（“ZYM+DY-66”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但是施用了肽DY-66。

（3）酵母聚糖+DY-65组（“ZYM+DY-65”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-65。

（4）酵母聚糖+DY-70组（“ZYM+DY-70”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-70。

（5）酵母聚糖+DY-71组（“ZYM+DY-71”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-71。

（6）酵母聚糖+DY-67组（“ZYM+DY-67”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-67。

（7）假实验组（“Sham”）。与酵母聚糖+媒介物组相同但媒介物代替 酵母聚糖被施用。

·通过腹腔内（i.p.）施用途径施用肽，如下：

·酵母聚糖注射前3天给予首个剂量（50mg每kg）。

·酵母聚糖注射前2天给予第二个剂量（50mg每kg）。

·酵母聚糖注射前1天给予第三个剂量（50mg每kg）。

·酵母聚糖注射前30分钟给予第四个剂量（120mg每kg）。

·酵母聚糖注射后5小时给予第五个剂量（120mg每kg）。

在D5W（水中5%右旋糖，“D5W”）中配制肽。媒介物对照是D5W。 在酵母聚糖施用后24小时处死动物，并通过肺组织的MDA（丙二醛）分 析评估炎症。从Sigma,Inc.获得所有材料及药物（除了肽）。

确定MDA的活性.丙二醛（MDA）形成被用于量化脂质过氧化反应， 作为硫代巴比妥酸反应性材料被测定。在1.15%KCl缓冲液中将组织匀浆 化（100mg/mL），且然后将匀浆（200mL）加入到由0.75mL0.8%硫代巴 比妥酸、100mL8.1%（体积每体积）十二烷基硫酸钠、0.75mL20%（v/v） 乙酸（pH3.5）和300mL蒸馏水组成的反应混合物中，并在95℃加热60 分钟。冷却至室温后，通过以10,000g离心10分钟使样品澄清，并且使 用1,1,3,3-四甲氧基丙烷作为外标在532nM下测量吸光度。脂质过氧化物 的水平被表示为nM MDA/mg蛋白。

数据分析.图2和下面的文字中的所有值被表示为n个观察结果的均 数±标准差（SD）和标准误差（SE）。对于体内研究，n代表被研究的动物 数量。通过单因素ANOVA和随后的用于多重比较的Bonferroni's post-hoc 检验分析结果。p值小于0.05被认为是显著的。

肽对MDA活性的影响.如在图2中可看出，在酵母聚糖施用后24小 时，酵母聚糖施用诱导肺组织中MDA活性增加了50%。用肽DY-70处理 抑制了肺组织中MDA浓度的升高（p<0.05）。

实施例4：在酵母聚糖诱导的炎症的小鼠模型中肽对肺中的NF-κB的核转位和I-κ-Bα的细胞质稳定性的影响

在该实施例中检测下列肽：DY-65、DY-66和DY-70。

酵母聚糖诱导的休克.雄性BALB/c小鼠被随机分成下列实验组：

（1）酵母聚糖+媒介物组（“ZYM”）。用酵母聚糖500mg/kg腹腔内处 理小鼠。

（2）酵母聚糖+DY-65组（“ZYM+DY-65”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但是施用了肽DY-65。

（3）酵母聚糖+DY-66组（“ZYM+DY-66”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-66。

（4）酵母聚糖+DY-70组（“ZYM+DY-70”）。与酵母聚糖+媒介物组相 同但施用了肽DY-70。

（5）假实验组（“SHAM”）。与酵母聚糖+媒介物组相同但媒介物代替 酵母聚糖被施用。

通过如实施例3中所描述的腹腔内（i.p.）施用途径施用肽。

如实施例3中所描述的在D5W中配制肽。媒介物对照是D5W。

在酵母聚糖施用后24小时，处死动物并通过肺组织的NF-κB分析来 评估炎症。

NF-κB核转位的确定.将组织匀浆化并通过离心制备核提取物。使用 一系列标准对p50进行ELISA以便限定绝对浓度。

I-κBα细胞质稳定性的确定.将组织匀浆化并通过离心制备核提取物。 用一系列标准对IκBα进行ELISA以便限定绝对浓度。

数据分析.图3和下面的文字中的所有值被表示为n个观察结果的均 数±标准差（SD）和标准误差（SE）。对于体内研究，n代表被研究的动物 数量。通过单因素ANOVA和随后的用于多重比较的Bonferroni's post-hoc 检验分析结果。p值小于0.05被认为是显著的。

肽对NF-κB核转位的影响.如在图3A-F中可看出，在酵母聚糖施用 后24小时，酵母聚糖（“ZYM”）施用诱导肺组织中p65核转位增加了10 倍。用肽DY-65或DY-70处理将p65核转位的增加抑制了>80%（p<0.05）。 用肽DY-66处理将p65核转位的增加抑制了约80%（p<0.05）。

肽对I-κBα细胞质稳定性的影响.在酵母聚糖施用后24小时，酵母聚 糖施用诱导肺组织中细胞质的IκBα浓度减少了4倍。用肽DY-65、DY-66 或DY-70处理将细胞质IκBα浓度的减少抑制了>50-80%（对于所有三种肽， p<0.05），其中效力DY-70>DY-65>DY-66。

实施例5：通过新肽逆转氧化应激诱导的p38和JNK的磷酸化

根据下列程序在该实施例中检测所有五种肽：

细胞培养和处理：

将人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞维持在补充有10%胎牛血清 （Invitrogen）、100μg/ml链霉素和100U/ml的青霉素G（Gibco）的 Dulbecco’s改良的Eagle’培养基（DMEM，Invitrogen）中。将细胞以6.25x10⁴个/cm²的密度铺板并培养24小时，之后使细胞暴露于不同的处理。

细胞活力：

将SH-SY5Y细胞铺在96孔板上，并用金诺芬（AuF）（5μM）处理 30分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并用任一种肽以指定浓度处理细胞。 24小时后，将细胞用终浓度为0.5%的戊二醛固定10分钟。将细胞用DDW 洗涤3次，干燥过夜，并用硼酸盐缓冲液（0.1M，pH8.5）洗涤一次。将 固定的细胞用200μl溶解在硼酸盐缓冲液中的1%亚甲基蓝染色1小时。 彻底洗涤和干燥后，用200μl的0.1M HCl在37℃提取颜色1小时，并在 分光光度计中630nm处读取吸光度。

Western印迹分析和抗体：

将20到30微克蛋白质样品上样到10%-12%SDS-PAGE凝胶上。然后 将蛋白经电泳转移到硝酸纤维素（Whatman，德国）上。在含有4%Difco 脱脂奶粉（BD，USA）的TBS-T(25mM Tris-HCl pH7.4,0.9%NaCl和0.02% Tween-20)中在室温下（RT）孵育1小时来封闭印迹，并用以下一抗在4℃ 孵育过夜：pERK1/2(Thr202/Tyr204)，鼠单克隆抗体，(1:6,000)； p-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)，兔单克隆抗体；SAPK/JNK，鼠单克隆抗体； p-p38MAP激酶(Thr180/Tyr182)，兔单克隆抗体；cleaved caspase3，兔单 克隆抗体。所有抗体是来自Cell Signaling Tech.USA，以1:1000使用。将 纯化的b连环蛋白，鼠单克隆抗体（1:10,000；BD Transduction Laboratories， USA）在TBS-T中的5%BSA、0.04%叠氮化物中稀释。用抗鼠或抗兔 IgG-HRP连接的抗体（1:10,000；Cell Signaling,Tech.USA）来检测蛋白质。

结果被总结在下文中的表1中。如从表中可看出，所有的五种肽以 20-90μM范围内的浓度，在减少p38MAP激酶和JNK（c-Jun的N-末端激 酶）磷酸化的方面是非常有效的。DY-70和DY-65最有效。

表1-通过肽抑制MAPK磷酸化

实施例6：肽对小鼠中卵白蛋白诱导的超敏反应的影响-分析血液和腹膜渗出物样品

在该实施例中检测下列肽：DY-65、DY-66和DY-70。

超敏反应.雄性BALB/c小鼠（6-8周龄）被安置在无特定病原体条件 下，且以12小时的光/暗周期，以自由采食和饮水维持。从Sigma，Inc.获 得所有的材料和药物。

第0天和第7天，用腹腔注射(i.p.)200μl包含100μg卵白蛋白（OVA） 和1.6mg明矾的无菌PBS敏化A组、B组、C组和E组中的小鼠（每组 n=10），且第14天用腹腔注射(i.p.)200μl包含10μg卵白蛋白（OVA）的 无菌PBS攻击，以便诱导过敏性腹膜炎的实验模型。用腹腔注射(i.p.)200μl 无菌PBS来注射F组中的小鼠（n=10）（“假实验”组，无OVA和无明矾）。

第13天、第14天和第15天用150μl分别包含肽DY-66、DY-65和 DY-70的无菌PBS以剂量为125mg/kg经由i.p.施用途径来处理A组、B 组和C组中的小鼠。

第13天、第14天和第15天，用150μl无菌PBS经由i.p.施用途径来 处理E组和F组中的小鼠。第14天，在注射OVA前30分钟注射检品（或 PBS媒介物）。

第16天取血，检测1）血清抗OVA IgE，2）白细胞计数和分类（包 括嗜酸性粒细胞计数的绝对值和百分比）。血清被冻结在-80℃用于将来任 选的血检测。

数据分析.图4和下面的文字中的所有值被表示为n个观察结果的均 数±标准差（SD）和标准误差（SE）。对于体内研究，n代表被研究的动物 数量。通过单因素ANOVA和随后的用于多重比较的Bonferroni's post-hoc 检验分析结果。p值小于0.05被认为是显著的。

肽对腹膜细胞构成的影响.如在图4A中可看出，OVA免疫（“Ova+ 媒介物”）诱导腹膜渗出物的细胞构成增加近7倍。所有三种肽显著减少了 该细胞构成的增加，如下：DY-65>DY-70>DY-66。对腹膜渗出物中巨噬细 胞和嗜酸性粒细胞的细胞构成的影响遵照同样的等级次序（图4B）。

肽对血清抗OVA IgE水平的影响.如在图4C中可看出，OVA免疫诱 导抗OVA血清IgE的滴度增加近2.5倍。所有三种肽显著减少了该滴度的 增加，如下：DY-65>DY-70>DY-66，最多减少了OVA诱导的增加的约60%。

实施例7：肽对小鼠中卵白蛋白诱导的超敏反应的影响-腹腔渗出物样品的分析

在该实施例中，检测肽DY-66并与已知的CB3肽进行比较。

按照实施例5的描述诱导超敏反应。根据上述方案用仅PBS（“PBS”， 无OVA和无明矾）、OVA（“OVA”）、OVA+CB3104mg/kg、OVA+DY-6683 mg/kg和OVA+DY-66125mg/kg处理小鼠。除了OVA+DY-6683mg/kg组 中10只小鼠被使用以外，在所有组中9只小鼠被使用。

在第16天时将动物处死，用4-5ml的无菌PBS洗涤腹膜，离心，并 将细胞重新悬浮于含有2%FCS的无菌PBS中。

总的白细胞（WBC）计数.通过腹腔洗涤收集总的WBC（需要时， 破裂红细胞RBC）并通过FACS机器分析以计数10秒流量内的总细胞数。 平均值和STDEV被显示在图5A中。所有的结果+中位值被显示在5B中。 通过水平线标记中位值。

总粒细胞的百分比.通过使用FACS机器分析10秒流量内的所有细胞 来测量腹腔灌洗物处的粒细胞的百分比，然后仔细分析FACS散点图。平 均值+STDEV被显示在图5C中，且所有的结果+中位值被显示在图5D中。 根据Mann-Whitney检验+Bonfferoni的严格校正，除发现PBS和OVA之 间的差异是显著的之外，发现OVA和OVA+DY-66125mg/kg的中位值之 间的差异也是非常显著的（p<=0.0125（0.05/4））。

嗜酸性粒细胞（Eos.）百分比大约100,000细胞被取自每个样品且通 过使用细胞离心涂片器将其“涂抹（blotted）”在载玻片上。用 “Wright-Giemsa”染色液将载玻片染色用于鉴定嗜酸性粒细胞、肥大细胞、 其他WBC和RBC。细胞被计数且计算eso的%。平均值和STDEV被显示 在图5E中。所有结果+中位值被显示在图5F中。通过水平线标记中位值。

eos的绝对数/ml.通过将eos.%（除以100）乘以总WBC计数计算总 的eos.值。平均值和STDEV被显示在图5G中。所有结果+中位值被显示 在图5H中。通过水平线标记中位值。

实施例8：肽对过氧化氢诱导的HaCat角质形成细胞的细胞毒性的影响

在该实施例中检测所有的五种肽，并将它们的活性与已知的CB3肽进 行比较。以10x10⁴细胞/ml的浓度将HaCaT细胞接种在96孔板中24小时。 然后用肽以指定浓度孵育细胞2.5小时，然后用PBS洗涤并用90μM的过 氧化氢（不含肽）孵育30分钟。用PBS洗涤细胞，并用含有肽的培养基 孵育72小时。通过MTT检测细胞活力。相似地进行肽对细胞活力的影响 而没有过氧化氢暴露。

结果被总结在图6中。“对照HaCaT”-既不被肽也不被过氧化氢处理的 细胞；“培养基”-无细胞、只含有培养基的孔；“HaCaT H₂O₂”-用过氧化氢 处理的细胞。

结果已表明，在所有检测的浓度下，肽DY-70完全保护细胞免受过氧 化氢损伤（图6A-无过氧化氢；6B-过氧化氢暴露后）。在1-10μM的浓度 下，肽DY-67引起细胞活力增加约45%（图6C-无过氧化氢；6D过氧化氢 暴露后）。过氧化氢暴露后，在所选择浓度下，肽DY-65、DY-66、DY-71 和CB3稍微提高了细胞活力。

实施例9：DY-65对小鼠组织中肉毒碱水平的影响

连续5天用250mg/kg DY-65i.p.注射雄性ICR小鼠。最后一次注射后 半小时，取出肺、心脏、骨骼肌（股骨的）、脑、肝、肾和血液，使其匀 浆化（200μl蒸馏水中100mg组织），离心，并通过30K过滤 器过滤。通过商品化试剂盒（BioVision，目录号K642-100）进行肉毒碱分 析。每一组n=4。

结果已显示，在一些组织中肉毒碱的水平显著升高（约150%增加）。 在其他组织中观察到肉毒碱水平的升高（大约70%增加）。在混合的组织 中，以及在个体动物中证实了该结果。

实施例10：肽对HaCaT细胞中UVB诱导的细胞毒性的影响

在该实施例中检测下列肽，并将它们的活性与已知的CB3肽：DY-65、 DY-66和DY-70进行比较。

将HaCaT细胞接种于96孔板（10x10⁴/ml），并以37℃、6%CO₂培养 24小时。用肽以指定浓度孵育细胞2.5小时，并洗涤（PBS）。然后，将 100μl PBS加入到每一个孔中，紧接着UVB照射（0.05J/cm²）。用PBS 洗涤细胞并用含有肽的培养基（DMEM，100μl）培养。72小时后进行 MTT分析。

结果被总结在图7A-C中。“对照”-既不被肽也不被UVB照射处理的 细胞；“培养基”-没有细胞、只含有培养基的孔；“HaCaT UVB”-用UVB照 射处理的细胞。

结果已表明，肽DY-65（图7A）、DY-66（图7B）和DY-70（图7C） 在低浓度下显示了保护作用。

实施例11：DY-66对脂多糖（LPS）注射后C57Bl/6小鼠中ROS水平的影响

第-3天、第-2天、第-1天用肽或PBS以50mg/kg的剂量或用仅PBS i.p. 注射C57BL/6雌性小鼠（7-8周龄）（每一组6只小鼠）。第0天，用200μg/ 小鼠的LPS i.p.注射所有小鼠，且45分钟后，用150mg/kg的肽i.p.注射它 们。另一组的3只小鼠作为正常的未处理小鼠。LPS注射后6小时，将小 鼠放血到肝素化管（来自每一只小鼠约300μl血）中，并测量血浆中ROS 水平。

结果已显示与PBS处理的小鼠相比，用肽DY-66处理的小鼠的血小板 和RBC中ROS水平显著降低。

血小板：DY-66处理的小鼠中ROS水平是PBS处理的小鼠中测量的 水平的约55%（p<0.005）。

RBC：DY-66处理的小鼠中ROS水平是PBS处理的小鼠中测量的水 平的约75%（p<0.05）。

实施例12：肽对C57BL/6小鼠中肝脏炎症的影响

首先，在通过刀豆蛋白A（Con-A）注射（i.v.）诱导的肝脏炎症的小 鼠模型中检测所有的五种肽。

在第-3天、第-2天、第-1天，用不同肽以50mg/kg的剂量或用仅PBS i.p.注射6个组的C57BL/6雌性小鼠（7-8周龄），每组中包含6只小鼠。 第0天，用250μg/小鼠的Con-A i.v.注射所有小鼠，且45分钟后，用150 mg/kg的每种肽或PBS i.p.注射。

Con A注射后8小时，将小鼠放血到肝素化试管（来自每只小鼠约150 μl血）中，并测量血浆中丙氨酸转氨酶（ALT）水平。

一天后，将小鼠处死，并将它们的肝脏置于4%福尔马林中，并送病 理检查。

Con A施用诱导ALT水平显著增加。与PBS处理的小鼠相比，肽DY-66 将ALT平均值降低了69%并且将ALT中位值降低了75%。此外，根据组 织病理报告，用DY-66处理导致坏死区显著减少（p=0.011）。

虽然用不到致死剂量的Con A(250μg/20g)注射小鼠，但是Con A注 射后24小时，发现PBS处理组的3只小鼠和DY-65处理小鼠中的1只小 鼠死亡。在其他组中没有死亡。这表明，大多数肽对Con A诱导的肝脏炎 症具有一些有益的影响。

接着，DY-66肽被检测并将其与N-乙酰半胱氨酸（NAC）、CB3和CB4 进行比较。根据上述程序检测化合物。Con A剂量是180μg/小鼠。

图8呈现了，与PBS处理相比，每个所测化合物的ALT水平的变化 （%）。（即，从用所测化合物处理的小鼠获得的样品的ALT水平与从用 PBS处理的小鼠获得的样品的ALT水平之间的比率）。

与PBS处理的小鼠相比，肽DY-66将ALT平均值降低了71%并将ALT 中位值降低了89%。与PBS处理的小鼠相比，CB3和CB4两者导致ALT 水平高度增加。与PBS处理的小鼠相比，NAC没有诱导ALT水平的显著 变化。

实施例13：金属螯合

检测所有五种肽结合铜离子和铁离子的能力。将0.83mM每种肽与 1.66mM的FeCL₃或CuSO₄混合。在室温下将混合物孵育1小时，并进一 步保持在4℃直到分析。通过质谱（ESI）分析样品。

对于DY-65、DY-66（低度）和DY-70（低度）观察到铜结合。对于 DY-66和DY-70（低度）观察到FeCl结合。

实施例14：肽对晚期糖基化终产物水平的影响

工作范围：确立所测肽（例如，DY-66）在抑制高葡萄糖培养基中培 养的内皮细胞中的晚期糖基化终产物的发展方面的体外效力。

将牛主动脉内皮细胞培养在具有30mM葡萄糖和0.4%胎牛血清的 MEM中7天，每天更换培养基。这些条件此前已表明诱导晚期糖基化终 产物的浓度增加了261%。

暴露于30mM葡萄糖之前，将细胞随机分配到下列实验组中：

1.假实验组（5mM葡萄糖；不暴露于30mM葡萄糖）

2.媒介物对照（30mM葡萄糖）

3.肽（40、100或400μM）+30mM葡萄糖

4.肌肽（40、100或400μM）+30mM葡萄糖

5.N-乙酰半胱氨酸（NAC）（40、100或400μM）+30mM葡萄糖

每个条件以三份表示。考虑到10个条件，以及每个条件3个重复， 共培养30个孔。

培养7天后，收获细胞并使用市售的单克隆抗体将提取的细胞质用于 免疫反应性的AGE的斑点印记分析。

将印迹显色并进行密度测定。确定所测肽和肌肽的IC50且表示为平 均值±标准误差。

前面对具体实施方案的描述将如此完全揭示本发明的一般性质，以致 通过应用现有的知识，其他人可以容易地修改和/或改编这样的具体实施方 案用于各种应用，而不需要过多的实验且不偏离一般概念，并因此，这样 的改编和修改应该并意图在所公开的实施方案的等同物的意义和范围之 内被理解。应理解，本文中使用的措辞或术语是用于描述的目的而不是用 于限制的目的。用于实现各种所公开的化学结构和功能的手段、材料和步 骤可以采用各种各样的替代形式，而不偏离本发明。