通过持续性酶以一个核苷酸的精度控制DNA在纳米孔中的移动

摘要

本文公开的发明提供了能够检测和控制混合物中的单个（individual）聚合物在纳米孔中被另一化合物(例如酶)影响的装置和方法。特别值得注意的是，该系统在盐介质中稳定，可实时检测多核苷酸中的单个核苷酸碱基，并且可以用于测序DNA达多个小时而不必改变试剂。本发明特别用于法医生物学、分子生物学、结构生物学、细胞生物学、分子开关、分子电路、和分子计算器，及其制造领域。

说明书

本专利申请要求获得如下专利申请的优先权和利益：美国临时专利申请 系列号61/402,903，题目为“通过持续性酶以核苷酸的精度控制DNA在纳米 孔中的移动”（Control of DNA Movement in a Nanopore at One Nucleotide  Precision by a Processive Enzyme），其于2010年9月7日提出申请；美国临 时专利申请系列号61/574,237，题目为“用于在纳米孔上对单链多核苷酸测序 的方法”（Methods for Sequencing Single-Stranded Polynucleotides on A  Nanopore），其于2011年7月30日提出申请；美国临时专利申请系列号 61/574,238，题目为“保护DNA模板3′端免于核酸外切酶消化的DNA引物” （DNA Primer that Protects DNA Template3′Terminus from Exonuclease  Digestion），其于2011年7月30日提出申请；美国临时专利申请系列号 61/574,236，题目为“用碱性DNA和C3(CPG)间隔物保护DNA3′端免于核酸 外切酶消化”（Protection of DNA3′Termini From Exonucleolytic Digestion  Using Abasic DNA and a C3(CPG)Spacer），其于2011年9月7日提出申请； 美国临时专利申请系列号61/574,240，题目为“使用封闭寡聚体和蛋白纳米孔 通过Phi29DNAP激活单个DNA分子用于DNA复制”（Activation of  Individual DNA Molecules For DNA Replication By Phi29DNAP Using a  Blocking Oligomer and a Protein Nanopore），其于2011年7月30日提出申请； 美国临时专利申请系列号61/574,239，题目为“使用登录寡聚体控制Phi29 DNAP在ss-DNA底物上的结合位置”（Control of Phi29DNAP Binding  Location Along a ss-DNA Substrate Using a Registry Oligomer），其于2011年7 月30日提出申请；美国临时专利申请系列号61/574,235，题目为“使用电压 控制的DNA二聚体解链和重合链对DNA序列进行再阅读”（Re-Reading  DNA Sequence in a Nanopore Using Voltage-Controlled Unzipping and  Re-Zipping of the DNA Duplex），其于2011年7月30日提出申请；和美国临 时专利申请系列号61/574,235，题目为“使用DNA聚合酶允许更快激活DNA 以渐次通过纳米孔的较短封闭寡聚体”（Shorter Blocking Oligomers Allowing  Faster Activation of DNA for Ratcheting Through a Nanopore Using a DNA  Polymerase Enzyme），其于2011年7月30日提出申请，本文通过引证并入 它们的全部内容用于各种目的。

本发明部分地使用美国国立人类基因组研究所的基金，基金号为 5RC2NG00553-02。美国联邦政府对本发明享有某些权利。

发明领域

本文公开的发明提供了能够调节混合物中的单个聚合物受到另一种化 合物(例如酶)的作用的时机的装置和方法。本发明特别用于分子生物学、结 构生物学、细胞生物学、分子开关、分子电路和分子计算器，及其制造等领 域。本发明还涉及使用组合物诊断受试者是否易患癌症、自身免疫性疾病、 细胞周期病症或其它病症的方法。

背景

本发明涉及用于表征多核苷酸和其它聚合物的组合物、方法和装置。

快速确定DNA和RNA的核苷酸序列是生物技术研究人员，特别是寻求 获得生物体整个基因组序列的课题，的主要目标。此外，快速确定多核苷酸 的序列，对于鉴定个体和群体中的遗传突变和多态性是重要的。

纳米孔测序是一种快速确定多核苷酸分子序列的方法。纳米孔测序是基 于物理感知单个多核苷酸（例如DNA和RNA）中的单个核苷酸在穿过纳米 孔时的性质（或核苷酸环境中的物理变化（即例如电流））。原则上，多核苷 酸的序列可以从单个分子确定。然而，在实践中，优选地，多核苷酸序列由 从相同分子的多次通过或者由具有相同多核苷酸序列的多个分子的通过获 得的统计平均数据加以确定。Kasianowicz等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93:13770-13773,1996,本文引用其作为参考)通过使用电场强迫单链RNA和 DNA分子通过脂双层膜中的1.5纳米直径的纳米孔开孔（例如离子通道）， 研究了使用膜通道将多核苷酸作为通过小离子通道的分子加以表征。纳米孔 开孔的直径在任何给定时间内仅允许单链多核苷酸穿过纳米孔。当多核苷酸 穿过纳米孔时，多核苷酸部分地阻塞纳米孔开孔，导致离子电流瞬时降低。 因为电流降低的幅度直接与多核苷酸的长度成比例，所以Kasianowicz等 (1996)能够通过测量离子电流的改变实验性地确定多核苷酸的长度。

Baldarelli等(U.S.Pat.No.6,015,714)和Church等(美国专利No.5,795,782) 介绍了使用纳米孔开孔在单体的基础上以单体表征多核苷酸，包括DNA和 RNA分子。特别地，Baldarelli等通过使多核苷酸通过纳米孔开孔对多核苷 酸进行了表征和测序。该纳米孔开孔置于隔离两种介质的结构或界面中。当 多核苷酸通过纳米孔时，每个碱基/核苷以一定的方式改变离子电流，使得鉴 定瞬时阻塞纳米孔开孔的核苷酸的方式成为可能，藉此可以表征多核苷酸的 核苷酸组成，并可能确定多核苷酸的核苷酸序列。

先前纳米孔分析技术的缺点是控制被分析靶多核苷酸的速度。如 Kasianowicz等(1996)所述，纳米孔分析是一种用于确定多核苷酸长度的有用 方法。然而，移位速度依赖于核苷酸组成，在Kasianowicz等(1996)列出的 测量条件下，可以在10⁵-10⁷个核苷酸/秒的范围变化。因此，任何给定多核 苷酸的长度与其移位时间之间的关系并不直观。还预期如果充分降低移位速 度，可以获得关于多核苷酸内核苷酸单位的组成及它们之间的空间关系的更 高分辨率。

最近，在纳米孔开孔上分析了与核酸加工酶结合的DNA或RNA分子的 性质。所研究的复合体包括单链DNA与大肠杆菌核酸外切酶I的复合体 (Hornblower,B.;Coombs,A.;Whitaker,R.D.;Kolomeisky,A.;Picone,S.J.; Meller,A.;Akeson,M.Nat.Methods.2007,4,315-317)，RNA与噬菌体phi8 ATP酶的复合体(Astier,Y.;Kainov,D.E.;Bayley,H.;Tuma,R.;Howorka,S. Chemphyschem.2007,8,2189-2194)，和与两种A族DNA聚合酶的3′-5′-核 酸外切酶缺陷体，大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段(KF(外切-))和噬菌体 DNA聚合酶(T7DNAP(外切-))，结合的引物/模板DNA底物(Benner,S.;Chen, R.J.;Wilson,N.A.;Abu-Shumays,R.;Hurt,N.;Lieberman,K.R.;Deamer,D. W.;Dunbar,W.B.;Akeson,M.Nat.Nanotechnol.2007,2,718-724;Cockroft,S. L.;Chu,J.;Amorin,M.;Ghadiri,M.R.J.Am.Chem.Soc.2008,130,818-820; Gyarfas,B.;Olasagasti,F.;Benner,S.;Garalde,D.;Lieberman,K.R.;Akeson,M. ACS.Nano.2009,3,1457-1466;Hurt,N.;Wang,H.;Akeson,M.;Lieberman,K. R.J.Am.Chem.Soc.2009,131,3772-3778;Wilson,N.A.;Abu-Shumays,R.; Gyarfas,B.;Wang,H.;Lieberman,K.R.;Akeson,M.;Dunbar,W.B.ACS.Nano. 2009,3,995-1003)。我们已经证明，T7DNAP(外切-)能够复制并使保留在α- 溶血素(α-HL)纳米孔内的DNA模板逆着所施加的80mV电压前进 (Olasagasti,F.;Lieberman,K.R.;Benner,S.;Cherf,G.M.;Dahl,J.M.;Deamer, D.W.;Akeson,M.,Nat.Nanotechnol.2010,advance online publication, doi:10.1038/nnano.2010.2177)。然而，由于T7DNAP(外切-)-DNA复合体在负 载条件下(under load)稳定性低、在80mV电压下信噪比减小、聚合酶的周转 率(turnover rate)高，所以在报道中，难以检测在复制期间超过3个连续核苷 酸添加的离子电流阶跃(ionic current step)。HERE国际专利申请No. PCT/US2008/004467和相关的美国专利申请Nos.12/080,684和12/459,059公 开了多种技术，其包括与数种示例性DNA聚合酶偶联的α-溶血素纳米孔， 其可以在这里公开的技术一起使用。

目前需要提供能够用于表征聚合物，包括多核苷酸和多肽，以及诊断和 预后疾病和病症的组合物和方法。在本领域也需要提供这样的系统和方法， 它们能够在这样的时间范围内检测单核苷酸，利用该时间范围不仅能够区分 多核苷酸的各个核苷酸，还能够对单个核苷酸进行化学表征。特别地，还需 要提供能够耐受体外更高盐浓度的组合物。

发明简述

本发明人令人惊讶地证明，Phi29DNA聚合酶类似分子刹车发挥作用， 控制多核苷酸沿着由所施加电压产生的电场移动通过孔。令人惊讶地，该聚 合酶能够以三种模式控制多核苷酸移动通过孔，即聚合酶模式、核酸外切酶 模式和解链(unzipping)模式。聚合酶模式和核酸外切酶模式是基于酶的正常 活性。当聚合酶和核酸外切酶活性均被抑制时，在通过施加的强场拉动 dsDNA通过纳米孔时，Phi29DNA聚合酶令人惊讶地会解开dsDNA链。这 已经被命名为解链模式。解链模式暗示它是对酶上面的或者穿过酶的dsDNA 的解链，重要的是，它是破坏两条链与酶的相互作用，并克服杂交状态之间 的氢键所需要的必需力量。这里，我们将描述Phi29DNA聚合酶如何作为多 核苷酸的分子刹车发挥作用，使其能够充分地、受控地移动通过纳米孔用于 测序。

因此，本发明提供了用于测序靶多核苷酸的方法，包括：

a.使靶多核苷酸与跨膜孔和Phi29DNA聚合酶接触，使得该聚合酶控 制该靶多核苷酸移动通过该孔，且该靶多核苷酸中的一部分核苷酸 与该孔相互作用；和

b.测量每次相互作用期间通过孔的电流，藉此确定该靶多核苷酸的序 列，其中步骤(a)和(b)使用施加的跨越该孔的电压来实施。

该方法优选地以如下三种模式之一实施：

(1)步骤(a)和(b)优选地在存在游离核苷酸和酶辅因子的条件下实施，使 得所述聚合酶逆着施加的电压产生的场移动所述靶多核苷酸通过所 述孔；

(2)步骤(a)和(b)在不存在游离核苷酸但存在酶辅因子的条件下实施，使 得所述聚合酶顺着施加的电压产生的场移动所述靶多核苷酸通过所 述孔；或

(3)步骤(a)和(b)在不存在游离核苷酸也不存在酶辅因子的条件下实施， 使得所述聚合酶顺着施加的电压产生的场移动所述靶多核苷酸通过 所述孔。

本发明还提供了形成用于测序靶多核苷酸的传感器的方法，包括：(a) 在靶多核苷酸的存在下，使孔与Phi29DNA聚合酶接触；和(b)施加跨越该 孔的电压，从而在该孔和该聚合酶之间形成复合体；藉此形成用于测序靶多 核苷酸的传感器。

本发明还提供了提高Phi29DNA聚合酶活性的速率的方法，包括(a)在 多核苷酸存在下，使Phi29DNA聚合酶与孔接触；和(b)施加跨越该孔的电 压，从而在该孔和该聚合酶之间形成复合体；藉此提高Phi29DNA聚合酶的 活性的速率。

本发明还提供了Phi29DNA聚合酶用于控制靶多核苷酸移动通过孔的 用途。

本发明还提供了用于测序靶多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)Phi29 DNA聚合酶。

本发明还提供了用于测序样品中靶多核苷酸的分析装置，包括多个孔和 多个Phi29DNA聚合酶。

本发明还提供了用于确定样品中多核苷酸的核苷酸序列的系统，该系统 包括电源、阳极、阴极、顺室(cis chamber)、反室(trans chamber)，其中所述 顺室和反室被薄膜分开，该薄膜具有多个开孔（孔），其中每个开孔（孔） 的直径为大约0.25nm-大约4nm，导电溶剂、持续性DNA修饰酶(processive  DNA modifying enzyme)、多种dNTP分子、和金属离子辅因子。

在一个实施方案中，该系统进一步包括至少一种ddNTP分子。在另一 个实施方案中，该系统进一步包括电流表。在优选实施方案中，该开孔直径 为大约2nm。在另一个实施方案中，该导电溶剂是水性溶剂。在可选择的实 施方案中，该导电溶剂是非水性溶剂。在另一个实施方案中，该持续性DNA 修饰酶是一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶 可耐受至少0.6M的单价盐。在另一个实施方案中，该单价盐的浓度是饱和 的。在另一个实施方案中，该单价盐的浓度为0.6M至饱和。在另一个实施 方案中，该持续性DNA修饰酶是从中温菌或自然感染中温菌的病毒中分离 的。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从嗜盐菌或自然感染嗜 盐菌的病毒中分离的。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从极 端嗜盐菌(extreme halophile)或自然感染极端嗜盐菌的病毒中分离的。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶选自下组中的细菌：富盐 菌属（Haloferax）、盐几何菌属（Halogeometricum）、盐球菌属（Halococcus）、 盐陆生菌属（Haloterrigena）、盐红菌属（Halorubrum）、盐盒菌属（Haloarcula）、 盐杆菌属（Halobacterium）、肋生盐弧菌（Salinivibrio costicola）、伸长盐单 胞菌（Halomonas elongata）、以色列盐单胞菌（Halomonas israelensis）、 Salinibacter rube、杜氏盐藻（Dunaliella salina）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、嗜盐放线多孢菌（Actinopolyspora halophila）、嗜 盐海球菌（Marinococcus halophilus）和S.costicola。在另一个实施方案中， 该持续性DNA修饰酶从下组中选出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、 His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢杆菌噬菌体M2DNA聚合酶、 链球菌噬菌体CP1DNA聚合酶、肠杆菌噬菌体DNA聚合酶，及其变体。

在优选实施方案中，该持续性DNA修饰酶是phi29DNA聚合酶。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶来自中度嗜盐菌，其中该 中度嗜盐菌从下组中选出：假单胞菌属、黄杆菌属、螺旋体属、盐弧菌属、 非红单胞菌属和双歧微菌属。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于确定样品中多核苷酸的核苷酸 序列的设备，该设备包括电源、阳极、阴极、顺室、反室，其中顺室和反室 被薄膜分开，该薄膜具有多个开孔（孔），其中每个开孔（孔）的直径为大 约0.25nm-大约4nm，导电溶剂、持续性DNA修饰酶、多种dNTP分子、 和金属离子辅因子。

在一个实施方案中，该设备进一步包括至少一种ddNTP分子。在另一 个实施方案中，该装置进一步包括电流表。在优选实施方案中，该开孔直径 为大约2nm。在另一个实施方案中，该导电溶剂是水性溶剂。在可选择的实 施方案中，该导电溶剂是非水性溶剂。在另一个实施方案中，该持续性DNA 修饰酶是DNA聚合酶。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶可耐 受至少0.6M的单价盐。在另一个实施方案中，该单价盐的浓度是饱和的。 在另一个实施方案中，该单价盐的浓度为0.6M至饱和。在另一个实施方案 中，该持续性DNA修饰酶是从中温菌或自然感染中温菌的病毒中分离的。 在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从嗜盐菌或自然感染嗜盐菌 的病毒中分离的。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从极端嗜 盐菌或自然感染极端嗜盐菌的病毒中分离的。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶选自下组中的细菌：富盐 菌（Haloferax）、盐几何菌（Halogeometricum）、盐球菌（Halococcus）、盐 陆生菌（Haloterrigena）、盐红菌（Halorubrum）、盐盒菌（Haloarcula）、盐 杆菌（Halobacterium）、肋生盐弧菌（Salinivibrio costicola）、伸长盐单胞菌 （Halomonas elongata）、以色列盐单胞菌（Halomonas israelensis）、乡土盐 水杆菌（Salinibacter rube）、杜氏盐藻（Dunaliella salina）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、嗜盐放线多孢菌（Actinopolyspora halophila）、嗜 盐海球菌（Marinococcus halophilus）和S.costicola。在另一个实施方案中， 该持续性DNA修饰酶从下组中选出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、 His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢杆菌噬菌体M2DNA聚合酶、 链球菌噬菌体CP1DNA聚合酶、肠杆菌噬菌体DNA聚合酶，及其变体。

在优选实施方案中，该持续性DNA修饰酶是phi29DNA聚合酶。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶来自中度嗜盐菌，其中该 中度嗜盐菌从下组中选出：假单胞菌属、黄杆菌属、螺旋体属、盐弧菌属、 非红单胞菌属和双歧微菌属。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中多核苷酸的 核苷酸序列的装置，该装置包括电源、阳极、阴极、顺室、反室，其中顺室 和反室被薄膜分开，该薄膜具有多个开孔（孔），其中每个开孔（孔）的直 径为大约0.25nm-大约4nm，导电溶剂、持续性DNA修饰酶、多种dNTP 分子、和金属离子辅因子。

在一个实施方案中，该装置进一步包括至少一种ddNTP分子。在另一 个实施方案中，该系统进一步包括电流表。在优选实施方案中，该开孔直径 为大约2nm。在另一个实施方案中，该导电溶剂是水性溶剂。在可选择的实 施方案中，该导电溶剂是非水性溶剂。在另一个实施方案中，该持续性DNA 修饰酶是DNA聚合酶。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶可耐 受至少0.6M的单价盐。在另一个实施方案中，该单价盐的浓度是饱和的。 在另一个实施方案中，该单价盐的浓度为0.6M至饱和。在另一个实施方案 中，该持续性DNA修饰酶是从中温菌或自然感染中温菌的病毒中分离的。 在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从嗜盐菌或自然感染嗜盐菌 的病毒中分离的。在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从极端嗜 盐菌或自然感染极端嗜盐菌的病毒中分离的。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶选自下组中的细菌：富盐 菌（Haloferax）、盐几何菌（Halogeometricum）、盐球菌（Halococcus）、盐 陆生菌（Haloterrigena）、盐红菌（Halorubrum）、盐盒菌（Haloarcula）、盐 杆菌（Halobacterium）、肋生盐弧菌（Salinivibrio costicola）、伸长盐单胞菌 （Halomonas elongata）、以色列盐单胞菌（Halomonas israelensis）、乡土盐 水杆菌（Salinibacter rube）、杜氏盐藻（Dunaliella salina）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、嗜盐放线多孢菌（Actinopolyspora halophila）、嗜 盐海球菌（Marinococcus halophilus）和S.costicola。在另一个实施方案中， 该持续性DNA修饰酶从下组中选出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、 His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢杆菌噬菌体M2DNA聚合酶、 链球菌噬菌体CP1DNA聚合酶、肠杆菌噬菌体DNA聚合酶，及其变体。

在优选实施方案中，该持续性DNA修饰酶是phi29DNA聚合酶。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶来自中度嗜盐菌，其中该 中度嗜盐菌从下组中选出：假单胞菌属、黄杆菌属、螺旋体属、盐弧菌属、 非红单胞菌属和双歧微菌属。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中多核苷酸的核 苷酸序列的方法，该方法包括如下步骤：提供两个分开的相邻的包含液体介 质的室，位于所述两个室之间的界面，该界面具有开孔(孔)，其具有这样的 尺寸，使得一次仅允许一条多核苷酸链以逐个单体的次序从通道的顺侧 (cis-side)向反侧(trans-side)通过；提供具有对多核苷酸的结合活性的持续性 DNA修饰酶；在样品中提供多核苷酸，其中该多核苷酸的一部分是双链一 部分是单链；将该多核苷酸引入到所述两个室的之一中；向同一室内引入酶； 让该持续性DNA修饰酶与该多核苷酸结合；提供两个室之间的电势差，藉 此产生第一极性，该第一极性导致该多核苷酸的单链部分换位穿过该开孔 (孔(transpose through)到反式侧；向同一室内引入酶；让该酶与该多核苷酸结 合；测量通过通道的电流，藉此检测多核苷酸中的核苷酸碱基；第一次降低 电势差；使该多核苷酸的单链部分换位穿过所述开孔；测量电流变化；增加 所述电势差；测量通过通道的电流，藉此检测位于所述开孔(孔)的特定核苷 酸碱基；重复上述任一步骤，藉此确定多核苷酸的核苷酸序列。在一个实施 方案中，该方法进一步包括添加至少一种ddNTP分子的步骤。在另一个实 施方案中，该方法进一步包括其中开孔直径为大约2nm。在另一个实施方案 中，该方法进一步包括其中该液体介质是水性溶剂。在另一个实施方案中， 该方法进一步包括其中该持续性DNA修饰酶是DNA聚合酶。在另一个实 施方案中，该方法进一步包括其中该持续性DNA聚合酶耐受至少0.6M盐。 在另一个实施方案中，该单价盐是饱和的。在另一个实施方案中，该单价盐 的浓度为0.6M至饱和。在另一个实施方案中，该方法进一步包括其中该持 续性DNA修饰酶是从中温菌或自然感染中温菌的病毒中分离的。在另一个 实施方案中，该持续性DNA修饰酶是从嗜盐菌或自然感染嗜盐菌的病毒中 分离的。在另一个实施方案中，该方法进一步包括其中该持续性DNA修饰 酶是从中温菌、嗜盐菌或极端嗜盐菌或自然感染中温菌、嗜盐菌或极端嗜盐 菌的病毒中分离的。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶选自下组中的细菌：富盐 菌（Haloferax）、盐几何菌（Halogeometricum）、盐球菌（Halococcus）、盐 陆生菌（Haloterrigena）、盐红菌（Halorubrum）、盐盒菌（Haloarcula）、盐 杆菌（Halobacterium）、肋生盐弧菌（Salinivibrio costicola）、伸长盐单胞菌 （Halomonas elongata）、以色列盐单胞菌（Halomonas israelensis）、乡土盐 水杆菌（Salinibacter rube）、杜氏盐藻（Dunaliella salina）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、嗜盐放线多孢菌（Actinopolyspora halophila）、嗜 盐海球菌（Marinococcus halophilus）和肋生盐弧菌（S.costicola）。在另一 个实施方案中，该持续性DNA修饰酶从下组中选出：phi29DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶、His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢杆菌噬菌体 M2DNA聚合酶、链球菌噬菌体CP1DNA聚合酶、肠杆菌噬菌体PRD1DNA 聚合酶，及其变体。

在一个优选实施方案中，该持续性DNA修饰酶是phi29DNA聚合酶。

在另一个实施方案中，该持续性DNA修饰酶来自中度嗜盐菌，其中该 中度嗜盐菌从下组中选出：假单胞菌属、黄杆菌属、螺旋体属、盐弧菌属、 非红单胞菌属和双歧微菌属。

在另一个实施方案中，本发明提供了测序多核苷酸的方法，该方法包括 纳入寡聚体的步骤，该寡聚体包括至少一个无碱基核苷酸(abasic nucleotide) 种类。在一个优选实施方案中，该寡聚体包括超过一个无碱基核苷酸。在一 个更优选的实施方案中，该寡聚体包括至少5个无碱基核苷酸。在可选择的 实施方案中，该方法进一步包括纳入含有C3(CPG)间隔物的寡聚体的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于测序多核苷酸的方法，该方法 进一步包括包含一种登记寡聚体(registry oligomer)的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于测序多核苷酸的方法，该 方法进一步包括纳入封闭寡聚体(blocking oligomer)的步骤。在优选实施方案 中，该封闭寡聚体包含至少15个核苷酸。在另一个优选实施方案中，该封 闭寡聚体包含至少20个核苷酸。在另一个优选实施方案中，该封闭寡聚体 包含至少25个核苷酸。在另一个优选实施方案中，该封闭寡聚体包含至少 30个核苷酸。在另一个优选实施方案中，该封闭寡聚体包含至少35个核苷 酸。在另一个优选实施方案中，该封闭寡聚体包含至少40个核苷酸。在另 一个优选实施方案中，该封闭寡聚体包含至少45个核苷酸。在另一个优选 实施方案中，该封闭寡聚体包含至少50个核苷酸。在可选择的实施方案中， 该封闭寡聚体从下组选出：10聚体、15聚体、20聚体、25聚体、30聚体、 31聚体、32聚体、33聚体、34聚体、35聚体、36聚体、37聚体、38聚体、 39聚体、40聚体、50聚体，或其间任意数目的核苷酸。还期望提供具有超 过50个核苷酸的封闭寡聚体。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种测序多核苷酸的方法，其中该 多核苷酸的长度为10个核苷酸-5万个核苷酸。多核苷酸中的核苷酸数目可 以是10,15,20,25,30,35,40,45,50,75,100,150,200,250,300,350,400,450, 500,750,1,000,1,500,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500,5,000,10,000, 15,000,20,000,30,000,40,000,50,000个或其间的任意数目。还可期望测序 超过50,000个核苷酸的多核苷酸。

本发明提供了薄膜装置、系统、以及使用它们的方法。主题装置或系统 包括通过电气通信手段连接的顺室和反室。该顺室和反室被包含至少一个孔 或通道的薄膜分开。在一个优选实施方案中，该薄膜包含具有疏水域和亲水 域的化合物。在一个更优选的实施方案中，该薄膜包含磷脂。该装置或系统 进一步包括用于在顺室和反室之间施加电场的装置。该孔或通道的形状和大 小适于使聚合物通过。在一个优选实施方案中，该孔或通道容纳该聚合物的 一部分而非全部。在另一个优选实施方案中，该聚合物是多核苷酸。在可选 择的优选实施方案中，该聚合物是多肽。本发明提供的其它聚合物包括多肽、 多磷脂、多糖和聚酮。

在一个实施方案中，该薄膜进一步包括与所述聚合物具有结合亲和力的 化合物。在一个优选实施方案中，该结合亲和力(K_a)至少为10⁶l/摩尔。在更 优选的实施方案中，K_a至少为10⁸l/摩尔。在另一优选的实施方案中，该化 合物与至少一个孔相邻。在更优选的实施方案中，该化合物是通道。在另一 个更优选的实施方案中，该通道具有生物活性。在最优选的实施方案中，该 化合物包含所述孔。

在另一个实施方案中，所述孔的大小和形状允许激活物通过，其中该激 活物从下组中选出：ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰基甘油、磷脂酰丝氨酸、 类花生酸（eicosinoids）、视黄酸、维生素D2、抗坏血酸、神经肽、脑啡肽、 内啡肽、4-氨基丁酸（GABA）、5-羟基色胺（5-HT）、儿茶酚胺、乙酰CoA、 S-腺苷甲硫氨酸，和任何其它生物激活物。

在另外一个实施方案中，孔的大小和形状允许辅因子通过，其中辅因子 从下组中选出：Mg²⁺,Mn²⁺,Ca²⁺,ATP,NAD⁺,NADP⁺，和任何其它生物辅因 子。

在优选实施方案中，孔或通道是孔分子或通道分子，并且包括生物分子， 或合成修饰分子，或经过改变的生物分子，或其组合。这些生物分子是例如， 但不限于，离子通道、核苷通道、肽通道、糖转运体、突触通道、跨膜受体 如GPCR等、核孔、合成变体、嵌合变体、或类似物。在一个优选实施方案 中，生物分子是α-溶血素。

作为备选，化合物包含非酶生物活性。具有非酶生物活性的化合物可以 是例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核酸、肽核酸(PNAs)、锁核 酸(LNAs)、吗啉(morpholinos)、糖、脂质、糖磷酸肌醇、脂多糖等。化合物 可以具有抗原活性。化合物可以具有选择性结合性质，藉此聚合物在特殊的 受控环境条件下与化合物结合，但当环境条件改变时，则不结合。这些条件 可以是例如，但不限于，[H⁺]改变、环境温度改变、严紧度改变、疏水性改 变、亲水性改变等。

在另一个实施方案中，本发明提供一种化合物，其中该化合物进一步包 括接头分子，该接头分子从下组中选出：巯基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、 氰基、哌啶基、芴甲氧羰基(Fmoc)、和叔丁氧羰基(Boc)。

在一个实施方案中，该薄膜包含多个孔。在一个实施方案中，该装置包 括多个电极。

多核苷酸

在另一个实施方案中，本发明提供用于控制酶与部分双链性的多核苷酸 的复合体结合的方法，该方法包括：提供两个分开的相邻的介质池和位于该 两个池之间的界面，该界面具有通道，该通道的尺寸仅允许一次让一个多核 苷酸顺次逐个单体地从一个池移向另一个池；提供具有与该部分双链性的多 核苷酸复合体的结合活性的酶；提供包括第一多核苷酸和第二多核苷酸的多 核苷酸复合体，其中该多核苷酸复合体的一部分是双链性的，并且其中该第 一多核苷酸进一步包括与第二多核苷酸不相容的模块；将所述多核苷酸复合 体引入到两个池之一中；将所述酶引入到两个池之一中；在两个池之间施加 电势差，藉此产生第一极性；第一次翻转该电势差，藉此产生第二极性；第 二次翻转电势差以生成第一极性，藉此控制所述酶与所述部分双链性的多核 苷酸复合体的结合。在优选实施方案中，该介质是导电的。在更优选的实施 方案中，该介质是水溶液。在优选实施方案中，所述模块选自下组：肽核酸、 2'-O-甲基、荧光化合物、衍生化核酸、和核酸异构体。在另一个优选实施方 案中，该方法进一步包括如下步骤：测量所述两个池之间的电流；将第一次 诱导第一极性时获得的电流与第二次诱导第一极性时获得的电流进行比较。 在另一个优选实施方案中，本发明进一步包括如下步骤：测量所述两个池之 间的电流；将第一次诱导第一极性时获得的电流值与后来获得的电流值进行 比较。在更优选的实施方案中，酶选自下组：DNA聚合酶、RNA聚合酶、 核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、 激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰化酶。在另一个备选的实施方案中，该方法 进一步包括如下步骤：提供至少一种可触发酶活性的试剂；将该试剂引入含 有多核苷酸复合体的池中；和在合适的温度下温育该池。在更优选的实施方 案中，该试剂选自下组：脱氧核糖核苷酸和辅因子。在更优选的实施方案中， 该脱氧核糖核苷酸在引入该辅因子之前被引入到池中。在另一个还更优选的 实施方案中，该辅因子选自下组：Mg²⁺,Mn²⁺,Ca²⁺,ATP,NAD⁺,和NADP⁺。 在一个实施方案中，将酶引入到与多核苷酸相同的池中。在备选的实施方案 中，将酶引入到相对的池中。

本文公开的发明提供了能够调节混合物中单个多聚体被另一种化合物 (例如酶)作用的速率的装置和方法。该装置和方法还用于确定多核苷酸的核 苷酸碱基序列。本发明特别用于分子生物学、结构生物学、细胞生物学、分 子开关、分子电路和分子计算器，及其制造等领域。

在一个实施方案中，该纳米孔系统能够以大约5Hz-2000Hz的速度控制 分子与聚合物的结合。纳米孔系统能够以例如大约5Hz、大约10Hz、大约 15Hz、大约20Hz、大约25Hz、大约30Hz、大约35Hz、大约40Hz、大 约45Hz、大约50Hz、大约55Hz、大约60Hz、大约65Hz、大约70Hz、 大约75Hz、大约80Hz、大约85Hz、大约90Hz、大约95Hz、大约100Hz、 大约100Hz、大约100Hz、大约100Hz、大约110Hz、大约120Hz、大约 125Hz、大约130Hz、大约140Hz、大约150Hz、大约160Hz、大约170Hz、 大约175Hz、大约180Hz、大约190Hz、大约200Hz、大约250Hz、大约 300Hz、大约350Hz、大约400Hz、大约450Hz、大约500Hz、大约550Hz、 大约600Hz、大约700Hz、大约750Hz、大约800Hz、大约850Hz、大约 900Hz、大约950Hz、大约1000Hz、大约1125Hz、大约1150Hz、大约1175 Hz、大约1200Hz、大约1250Hz、大约1300Hz、大约1350Hz、大约1400 Hz、大约1450Hz、大约1500Hz、大约1550Hz、大约1600Hz、大约1700 Hz、大约1750Hz、大约1800Hz、大约1850Hz、大约1900Hz、大约1950 Hz和大约2000Hz控制分子与聚合物的结合。在优选实施方案中，该纳米 孔系统能够以大约25Hz-大约250Hz的速度控制分子与聚合物的结合。在 更优选的实施方案中，该纳米孔系统能够以大约45Hz-大约120Hz的速度 控制分子与聚合物的结合。在最优选的实施方案中，该纳米孔系统能够以大 约50Hz的速度控制分子与聚合物的结合。

本发明还提供了薄膜装置及其使用方法。主题装置包括通过电气通信手 段连接的顺室和反室。该顺室和反室被包含至少一个孔或通道的薄膜分开。 在一个优选实施方案中，该薄膜包含具有疏水结构域和亲水结构域的第一种 化合物。在更优选的实施方案中，该薄膜包含磷脂。该装置进一步包括用于 在所述顺室和反室之间施加电场的装置。该孔或通道的形状和尺寸适合于聚 合物通过。在一个优选实施方案中，该孔或通道容纳聚合物的一部分而非全 部。在另一个优选实施方案中，该孔或通道容纳聚合物的单体部分而非聚合 物的二聚体部分。在另外一个优选实施方案中，该聚合物是多核苷酸。在可 选择的优选实施方案中，该聚合物是多肽。本发明提供的其它聚合物包括多 肽、磷脂、多糖和聚酮。

在一个实施方案中，该薄膜进一步包括对聚合物具有结合亲和力的第二 种化合物。在一个优选实施方案中，该结合亲和力(K_a)至少为10⁶l/摩尔。在 更优选的实施方案中，K_a至少为10⁸l/摩尔。在另一优选的实施方案中，该 化合物与至少一个孔相邻。在更优选的实施方案中，该化合物是通道。在另 外更优选的实施方案中，该通道具有生物活性。在最优选的实施方案中，该 化合物包含所述孔。

在一个实施方案中，所述第二种化合物包含酶活性。该酶活性可以是例 如，但不限于，蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转 移酶、甲基化酶、乙酰化酶、连接酶、裂合酶等的酶活性。在更优选的实施 方案中，该酶活性可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外 切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、激酶、磷酸酶、甲 基化酶、乙酰化酶等的酶活性。

在一个优选实施方案中，DNA聚合酶是从嗜盐微生物中分离的。在备 选的优选实施方案中，DNA聚合酶是从嗜盐微生物中分离的DNA聚合酶的 天然存在变体。在备选的优选实施方案中，DNA聚合酶是从嗜盐微生物中 分离的DNA聚合酶的合成变体。在备选的优选实施方案中，DNA聚合酶是 合成组合物，其具有从嗜盐微生物分离的DNA聚合酶的酶学性质，或者具 有从嗜盐微生物分离的DNA聚合酶的天然发生变体的酶学性质。在更优选 的实施方案中，该嗜盐微生物是极端嗜盐微生物。在另一更优选的实施方案 中，该嗜盐微生物是中度嗜盐微生物。

在另一优选的实施方案中，该嗜盐微生物在选自下组的环境条件中生长 旺盛：温度等于或大于50°C，压力等于或大于200kPa，pH等于或小于6.5， pH等于或大于7.5，盐度等于或大于0.5M。例如，温度可以是50°C,55°C, 60°C,65°C,70°C,75°C,80°C,85°C,90°C,95°C,和99°C。在另一实例中， pH可以是2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.5,8.0,8.5,9.0,和9.5。

在备选的优选实施方案中，DNA聚合酶是从能够感染嗜盐微生物的病 毒中分离的。在备选的优选实施方案中，DNA聚合酶是从能够感染嗜盐微 生物的病毒分离出的DNA聚合酶的天然发生变体。在备选的优选实施方案 中，DNA聚合酶是从能够感染嗜盐微生物分离的病毒中分离的DNA聚合酶 的合成变体。在另外备选的优选实施方案中，DNA聚合酶是合成组合物， 其具有从能够感染嗜盐微生物分离的病毒中分离的DNA聚合酶的酶学性 质，或者具有从能够感染嗜盐微生物分离的病毒中分离的DNA聚合酶的天 然发生变体的酶学性质。在更优选的实施方案中，该嗜盐微生物是极端嗜盐 微生物。在备选的实施方案中，该能够感染嗜盐微生物的病毒在从下组选出 的环境条件下具有感染性：温度等于或大于50°C，压力等于或大于200kPa， pH等于或小于6.5，pH等于或大于7.5，盐度等于或大于0.5M。例如，温 度可以是50°C,55°C,60°C,65°C,70°C,75°C,80°C,85°C,90°C,95°C,和 99°C。在另一实例中，pH可以是2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.5, 8.0,8.5,9.0,和9.5。

第二种化合物可具有选择性结合性质，藉此聚合物在特定的受控环境条 件下与第二种化合物结合，而当环境条件改变时则不结合。这样的条件可以 是例如，但不限于，[H⁺]改变、环境温度改变、严紧度改变、疏水性改变、 亲水性改变等。

在另一个实施方案中，孔的尺寸和形状允许激活物通过，其中激活物选 自下组：ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰基甘油、磷脂酰丝氨酸、类花生酸、 视黄酸、维生素D2、抗坏血酸、神经肽、脑啡肽、内啡肽、4-氨基丁酸（GABA）、 5-羟基色胺（5-HT）、儿茶酚胺、乙酰CoA、S-腺苷甲硫氨酸，和任何其它 生物激活物。

在另外一个实施方案中，孔的尺寸和形状允许允许辅因子通过，其中辅 因子从下组中选出：Mg²⁺,Mn²⁺,Ca²⁺,ATP,NAD⁺,NADP⁺，和任何其它生物 辅因子。

在优选实施方案中，孔或通道包括生物分子，或合成修饰的或经过改变 的生物分子。这些生物分子是例如，但不限于，离子通道、核苷通道、肽通 道、糖转运体、突触通道、跨膜受体如GPCR等、核孔、等等。

在备选的实施方案中，第二种化合物包含非酶生物活性。具有非酶生物 活性的第二种化合物可以是例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核 酸、肽核酸(PNAs)、锁核酸(LNAs)、吗啉(morpholinos)、糖、脂质、糖磷酸 肌醇、脂多糖等等。

在另一个实施方案中，本发明提供了第三种化合物，其中该第三种化合 物进一步包括接头分子，该接头分子选自下组：巯基、硫醚基、磷酸基、硫 酸基、氰基、哌啶基、芴甲氧羰基、和叔丁氧羰基。

在一个实施方案中，该薄膜包括多个孔。在一个实施方案中，该装置包 括多个电极。

本发明还构想了使phi29DNA聚合酶(DNAP)与单链DNA(ss-DNA)结 合，藉此降低该ss-DNA在施加的180mV电压下穿过α-溶血素纳米孔的速 度的方法。在优选实施方案中，单链DNA以接近1个核苷酸/1-100ms的速 度穿过phi29DNAP和α-溶血素纳米孔。在另一个实施方案中，该速度为1 个核苷酸/100-1000ms。

本发明还构想了使用引物DNA5′端来保护模板3′端免于DNA聚合酶 (DNAP)消化的方法。

本发明还构想了在3′端上共价连接C3(CPG)间隔物，后随无碱基残基， 来防止DNA的核酸外切消化的方法。

本发明还构想了通过将修饰的DNA寡聚体结合到引物模板结合点附 近，来保护引物DNA免于phi29DNAP功能的方法。在优选实施方案中， phi29结合于寡聚体5′端，并且施加180mV电势将该复合体捕获在α-溶血 素纳米孔上从而除去该寡聚体并将phi29置于引物末端，然后DMA复制可 得以进行。

本发明还构想了使用登记寡聚体(registry oligomer)，优选地经过修饰的 DNA寡聚体，来控制phi29DNAP在ss-DNA上何处结合并坐落的方法。施 加180mV电势将这些DNAP-DNA复合体捕获在α-溶血素纳米孔上从而除 去该寡聚体并容许s-DNA移位通过phi29DNAP和α-溶血素。

本发明还构想了一种方法，其中通过施加的电压(180mV)使phi29DNAP 结合的dsDNA解链(unzip)。在优选实施方案中，电压降低允许DNA重新合 链(re-zipping)。恢复电压再次使DNA解链，这允许DNA通过所述纳米孔来 回移动。

本发明还构想使用结合在DNA引物/转录本连接点处的封闭寡聚体，由 此当寡聚体被捕获在纳米孔上时，寡聚体被剥离，随后DNA被活化，以便 步进地通过(ratcheting through)纳米孔。

本发明还构想了使用更短的封闭寡聚体并降低封闭从DNA解离寡聚体 所需的时间。在优选实施方案中，这允许供复制的DNA分子在纳米孔上的 更快激活，并提高纳米孔用于测序应用的通量。

本发明还构想了一种多核苷酸测序(sewquencing)方法，该方法包括确定 信号中的噪音水平的步骤，噪音水平代表了诱发信号的核苷酸与之前诱发信 号的核苷酸和之后的诱发信号的核苷酸相比的同一性。在优选实施方案中 个，该信号是两个相邻池之间测得的电流的变化。在更优选的实施方案中， 对于某一核苷酸而言，当之前的核苷酸和/或之后的核苷酸是不同的核苷酸 时，测得的噪音水平更高。

本发明还构想了一种多核苷酸测序方法，该方法包括以较其他其它 dNTP更低的浓度纳入某种dNTP的步骤，藉此降低DNAP反应的速度。在 一个实施方案中，该dNTP的浓度比其它dNTP低约一个数量级。在更优选 的实施方案中，该dNTP的浓度比其它dNTP低约两个数量级。

附图简述

图1图示了本发明的一个实施方案，通过该方案phi29DNA聚合酶 (phi29DNAP)和DNA之间的二元聚合物能够被几乎无限地保留在纳米孔 上。图1还图示了本发明的一个实施方案，藉此DNA双链体可以被施加的 跨纳米孔电压系统地解链。

图2图示了本发明的一个实施方案，通过该方案与phi29DNAP结合的 DNA双链体可以被施加的跨纳米孔电压系统地解链，然后在更低的电势差 下重新合链。图2还图示了本发明的一个实施方案，其显示了野生型phi29 DNAP的持续性核酸外切酶如何能够系统地使DNA步进通过纳米孔；该过 程可通过dNTP浓度和所施加的跨纳米孔电压加以控制。单个DNA模板可 以通过单个结合的phi29DNAP的聚合酶结构域和核酸外切酶结构域来回通 过纳米孔；这些竞争性运动可以通过电压和dNTP浓度加以控制。

图3图示了本发明的一个实施方案，通过该方案，phi29DNAP的聚合 酶催化位点中正确dNTP的结合和解离可以通过跨纳米孔的离子电流来衡 量；活性可能依赖于浸浴纳米孔的缓冲液中的正确dNTP的浓度。此外，这 些图显示，离子闪烁(ionic flicker)能够预测由DNA链上与给定单体直接相邻 的单体产生的离子电流；该过程可能依赖于与phi29DNAP聚合酶位点中的 模板核苷酸互补的dNTP的浓度。图3还图示了使用以ddNMP(3′–H)为末端 的引物链以及与phi29DNAP催化位点的模板碱基互补的dNTP如何可以在 体相（bulk phase）中在固定的ssDNA/dsDNA结合点处维持DNA模板/引物 对；通过包含与ddNMP(3′–H)末端类似的ddNMP(3′–H)，可以增强对 ssDNA/dsDNA结合点的保护。

图4图示了导致ddNMP(3′–H)末端切离的纳米孔电压是如何增强供复 制的DNA激活的（如图3所示）。

图5图示了本发明的一个实施方案，其显示了溶液中的dNTP是如何影 响DNA复制的持续进行，其中取决于它们的存在或浓度，dNTP导致暂停 (pauses)和独特的标记电流(signature currents)。

图6图示了本发明的一个实施方案，其显示phi29DNAP可以在所施加的 至少300mV的跨纳米孔电压下复制DNA模板；DNA复制速度可以通过所 施加的电压加以调节。

图7图示了本发明的一个实施方案，其显示可以被phi29DNAP转位通过 纳米孔的DNA模板的长度(碱基数)依赖于被纳米孔捕获的DNA的长度。该 图还显示，phi29DNAP能够在0.6M KCl下在纳米孔上复制DNA。

图8图示了与图7b相同的数据，显示了在多核苷酸通过纳米孔期间的不 同阶段的多核苷酸和DNAP的状态。无碱基残基用红色显示。

图9图示了本发明的示例性实施方案，显示噪音（作为所测量的电流） 能够指示之前和之后核苷酸单体同一性；当第一链上的居中氨基酸的在先和 在后核苷酸与第二直系同源链上(其中居中核苷酸与第一链相同)观察到的在 先和在后核苷酸不同时，观察到的来自第一链上的居中氨基酸的噪音幅度不 同。

图10图示了使phi29DNA聚合酶(DNAP)与单链DNA(ss-DNA)结合显著 降低ss-DNA在180mV的施加电势下穿过α-溶血素纳米孔的速度。

图11图示了通过在引物模板结合点附近结合经过修饰的DNA寡聚体， 可以保护引物DNA链免于phi29DNAP的功能；phi29结合寡聚体5′-端，并 通过施加的180mV电势将该复合体捕获在α-溶血素纳米孔上而除去该寡聚 体并将phi29置于引物末端，然后可以发生DNA复制。

图12图示了phi29DNAP能够结合并沿着ss-DNA移动；使用登记寡聚 体(一种经过修饰的寡聚体)来控制phi29DNAP在ss-DNA上何处结合并坐 落。

图13图示了具有3′–5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶能够消化模板 DNA的3′端；该方法使用引物DNA5′端保护模板3′端免于被DNA聚合酶 (DNAP)消化。

图14图示了如何能够通过稀释dNTPs控制DNA模板的合成速度。

图15-19图示了实验结果，显示电压激活的DNA在纳米孔中向前和向后 步进。

图15.纳米孔装置的组件。a)纳米孔装置。将单α-HL纳米孔插入在分 隔两个池的脂双层中，每池含有100μl缓冲KCl溶液。向顺室添加带负电荷 的单链DNA(ssDNA)。施加跨池的电压（反式侧+），驱动离子电流通过孔（例 如在0.3M KCL,180mV下60pA），并导致ssDNA进入和转位通过纳米孔。 b)P/t DNA被保护免于phi29DNAP引导的消化和延长的示意图。引物DNA 链需要在体相(bulk phase)中被保护免于合成和消化，但是在纳米孔中被激活 用于合成。这可以通过将经过修饰的封闭寡聚体在p/t结合点处退火实现。 (i)显示了p/t(23nt/79nt)底物和25nt封闭寡聚体结合位点弯曲红线）。封闭寡 聚体含有3′-C3间隔物，随后是6个无碱基残基(Xs)，以防护降解并方便在 纳米孔上除去。版本iii含有2个5′-吖啶残基(Zs)。c)使用封闭寡聚体保护体 相中p/t DNA。将不存在或存在寡聚体ii或iii的b.i)中的DNA p/t底物与指 示的phi29DNAP,dNTPs,和Mg²⁺一起温育。在没有封闭寡聚体的条件下， Phi29DNAP消化(-dNTPs,泳道3)并延长(+dNTPs,泳道4)了引物。在存在 封闭寡聚体(i)或(ii)的条件下，引物链被保护免于消化(-dNTPs,泳道6,9)和 延长(+dNTPs,泳道7,10)。

图16。DNA向前或向后步进通过纳米孔。(a)用于步进通过纳米孔的P/t DNA。图16b（红线）的封闭寡聚体iii保护引物免于体相中的催化。模板 25-29位的5个无碱基残基(Xs)在通过纳米孔时会在电流中产生峰(引用)。 (b,c)DNA向前或向后步进通过纳米孔。(a)通过施加的电压将预负载phi29 DNAP的p/t DNA捕获在纳米孔上(i)。捕获开始时将无碱基插入物置于纳米 孔上方(红圈)。所施加的电压强迫封闭寡聚体/模板双链体发生非催化解链， 导致当无碱基插入物向前步进通过纳米孔时在电流中产生一个35pA峰(ii)。 (iii)进一步的解链除去封闭寡聚体，并将phi29DNAP置于引物/模板结合点 处。在dNTPs和Mg²⁺存在下，phi29DNAP随后持续复制25个DNA碱基， 导致无碱基插入物反向步进通过纳米孔，并再次出现35pA电流峰(iv)。当无 碱基插入物到达聚合酶活性位点时，复制停止(v)。(d)反向DNA步进是复制 依赖性的。用2’,3’-双脱氧胞嘧啶代替引物3’-脱氧胞嘧啶会导致第二个峰的 出现延迟（红色箭头）。Phi29DNAP最终切除末端双脱氧胞嘧啶，起始DNA 合成，并导致第二个35pA峰的穿越(traversal)。

图17.报告正向和反向DNA步进的离子电流信号分析。(a)显示检测到 的来自单个分子正向/反向步进通过纳米孔的离散振幅的离子电流轨迹。总共 检测到33个离散振幅，它们相对一个共同的25pA振幅（位置0）对称。在 分子与分子之间，振幅被随机跳过（例如位置-4和-3）或重复（例如位置14 和15）。(b)(a)中所示电流振幅的参考图谱(Reference map)。(c)在单次5hr 实验处理的200个分子中，(b)中每个振幅位置被跳过（黑色向上条棒）或重 复（灰色向下条棒）的次数百分比。(d)对于(c)中分析的分子，两个相应振 幅（例如位置-15和15）均被跳过（黑色向上条棒）或重复（灰色向下条棒） 的次数百分比。

图18.DNA复制对关键dNTP底物的依赖性。(a)用于步进通过纳米孔的 P/t DNA。单个脱氧鸟嘌呤（红色箭头）位于p/t结合点与无碱基插入物之间 的+16位。在无dCTP的条件下，DNA合成将在dGTP处终止，并将无碱基 残基放置在纳米孔+8-+12位之间，这会使产生离子电流在25pA–31pA之间 的分叉(JACS)。(b)在无dCTP的条件下，(a)中的DNA构建体正向/反向步 进通过纳米孔。在第一个35pA被穿过后，离子电流停止在第二个峰，并在 25pA-31pA之间分叉。(b)在存在dCTP的条件下，(a)中的DNA构建体正 向/反向步进通过纳米孔。在第一个35pA被穿过后，离子电流继续通过第二 个35pA峰而无停止。这些数据支持我们的主张，即第二个35pA峰依赖于 酶介导的DNA复制。

图19.为提高纳米孔上通量(throughput)而优化的封闭寡聚体。(a)与p/t DNA底物结合的优化封闭寡聚体(红线)。将模板链的互补序列从25nt缩短 到15nt，以便于封闭寡聚体倍更快地从纳米孔上除去。(b)使用(a)中的优化 封闭寡聚体在体相中保护p/t DNA。在不存在或存在封闭寡聚体的条件下， 将p/t DNA底物phi29DNAP、dNTPs、和Mg²⁺(如标明的)一起温育。在没有 封闭寡聚体时，Phi29DNAP消化(-dNTPs,泳道3)并延长(+dNTPs,泳道4) 引物。在存在封闭寡聚体时，引物链被保护免于消化(-dNTPs,泳道6)和延长 (+dNTPs,泳道7)。反应在23°C纳米孔缓冲液中运行5小时。

序列表说明

SEQ ID NO:1显示了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN;Stoddart et  al.,PNAS,2009;106(19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:2显示了α-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示了经密码子优化的编码Phi29DNA聚合酶的多核苷 酸序列。

SEQ ID NO:4显示了Phi29DNA聚合酶的氨基酸序列。

SEQ ID NOs.:5-28是实施例中使用的合成多核苷酸序列（模板、寡聚体 和封闭寡聚体）。

发明详细说明

本文中公开的实施方案是例证和解释性的，不意味着对本发明有限制。 在不背离本发明权利要求范围的情况下，可以利用其它的实施方案和结构改 变。本文通过提述并入这里引用的所有公开出版物、专利和专利申请(无论 是在上文还是在下文中)的全部内容。

如这里和附加权利要求中所使用的，除非明确指出，否则单数形式“一 个/种”和“该”包括复数指代。因此，例如，“纳米孔”包括多个这样的纳米孔， “信号”表示或一个多个信号或其等价物，等等。

“多核苷酸”是指DNA或RNA，包括任何天然出现的、合成的或经过修 饰的核苷酸。核苷酸包括，但不限于，ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、 UTP、TTP、dUTP、5-甲基-CTP、5-甲基-dCTP、ITP、dITP、2-氨基-腺嘌呤 -TP、2-氨基-脱氧腺嘌呤-TP、2-硫代胸腺嘧啶三磷酸、吡咯并嘧啶三磷酸、 2-硫代胞苷、以及上述全部的α-硫代三磷酸化物、和上述全部碱基的2'-O- 甲基-核糖核苷三磷酸化物。修饰的碱基包括，但不限于，5-Br-UTP,5-Br-dUTP, 5-F-UTP,5-F-dUTP,5-丙炔基dCTP,和5-丙炔基-dUTP。

“转运性质”的意思是在多聚体相对于纳米孔移动期间可以测量的性质。 转运性质可以是，例如，溶剂、聚合物、聚合物上的标签、其它溶质（例如 离子）的功能、或者纳米孔与溶剂或聚合物之间的相互作用。

“发夹结构”的定义是如下的寡核苷酸，其具有长度为大约6-大约10,000 个核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列的第一部分与其第二部分至少部分地 互补，藉此造成自身多核苷酸折叠，形成二级发夹结构。

“同一性”或“相似度”是指两条多核苷酸序列之间或两条多肽序列之间的 序列相似度，同一性是更严格的比较。词语“百分比同一性”和“%同一性”是 指，在比较两条或多条多核苷酸序列或两条或多条多肽序列时发现的序列相 似度的百分比。“序列相似度”是指两条或多条多核苷酸序列之间碱基对序列 的百分比相似度（通过任何合适的方法确定）。两条或多条序列可以为0-100% 相似，或者它们之间的任意整数值。同一性或相似度可以通过比较每条序列 内的某个位置加以确定，该位置可以出于比较目的而进行比对。当被比较序 列的某个位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则各分子在该位置是相 同的。多核苷酸序列之间的相似度或同一性的程度是各多核苷酸序列共有的 位置上的相同或匹配核苷酸的数目的函数。多肽序列的同一性的程度是各多 肽序列共有的位置上的相同氨基酸的数目的函数。多肽序列的同源性或相似 度的程度是各多肽序列共有的位置上的氨基酸的数目的函数。

术语“不相容”是指分子的化学性质使得两个分子或其部分不能彼此物 理地和/或化学地相互作用。例如，包含核苷酸的聚合物的一部分可能与包含 核苷酸及另一种化学模块(例如肽核酸、2'-O-甲基、荧光化合物、衍生化核 苷酸、核苷酸异构体等)的聚合物的一部分不相容。在另一个实例中，包含 氨基酸残基的聚合物的一部分可能与包含氨基酸残基及另一种化学模块(例 如硫酸基、磷酸基、乙酰基、氰基、哌啶基、荧光基团、唾液酸基团、甘露 糖基团等)的聚合物的一部分不相容。

“比对/对准”是指多个DNA或氨基酸序列通过沿长度方向比较而对准， 从而使共同的组分（例如核碱基或氨基酸残基）可以通过目测容易地鉴定出 来。共同组分的分数或百分比与序列间同源性或同一性有关。比对可用于鉴 定保守的结构域和这些结构域内的相关性。比对可以通过本领域已知的计算 机程序合适地加以确定，例如MACVECTOR软件(1999)(Accelrys,Inc.,San  Diego,CA)。

术语“高度严格”或者“高度严格条件”是指允许序列高度互补的DNA链 相互杂交的条件，其中相同的这些条件排除显著不匹配的DNA杂交。能够 在严格条件下与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸序列可以是，例如，所公开 多核苷酸序列的变体，包括等位基因或剪接变体，或者编码本公开多肽直系 同源物或旁系同源物的序列。多核苷酸杂交方法在下列文献中有详细的公 开：Kashima等(1985)Nature313:402-404,和Sambrook等(1989)分子克隆: 实验室手册,第二版,冷泉港实验室,冷泉港,纽约("Sambrook");和 Haymes等"Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach",IRL出版社,华 盛顿特区(1985)，本文引用其内容作为参考。

一般地，严紧度由杂交和清洗程序中使用的温育温度、溶液的离子强度、 和变性剂（例如甲酰胺）的浓度决定（建立和确定严紧度的更详细的描述， 见下文）。两条核酸在各种严紧度条件下杂交的程度与它们的相似性程度相 关。因此，来自各种来源的相似多核苷酸序列，例如处于某一生物体的基因 组内（如直系同源物的情况）和来自另一生物体并可能实施相似功能的序列 （如旁系同源物的情况），可以根据其与未知肽编码序列杂交的能力加以分 离。用于进行多核苷酸杂交以分离与本领域已知序列具有相似性的序列的条 件和方法可以有大量的变化形式，并不仅限于本文明确公开的示例。这样的 方法可用于分离与所公开序列具有各种程度的相似性的多核苷酸序列，例如 与公开的序列具有60%同一性的序列，或者更优选地，具有大于大约70%同 一性的序列，最优选地，与所公开序列具有72%或更大同一性的序列，其中 所得的序列具有生物活性。

发明方法

本发明提供了测序靶多核苷酸的方法。该方法包括使靶多核苷酸与孔和 Phi29DNA聚合酶接触，从而使聚合酶控制靶多核苷酸通过孔的移动，并使 靶多核苷酸的一部分与孔相互作用。测量每次相互作用期间通过孔的电流， 这确定靶多核苷酸的序列。步骤(a)和(b)在所施加的跨越所述孔的电压下实 施。这样，使用链测序(strand sequencing)对靶多核苷酸测序。

如上面所讨论的，Phi29DNA聚合酶发挥类似分子刹车的作用，控制多 核苷酸沿着所施加电压产生的场移动通过孔。该方法具有多种优点。例如， 靶多核苷酸以商业上可行并且能够高效测序的速度移动通过孔。该方法还可 以按照根据Phi29DNA聚合酶的三种模式产生的三种优选途径的其中之一 加以实施。这在下文有更详细的讨论。每种途径均包括校读(proofreading)序 列的方法。

本发明的方法用于多核苷酸测序。多核苷酸，例如核酸，是包含两个或 多个核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包含任何核苷酸的任何组合。多核 苷酸或核酸可以是天然存在型或者是人工的。核苷酸可以被氧化或甲基化。 核苷酸典型地含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。核碱基典型地是杂环的。 核碱基包括，但不限于，嘌呤和嘧啶，更具体地，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧 啶、尿嘧啶和胞嘧啶。糖典型地是五糖。核苷酸糖包括，但不限于，核糖和 脱氧核糖。核苷酸典型地是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸典型地含 有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以附着在核苷酸的5’或3’侧。

核苷酸包括，但不限于，腺苷单磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷 三磷酸(ATP)、鸟苷单磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、 胸苷单磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷单磷酸(UMP)、 尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷单磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、 胞苷三磷酸(CTP)、环腺苷单磷酸(cAMP)、环鸟苷单磷酸(cGMP)、脱氧腺苷 单磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟 苷单磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧 胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧 尿苷单磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱 氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。 核苷酸优选地选自下组：AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP 或dCMP。

核苷酸可以含有糖和至少一个磷酸基团（即缺少核碱基）。

多核苷酸可以是单链或双链的。多核苷酸的至少一部分优选是双链的。

多核苷酸可以是核酸，例如脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）。 靶多核苷酸可以包括杂交在一起的一条DNA和一条RNA。多核苷酸可以是 本领域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核 酸(TNA)、锁核酸(LNA)、或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。

可以用本方法对靶核酸序列的全部或仅一部分测序。靶多核苷酸可以是 任何长度。例如多核苷酸的长度可以是至少10个、至少50个、至少100个、 至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500 个核苷酸对。多核苷酸的长度可以是1000或更多个核苷酸对，5000或更多 个核苷酸对，或者10000或更多个核苷酸对。

靶多核苷酸存在于任何合适的样品中。本发明典型地在已知含有或怀疑 含有靶多核苷酸的样品上实施。可选择地，可以在样品上实施本发明以确认 已知存在或预期存在于该样品中的一个或多个靶多核苷酸的身份。

样品可以是生物样品。本发明可以在体外对从任何生物体或微生物获得 的或分离的样品实施。生物体或微生物典型地是原核或真核的，并且典型地 属于下列五界之一：植物界、动物界、菌物界、原核生物界和原生生物界。 本发明可以在体外对从任何病毒获得的或者分离的样品实施。样品优选地是 液体样品。样品典型地包括患者的体液。样品可以是尿液、淋巴、唾液、粘 液或羊水，但优选地是血液、血浆或血清。典型地，样品是人类来源的，但 另外也可以来自其它哺乳动物，例如来自商业豢养动物如马、牛、羊或猪， 或者另外也可以来自宠物，如猫和狗。或者，植物来源的样品可以典型地从 如下获得：商业作物，如谷物、豆科植物、水果或蔬菜，例如小麦、大麦、 燕麦、芸苔、玉米、大豆、水稻、香蕉、苹果、番茄、土豆、葡萄、烟草、 豆类、小扁豆、甜菜、可可、棉花。

样品可以是非生物样品。非生物样品优选地是液体样品。非生物样品的 实例包括手术液(surgical fluid)，水如饮用水、海水或河水，和实验室检测用 试剂。

样品典型地在被测定之前经过处理，例如通过离心或流过膜以过滤掉不 想要的分子或细胞，例如红细胞。样品可以在取样后立即进行测量。样品也 可以典型地在测试之前保存，优选地在低于-70°C下保存。

跨膜孔是一种如下的结构，其允许水合离子在施加电势的驱动下从膜的 一侧流到膜的另一侧。

任何膜均可根据本发明使用。合适的膜是本领域众所周知的。膜优选地 是两亲性层。两亲性层是由两亲性分子例如磷脂形成的层，两亲性分子同时 具有亲水和亲脂性质。

膜优选地是脂双层。脂双层是细胞膜的模型，是多种多样的实验研究的 优良平台。例如，脂双层可以用于通过单通道记录对膜蛋白进行体外研究。 可选择地，脂双层可以用作生物传感器，探测多种物质的存在。脂双层可以 是任何脂双层。合适的脂双层包括，但不限于，平面脂双层、支撑双层 (supported bilayer)或脂质体。脂双层优选地是平面脂双层。在下列文献中公 开了合适的脂双层：国际专利申请No.PCT/GB08/000563(公开为WO 2008/102121)、国际专利申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734) 和国际专利申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO2006/100484)。

用于形成脂双层的方法是本领域已知的。合适的方法在实施例中有公 开。脂双层通常通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972;69: 3561-3566)的方法形成，其中脂单层被携载在水溶液/空气界面上，并通过与 该界面垂直的孔的某一侧。

Montal和Mueller的方法之所以流行是因为，它是形成适合于蛋白孔插 入的高品质的脂双层的一种成本高效并且相对直观的方法。其它常用的形成 双层的方法包括头部浸渍(tip-dipping)、涂布双层(painting bilayer)和膜片钳 (patch-clamping)脂质体双层。

在一个优选实施方案中，按照国际专利申请No.PCT/GB08/004127(公 开为WO2009/077734)所述形成脂双层。该方法中优选的是，从干燥脂质形 成脂双层。在一个最为优选的实施方案中，按照WO2009/077734 (PCT/GB08/004127)所述形成跨越开孔的脂双层。

在另一个优选实施方案中，膜是固态层。固态层不是生物来源的。换言 之，固态层不是来自于或者分离自生物环境，例如生物体或细胞，或者生物 可得结构的合成制造版本。固态层可以用有机或无机材料形成，包括但不限 于，微电子材料、隔热材料如Si3N4,A1203,和SiO，有机和无机聚合物如 聚酰胺、塑料如特氟纶或弹性体如二组分加成硫化型硅橡胶 （two-component addition-cure silicone rubber）和玻璃。固态层可以用石墨烯 形成。合适的石墨烯层在国际专利申请No.PCT/US2008/010637(公开为WO 2009/035647)中有公开。固态层可以用硅、氮化硅或石墨烯形成。固态层可 以进一步包括固态孔或多个这样的孔。固态层或孔可以进一步包括通过共价 键连接的接头基团化合物。DNA聚合酶可以用合适的接头基团附着到固态 层或固态孔上。

方法的实施典型地使用(i)包含孔的人工双层，(ii)包含孔的分离的天然存 在型脂双层，或(iii)其中插入有孔的细胞。方法优选地用人工脂双层实施。 除了孔之外，双层可以包括其它跨膜和/或膜内蛋白质以及其它分子。下文参 考本发明的测序实施方案讨论了合适的装置和条件。本发明的方法通常在体 外实施。

跨膜孔优选的是跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是一种多肽或多肽的集合，其 允许水合离子，如分析物，从膜的一侧流到膜的另一侧。在本发明中，跨膜 蛋白孔能够形成在施加的电势的驱动下允许水合离子从膜的一侧流向另一 侧。跨膜蛋白孔优选地允许分析物，例如核苷酸，从膜，例如脂双层，的一 侧流向另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸，例如DNA或RNA，移动通过孔。

跨膜蛋白孔可以是单体或寡聚体。孔优选地由数个重复亚单位，例如6、 7或8个亚单位构成。孔更优选地是七聚体或八聚体孔。

跨膜蛋白孔典型地包括离子可以流过的桶或通道。孔的亚单位典型地围 绕中心轴，并为跨膜桶或通道或跨膜α-螺旋束或通道的贡献链(strand)。

跨膜蛋白孔的桶或通道典型地包括方便与分析物，如核苷酸、多核苷酸 或核酸，相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选地位于桶或通道的缢痕 (constriction)位置附近。跨膜蛋白孔典型地包括一个或多个带正电的氨基酸， 例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸，例如酪氨酸或色氨酸。这 些氨基酸典型地有利于孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。

根据本发明使用的跨膜蛋白孔可以来自β-桶孔或α-螺旋束孔。β-桶孔包 括由β-链形成的桶或通道。合适的β-桶孔包括，但不限于，β-毒素，例如α- 溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素(leukocidins)，和细菌的外膜蛋白/孔蛋白， 例如耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)如MspA，外膜孔 蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌属自主转 运体脂蛋白(autotransporter lipoprotein)(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成 的桶或通道。合适的α-螺旋束孔包括，但不限于，内膜蛋白和α外膜蛋白， 如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以来自Msp或α-溶血素(α-HL)。

Phi29DNA聚合酶

为了克服上面公开的限制（T7DNAP(外切-)-DNA复合体在负载下(under  load)稳定性低、在80mV电压下信噪比减小、以及聚合酶的周转率(turnover  rate)高），我们检查了其它的DNA修饰酶，当它们被定位在纳米孔洞口处时， 它们的结构和功能性质可能有利于持续性催化。一个引人注意的候选者是细 菌噬菌体phi29DNA聚合酶(phi29DNAP)(Blanco,L.;Salas,M.J.Biol.Chem. 1996,271,8509-8512;(19)Salas,M.;Blanco,L.;Lázaro,J.M.;de Vega,M. IUBMB.Life2008,60,82-85)。这种来自B族DNA聚合酶的DNA依赖的DNA 复制酶在单独一条～66.5kDa蛋白链内同时包含5′-3′聚合酶和3′-5′核酸外 切酶功能。在保证细菌噬菌体phi29线性染色体末端完整性的初始蛋白引发 阶段(protein-primed stage)之后，phi29DNAP过渡到DNA引发阶段，并复制 整个19.2千碱基细菌噬菌体基因组，而无需辅助蛋白如滑动钳(sliding clamp) 或解旋酶(Salas,M.Annu.Rev.Biochem.1991,60,39-71)。在与DNA引发底物 的一次结合事件后，这种高持续性聚合酶能够在体外催化至少70千碱基的 DNA的复制(Blanco,L.;Bernad,A.;Lázaro,J.M.;Martín,G.;Garmendia,C.; Salas,M.J.Biol.Chem.1989,264,8935-940)。

phi29DNAP的晶体结构显示了这种显著持续性的结构基础。phi29 DNAP的聚合酶结构域享有保守的掌状(palm)、指状(finger)和拇指状(thumb) 亚结构域的构造，近似一只部分打开的右手。此外，一个蛋白引发DNA聚 合酶特有的32氨基酸β-发夹插入物与掌状和拇指状亚结构域一起包围引物- 模板DNA，提示这种结构可以按照与滑动钳蛋白所实现的相似的方式提高 持续性(Johnson,A.;O'Donnell,M.Annu.Rev.Biochem.2005,74,283-315)。相 同的β-发夹还形成围绕下游模板DNA的通道的一部分。这些特征表明，β- 发夹插入物可同时促进强DNA结合和phi29DNAP的持续性。与这个预测 一致的是，缺失β-发夹产生的突变体phi29DNAP显示分散的DNA合成活 性，而不是野生型酶的持续合成活性，并且对引物-模板二聚体DNA的结合 亲和力显著降低(Rodríguez,I.;Lázaro,J.M.;Blanco,L.;Kamtekar,S.;Berman, A.J.;Wang,J.;Steitz,T.A.;Salas,M.;de Vega,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2005,102,6407-6412)。

使用光镊的实验显示，phi29DNAP能够逆着所施加的最高达～37pN的 负载沿着模板前行数百个核苷酸，提示这种酶能够复制被滞留在纳米孔上的 DNA。这里，我们显示，当被捕获在跨α-HL纳米孔的电场内时，phi29 DNAP-DNA复合体的稳定性比KF(外切-)-DNA复合体大3-4个数量级。通 过利用野生型phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶活性切割3′-H末端残基，产 生引物链3′-OH，激活被捕获复合体中的DNA底物以供复制。在脱氧核苷 三磷酸(dNTPs)的存在下，DNA合成被启动，使得实时检测大量核苷酸顺次 添加成为可能，而仅受到DNA模板长度的限制。

我们观察了在电场中纳米孔上的持续性DNA合成：phi29DNAP-DNA 复合体在施加的180mV电势下保持与纳米孔洞缔合，并容易地催化核苷酸 顺次添加。这与T7DNAP(外切-)形成鲜明对比，后者甚至在较低的电压下也 难以保持在孔的顶上以进行顺次添加（见Olasagasti等，2010，上文）。

phi29DNAP与DNA持久结合的一个突出之处在于本聚合酶和KF(外切 -)在不允许DNA被phi29DNAP核酸外切降解的条件下与纳米孔顶上的 DNA解离的不同途径。尽管在180mV下可以在数毫秒内将KF与DNA之 间的结合拉开(图1c)，同时保持发夹双链体碱基配对完整，但是使phi29 DNAP的紧密结合解离则需要平均～20秒，并且牵拉悬垂模板链通过孔的力 量必须在双链体与酶保持缔合的同时促使碱基对解链（图1d和2b,c）。然后， 被解开的链离开酶；链可以移动到酶以外的位置，移动到不与酶缔合的位置， 和/或移动通过开孔或者离开酶的通路区域，如图所示。被解开的链也可以不 穿插(threaded)通过酶或者进入酶的折叠中，并且甚至可以不和酶有物理或化 学的接触。被解开的链可以在酶的上方或周围穿插。

我们在本研究中运用了phi29DNAP3′-5′核酸外切酶的三个特征。首先， 我们发现，末端为3′-H的DNA底物在体相中的降解速度比末端为3′-OH的 底物更慢（图2a）。

据我们所知，这是第一次证明phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶活性对末端为3′-H的DNA底物有偏恶。

这个特征在体相中为DNA底物分子提供了保护，使其同时免于降解和 ddNMP切除依赖性引发的引物延长。这种保护还在向纳米孔室添加Mg²⁺后 提供了一个窗口，在此窗口内我们能够系列地捕获大量phi29DNAP-DNA复 合体，这些复合体中引物末端是完整的。

第二，当复合体在电场中被保持在孔顶时，我们使用phi29DNAP核酸 外切酶活性切离复合物中DNA底物的ddNMP末端。dNTPs的存在有利于 聚合反应远胜过持续降解。因此，切离ddCMP残基产生引物链3′-OH，允 许随后引发从限定的DNA模板位置开始合成。

通过孔顶的电场驱动力可以加速复合体中ddNMP末端的切离，因为我 们观察到，当电压增高时，从复合体捕获到合成开始的时间减少（未显示）。 但是，这种电压促进的切除与光镊实验中在高模板张力条件下诱发的持续性 核酸外切不同，后者中持续性的核酸外切甚至在dNTPs存在下也占主导地 位。相比之下，尽管引发合成需要切离ddCMP残基，但是在纳米孔实验中， 聚合反应占主导地位（图4、5、6和7），甚至在220mV的施加电势下也是 如此（图6）。

由于ddNMP引物末端的核酸外切去除缓慢，在体相中维持一个可观的 完整未延长DNA底物的池，这使得我们能够在相对简单的条件下对纳米孔 中的phi29DNA催化的合成进行检查。然而，由于存在随着时间推移体相中 DNA分子状态的缓慢变化和潜在的dNTP底物耗竭的担忧，这种策略对可 以进行实验的时间框架造成了限制。在体相中使用更强力的保护DNA底物 的手段，例如封闭新近被KF(外切-)和T7DNAP(外切-)使用的寡聚体，可以 拓展这种酶在利用纳米孔进行DNA测序和聚合酶机制研究中的用处。

第三，我们利用核酸外切酶结构域通过切除引发链3’端的核苷酸，系统 地移动DNA链通过纳米孔（图2c）。

这种生化反应的安排和设置特别适用于多核苷酸测序领域，因为单个核 苷酸的序列读取可以重复进行以确认碱基读出(base-call)，并能够在可以产生 有用数据的时间框内进行反应。

本研究的结果证明，phi29DNAP的性质理想地适合于以和可靠碱基检 测和鉴定相容的速度移动长链DNA通过纳米级孔。在本研究中，我们仅使 用化学合成的DNA模板，而能够观察到的由单个酶分子催化添加的序列核 苷酸的数目仅受到DNA模板长度的限制。电流轨迹内的特征，例如能够预 测三元复合体振幅的二元复合体内离子电流闪烁（图3），和在复制反应发生 前，当复合体捕获时两个振幅之间的振荡（图4、5和7），提示生物化学过 程，例如指开放-关闭跃迁和dNTP结合，可能具有可区分的标记(signature)。 在限定底物条件下观察复合体中的动态变化和以高带宽实时解析单个催化 周期（图4、5、6和7）的能力，为将生物化学变化定量作为所施加电压和 dNTP浓度的函数提供了机会。

这里，我们描述了使用这里所述的封闭寡聚体策略的修正方法，对以单 列次序排列的高达500个DNA模板进行了纳米孔分析。这些优化的封闭寡 聚体促使phi29DNAP预负载到靶DNA上，同时保护DNA底物在体相中不 被复制和核酸外切达至少5个小时。这些DNA分子只有在被捕获到纳米孔 上时才会被激活以供复制。

我们已经使用过封闭寡聚体调节ssDNA在phi29DNAP催化下通过纳米 孔的运动。改进点有：1）在体相中提高对p/t DNA复制和消化的保护，2） 在纳米孔上加快p/t DNA的激活以供复制；和3）DNA向前和向后步进通过 纳米孔。总之，这些改进将纳米孔在测序应用中的通量提高到在单个纳米孔 上每小时可分析～130个DNA分子，并将可允许的纳米孔实验时间提高到至 少5小时。此外，每个分子通过向前和向后步进通过纳米孔而被分析两次。 将这种链控制方法与能够解析单个核苷酸的纳米孔偶联，有可能在纳米孔中 对同一DNA链进行测序和重测序。

提供了单通道薄膜装置及其使用方法。主题装置包括由电气通信手段连 接的顺室和反室。在电气通信手段的顺室端有水平圆锥形孔，孔被薄膜密封， 薄膜包含单一纳米孔或通道。该装置进一步包括用于施加在顺室和反室之间 的电场的装置。目标装置可用于其中监视通过纳米孔或通道的离子电流的用 途，这些应用包括对天然存在的离子通道的表征，聚合化合物的表征，等。

特别地，本发明提供了一种新型系统，其包括位于顺室和反室之间的纳 米孔和从中温菌、嗜盐菌或极端嗜盐菌微生物中分离的DNA聚合酶。在一 个优选实施方案中，从中温菌原核生物分离的DNA聚合酶是phi29DNAP 蛋白。在另一个优选实施方案中，该DNA聚合酶包括5′–3′聚合酶和3′–5′ 核酸外切酶。在更优选的实施方案中，嗜盐菌微生物是极端嗜盐菌微生物。 或者，DNA聚合酶从能够感染中温菌、嗜盐菌或极端嗜盐菌微生物的病毒 中分离出来。

DNA聚合酶可以在低盐浓度下有活性，例如小于0.5M盐，或者在高盐 浓度下有活性，例如至少大约0.5M、至少大约0.6M、至少大约1M、至少 大约1.5M、至少大约2M、至少大约2.5M、至少大约3M、至少大约3.5M、 至少大约4M、至少大约4.5M、至少大约5M、至少大约5.5M，和饱和。

本发明还提供了一种DNA聚合酶，其也可在相似条件下保持活性的时 间显著长于Klenow(外切-)片段。在一个实例中，本发明的DNA聚合酶可 以保持活性达40秒，而使用Klenow(外切-)片段为数毫秒。这种～10,000倍 的活性提高明显是出人意料的优异结果，是现有技术以任意组合(包括T7 DNA聚合酶，其已知在与硫氧还蛋白结合后在体相中具有高度的持续性， 但是当它被捕获在纳米孔上时会迅速解离(Olasagasti,F.;Lieberman,K.R.; Benner,S.;Cherf,G.M.;Dahl,J.M.;Deamer,D.W.;Akeson,M.,Nat. Nanotechnol.2010,提前在线出版,doi:10.1038/nnano.2010.177))均不能预期 到的。本发明提供了一种DNA聚合酶，其可以保持活性达40秒、60秒、 120秒、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、 1.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、 数天、或数周，包括超过1个月，或者甚至无限期。本发明的额外的优点是， 在一些情况或环境下，不必提供等待反应发生的步骤。

在一个实施方案中，DNA聚合酶活性导致终端级联（terminal cascade）, 即一系列离散的离子电流阶跃。

本发明的使用实例

(1)纳米孔装置可用于监视酶，例如核酸外切酶和聚合酶，的周转，其 在DNA测序中具有重要用途。

(2)纳米孔装置可以发挥生物传感器功能，监视可溶性物质(例如酶底物 和信号分子)之间的相互作用。实例包括血液成分，例如葡萄糖，尿酸和尿 素，激素例如类固醇和细胞因子，和通过与受体分子结合发挥功能的药剂。

(3)纳米孔装置能够实时监视重要生物结构例如核糖体的功能，并用单 一功能单元实施此操作。

(4)有各种科学和工业应用中使用在高盐浓度下可以高效发挥功能的 DNA聚合酶是有利的。在测序中，GC压缩(GC compression)可以通过使用 高盐浓度加以解决。在纳米孔测序中，高盐浓度会提高基于离子电流的纳米 孔测量的信噪比。盐耐受的DNA聚合酶可以在各种极端嗜盐菌成员中找到， 这些极端嗜盐菌中耐盐性不是通过从胞浆排出单价离子实现，而是通过使细 胞内机构功能适应高盐而实现的。作为极端嗜盐菌成员耐盐的实例，来自古 菌嗜盐盒菌的苹果酸脱氢酶采用一种盐适应策略，其中环境中的高离子浓度 不仅被耐受，而且被整合到蛋白质中。钠（或钾）和氯离子被发现整合在分 子自身之中。当考虑感染极端嗜盐菌的病毒时，不仅病毒衣壳的蛋白直接暴 露于环境，而且其复制机构的蛋白，也必须在其古细菌宿主的高盐环境下有 效工作。

在高盐浓度有利的各种应用中，这些DNA聚合酶的高盐耐受力非常有 用。例如，该聚合酶可用于测序，其中它们可以为高GC压缩提供更好的分 辨率。此外，聚合酶可用于纳米孔测序，其中高盐浓度可提高基于离子电流 的纳米孔测量的信噪比。

其他实施方案

(A)我们还发现，具有3′–5′核酸外切酶的DNA聚合酶能够从3′–>5′端 消化DNA。我们发现，共价键合C3(CPG)间隔物，后随3′端的无碱基残基， 可以阻止DNA的核酸外切消化。

(B)Phi29DNAP结合的dsDNA在纳米孔中被施加的电压(180mV)解链。 电压降低允许DNA重新合链(re-zipping)。恢复电压再次使DNA解链，这使 DNA往复移动通过纳米孔。

(C)我们发现，当封闭寡聚体结合在DNA p/t连接点处时，该寡聚体在 被捕获在纳米孔上时会被剥离，随后DNA被活化以步进通过纳米孔。使用 更短的封闭寡聚体可以减少将封闭寡聚体从DNA剥离所需的时间。这允许 我们更快地激活DNA分子在纳米孔上复制，并提高纳米孔在测序应用中的 通量。

(D)电流轨迹中的噪音能够帮助鉴定聚合物链上的邻近单体。图9显示， 当聚合物穿过纳米孔时，聚合物中的一个或多个单体决定传感器读出的平均 离子电流。此外，聚合物在孔中运动会在平均电流上叠加电流波动（噪音）。 该噪音部分地是由相邻单体（或多个单体）的身份，以及与这些单体相关的 离子电流决定的。这是不可能预期到的，因此是一种出人意料的优异结果。

(E)DNA通过纳米孔的受控输送：这在实施例XVI和图14中有举例， 在那里我们显示了，我们如何利用dNTP浓度对通过纳米孔的DNA合成的 速度的影响。这是不可能预期到的，因此是一种出人意料的优异结果。

单通道薄膜装置的制造

提供了单通道薄膜装置及其使用方法。主题装置包括混合信号半导体晶 片，至少一个电化学层，其中该电化学层包括半导体材料，例如二氧化硅等， 其中该半导体材料进一步包括一种表面修饰剂，例如碳氢化合物，其中该电 化学层限定多个孔洞，这些孔洞包括室和颈部，并且其中孔洞的室与混合信 号半导体晶片的第一金属组分共定位，其中孔洞的一部分塞入有第二种金 属，例如银，其中该第二金属与第一金属电连接，并且其中孔洞进一步包括 薄膜，例如磷脂双层，该薄膜在孔洞的颈部形成溶剂可透过的密封，该薄膜 进一步包括孔，并且其中该孔洞包围水相和气相。在优选实施方案中，金属 化层包括金属或金属合金，例如但不限于，镍、金、铜和铝。

根据本发明使用的孔可以是β-桶孔或α-螺旋束孔。β-桶孔包括由β-折叠 片形成的桶或通道。合适的β-桶孔包括，但不限于，β-毒素，例如α-溶血素 和杀白细胞素，和细菌的外膜蛋白/孔蛋白，例如耻垢分枝杆菌孔蛋白 A(MspA)、MspB、MspC、MspD、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、 外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌自主转运体脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺 旋形成的桶或通道。合适的α-螺旋束孔包括，但不限于，内膜蛋白和外膜蛋 白，例如大肠杆菌Wza和ClyA毒素。其它有用的孔蛋白可以包括MspA单 体的NNN-RRK突变体，包括如下的突变体：D90N,D91N,D93N,D118R, D134R和E139K。

用于将亚单位插入膜(例如脂双层)中的方法是本领域已知的。例如，可 以以纯化的形式将亚单位悬浮在含有脂双层的溶液中，从而使它扩散到脂双 层内，并通过与脂双层结合而被插入和组装成功能状态。可选择地，可以用 M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际专利 申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO2006/100484)中介绍的“拾取和放 置”方法(“pick and place”method)将亚单位直接插入到膜中。

孔分子或通道分子的浓度足以在例如大约15分钟内在任何薄膜或双层 中形成单通道。形成这种通道的时间可以是例如半分钟-1小时，例如大约半 分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、 20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、 60分钟、或其间的任何时间。形成的时间可以由操作者通过数个因素或参数 加以改变，例如提高或降低环境或温育温度，提高或降低第二溶液或第一溶 液中盐的浓度，在第一溶液和第二溶液之间设置电势差吸引孔或通道分子向 薄膜或双层移动，或者其它本领域技术人员已知的方法。该有限状态机(finite  state machine)能够通过对流过电路的（离子）电流起反应检测和/或感知其相 应双层内单通道的形成，该电路包括宏观电极、第二溶液、单纳米孔或通道 分子、第一溶液、和用于给定阵列单元的金属电极。

生物通道的形成是随机过程。一旦在给定阵列单元双层内形成了单通 道，优选地减少或者优选地消除在其中再这样形成第二个通道的机会。第二 通道插入的概率可以用施加的跨双层的(即电势差)电势加以调节。当感知到 单通道时，该有限状态机调节金属电极上的电势，降低在同一双层内插入第 二个通道的可能性。

在一个备选的实施方案中，每个阵列单元可以包括围绕孔洞的金电极。 该金电极可通过还原和氧化反应激活化学剂，并且能够特异在特定孔洞的位 置处发挥作用。

纳米孔系统可以用现有技术的商业可得的65nm处理技术来产生，例如 来自台湾半导体制造公司（台湾）的技术。600x600的纳米孔阵列可以1000 Hz的速度实施360,000个生物化学反应和检测/感知步骤。这能够例如使该 半导体晶片的每个1cm x1cm切割片(die cut)以每秒3亿6000万个碱基的 速度进行多核苷酸测序。

在顺室和反室之间施加电场的示例手段是，例如，包含埋置阳极和埋置 阴极的电极，它们与电压源连接。这种电极能够用例如氯化银，或任何其它 具有相似物理和/或化学性质的化合物制成。

检测

纳米开孔的时间依赖性转运性质可以通过合适的技术加以测量。转运性 质可以因用于转运多核苷酸的介质、液体中的溶质（例如离子）、多核苷酸 （例如单体化学结构）、或多核苷酸上的标签而定。转运性质实例包括电流、 电导、电阻、电容、电荷、浓度、光学性质（例如荧光和拉曼散射）、和化 学结构。理想地，转运性质是电流。

用于检测顺室和反室之间的电流的装置实例已经在下列文献中有介绍： WO00/79257，美国专利Nos.6,46,594,6,6736,673,615,6,627,067,6,464,842, 6,362,002,6,267,872,6,015,714,和5,795,782和美国公开Nos.2004/0121525, 2003/0104428,和2003/0104428，并且可以包括，但不限于，在孔开孔处或 其附近与通道或孔直接关联的电极，被置于顺室和反室内的电极，和绝缘玻 璃微电极。电极能够，但不限于，检测跨两个室的离子电流差异，或跨孔开 孔或通道开孔的电子隧穿电流。在另一个实施方案中，转运性质是跨开孔直 径的电子流，其可以通过置于纳米孔周缘附近或与之相邻的电极加以监视。 这些电极能够与Axopatch200B放大器连接，用于放大信号。

这里公开的本发明的应用和/或使用可以包括但不限于如下：

1.用mRNA,rRNA,和tRNA指示的相对或绝对基因表达水平的测定。 这包括天然、突变和致病核酸和多核苷酸。

2.等位基因表达的测定。

3.单倍型测定和染色体内多个SNP的定相(phasing)。

4.DNA甲基化状态测定。

5.mRNA可变剪接和剪接变体水平的测定。

6.RNA转运测定。

7.mRNA,rRNA和DNA中蛋白-核酸复合体的测定。

8.通过DNA,rRNA或mRNA测定食品和环境样品中微生物或病毒的存 在。

9.通过DNA,rRNA或mRNA鉴定食品和环境样品中微生物或病毒的含 量。

10.在植物、人、微生物和动物中，通过DNA,rRNA或mRNA鉴定病 状。

11.医学诊断中的核酸测定。

12.定量核转录终止分析(nuclear run off assays)。

13.DNA和RNA水平的基因重排测定，包括，但不限于，在免疫响应 中发现的基因重排。

14.微生物、病毒和线粒体中基因转移测定。

15.遗传进化分析。

16.法医检验。

17.亲子鉴定。

18.系谱分析(Geneological assays)。

与其它多核苷酸同源的多核苷酸可以通过在严格或在高度严格条件下 彼此杂交加以鉴定。当它们基于各种良好表征的物理化学力，例如氢键、溶 剂排斥（solvent exclusion）、碱基堆叠等而缔合时，单链的多核苷酸发生杂 交。杂交的严紧度反映了所涉及核酸的序列相同程度，因此严紧度越高，两 条多核苷酸链越相似。严紧度受到多种因素的影响，包括杂交溶液和洗脱溶 液的温度、盐浓度和组成、有机和无机添加剂、溶剂等，在上文引用的参考 文献中有更详细的介绍。

本发明包括能够在各种严紧度条件下(例如Wahl and Berger(1987) Methods Enzymol.152:399-407,and Kimmel(1987)Methods Enzymol.152: 507-511)与多核苷酸或其片段杂交的多核苷酸序列。同源性的评估由多种严 紧度条件下的DNA-DNA或DNA-RNA杂交给出，这是本领域技术人员周知 的(Hames and Higgins,Editors(1985)Nucleic Acid Hybridisation:A Practical  Approach,IRL Press,Oxford,U.K.)。可以调节严紧度条件以筛选中等相似的 片段，例如来自远相关生物体的同源序列，到高度相似的片段，例如来自近 亲生物体的复制功能酶的基因。杂交后清洗决定严紧度条件。

本发明的表征和使用

测序

在一个实施方案中，本发明可用于进行多核苷酸的序列分析。该分析与 先前和当前技术相比具有优势，即单次分析可以在单个位置实施，从而显著 节省试剂、底物、报告分子等的成本。另外重要的是测序反应和信号产生的 迅捷性，从而比先前技术更加改进。

其它用于核酸测序的方法是本领域众所周知的，并可以用于实践本发明 的任何实施方案。这些方法采用酶，例如DNA聚合酶I的Klenow片段、 SEQUENASE、Taq DNA聚合酶和热稳定T7DNA聚合酶(Amersham  Pharmacia Biotech,Piscataway NJ)或这些聚合酶的组合，和校读核酸外切酶， 例如在ELONGASE扩增系统(Life Technologies,Gaithersburg MD)中发现的。 优选地，序列制备物用机器自动化，例如HYDRA微分配器(microdispenser) (Robbins Scientific,Sunnyvale CA)、MICROLAB2200系统(Hamilton,Reno  NV)和DNA ENGINE热循环仪(PTC200;MJ Research,Watertown MA)。用于 测序的机器包括ABI PRISM3700,377或373DNA测序系统(PE  Biosystems)、MEGABACE1000DNA测序系统(Amersham Pharmacia Biotech) 等。序列可以用本领域众所周知的多种算法加以分析，它们在下列文献中有 介绍：Ausubel et al.(1997;Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons,New York N.Y.,unit7.7)和Meyers(1995;Molecular Biology and  Biotechnology,Wiley VCH,New York N.Y.,pp.856-853)。

鸟枪法测序用于从来自多个来源的克隆插入物产生更多序列。鸟枪测序 法是本领域众所周知的，并使用热稳定的DNA聚合酶、不耐热的DNA聚 合酶和从感兴趣的多核苷酸分子两侧各自区域选出的引物。使用本领域众所 周知的各种算法和程序，例如CONSED(Gordon(1998)Genome Res.8: 195-202)，检查不完全组装序列的身份。污染序列包括载体或嵌合序列或缺 失序列可以分别得以去除或恢复，将不完全组装的序列组织成最终序列。

多核苷酸序列的延伸

本发明的序列可以用各种本领域已知的基于PCR的方法加以延长。例 如，可以使用XL-PCR试剂盒(PE Biosystems)、巢式引物、和商业可得的cDNA 或基因组DNA文库延长多核苷酸序列。对于所有基于PCR的方法，引物可 以用商业可得的软件，例如OLIGO4.06引物分析软件(National Biosciences, Plymouth MN)加以设计，长度为大约22-30个核苷酸，GC含量为大约50% 或更多，靶分子在大约55°C-大约68°C的温度下退火。当延伸序列以恢复 调节元件时，优选地使用基因组文库而非cDNA文库。

本发明多核苷酸的使用

用于测定的分子标记

多种的标签和偶联技术是本领域技术人员已知的，并可用在各种核酸、 氨基酸和抗体测定中。标记分子的合成可以用Promega(Madison WI)或 Amersham Pharmacia Biotech试剂盒实现，并入标记的核苷酸例如³²P-dCTP, Cy3-dCTP或Cy5-dCTP或氨基酸例如³⁵S-甲硫氨酸。核苷酸和氨基酸可以用 各种物质直接标记，包括荧光剂、化学发光剂或发色剂等，或者用试剂例如 BIODIPY或FITC(Molecular Probes,Eugene OR)通过与分子中存在的氨基、 巯基和其它基团化学偶联进行标记。

诊断剂

多核苷酸、片段、寡核苷酸、互补RNA和DNA分子和PNA可用于检 测和定量基因表达变化、mRNA的存在/不存或者过量表达，或者在治疗干 预期间监视mRNA的水平。与表达变化相关的症状、疾病或异常包括特发 性肺动脉高压、继发性肺高压、细胞增生性疾病，特别是退行性寡树突胶质 细胞瘤、星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、眼眶脑膜瘤、节细 胞神经瘤、神经元瘤、多发性硬化、亨廷顿病、乳腺腺癌、前列腺腺癌、胃 腺癌、转移性神经内分泌癌、非增生性纤维囊肿和增生性纤维囊肿乳腺疾病、 胆囊炎和胆石症、骨关节炎、和类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合征 （AIDS）、艾迪生氏病、成人呼吸窘迫综合征、过敏、强直性脊柱炎、淀粉 样变性、贫血、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性 甲状腺炎、良性前列腺增生、支气管炎、Chediak-Higashi综合征、胆囊炎、 克罗恩病、过敏性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺气肿、胎儿有核红细胞增多症、 结节性红斑、萎缩性胃炎、肾小球肾炎、Goodpasture综合征、痛风、慢性 肉芽肿性疾病、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、嗜酸性粒细胞增多、肠易激 综合征、多发性硬化症、重症肌无力、心肌或心包炎症、骨关节炎、骨质疏 松症、胰腺炎、多囊卵巢综合征、多发性肌炎、银屑病、赖特尔综合症、类 风湿关节炎、硬皮病、严重联合免疫缺陷（SCID）、干燥综合征、全身过敏 反应、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、 葡萄膜炎、沃纳综合征，血液透析、体外循环、病毒、细菌、真菌、原生动 物、和蠕虫感染；催乳素产生紊乱、不孕症，包括输卵管疾病、排卵缺陷及 子宫内膜异位症，发情周期失调、月经周期失调、多囊卵巢综合征、卵巢过 度刺激综合征、子宫内膜或卵巢肿瘤、子宫肌瘤、自身免疫性疾病、宫外孕 和致畸作用；乳房的癌症、乳房纤维囊性病、和溢乳；精子发生紊乱、精子 生理异常、良性前列腺增生症、前列腺炎、阴茎硬结症、阳痿、男性乳腺发 育；光化性角化病、动脉硬化、滑囊炎、肝硬化、肝炎、混合性结缔组织病 （MCTD）、骨髓纤维化、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、真性红细胞增多症、 原发性血小板增多症、癌症并发症，癌症包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色 素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤，以及，特别是，肾上腺、膀胱、骨、骨髓、 脑、乳腺、宫颈、胆囊、神经节、胃肠道、心、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、 胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、甲状腺、 和子宫的癌症。在另方面中，本发明的多核苷酸。

多核苷酸、片段、寡核苷酸、互补RNA和DNA分子和PNA，或其片 段，可用于检测和定量基因表达变化、mRNA的存在/不存在或者过量表达， 或者在治疗干预期间监视mRNA的水平。与表达变化相关的症状、疾病或 异常包括静坐不能(akathesia)、阿尔茨海默氏病、健忘、肌萎缩性侧索硬化 症、共济失调、双相情感障碍、木僵、脑瘫、脑血管病、克雅氏病、痴呆症、 抑郁症、唐氏综合征、迟发性运动障碍、肌张力障碍、癫痫症、亨廷顿氏病、 多发性硬化症、肌营养不良症、神经痛、神经纤维瘤、神经病变、帕金森氏 病、皮克氏病、视网膜色素变性、精神分裂症、季节性情感障碍、老年性痴 呆、中风、抽动秽语综合征和癌症，包括腺癌、黑色素瘤和畸胎癌，特别是 脑的癌症。这些cDNA还可用作在数天到数月的周期范围内对上述疾病和其 它大脑异常、症状和疾病的治疗效力的标志。诊断测定可以使用杂交或扩增 技术比较来自患者的生物样品与标准样品中的基因表达，以便检测基因表达 变化。这种比较的定性和定量方法是本领域众所周知的。

诊断测定可以使用杂交或扩增技术比较来自患者的生物样品与标准样 品中的基因表达，以便检测基因表达变化。这种比较的定性和定量方法是本 领域众所周知的。

例如，多核苷酸或探针可以通过标准方法进行标记，并在有助于形成杂 交复合体的条件下添加到来自患者的生物样品中。在温育期之后，对样品进 行清洗，并定量与杂交复合体缔合的标记物（或信号）的量，并与标准值进 行比较。如果患者样品中标志物的量与标准值相比有显著改变，则表明存在 相关的病症、疾病或异常。

为了为与基因表达相关的病症、疾病或异常的诊断提供基础，建立了正 常或标准表达谱。这可以通过在杂交或扩增条件下组合从正常对象(动物或 人)获得的生物样品与探针来实现。标准杂交可以通过比较用正常对象获得 的数值与使用已知量的基本上纯化的靶序列的实验获得的数值来定量。以这 种方法获得的标准值可以和从具有特定病症、疾病或异常的症状的患者获得 的样品的数值进行比较。从标准值向与特定病症相关联的数值的偏离用于诊 断该病症。

这些测定还可以用于在动物研究和临床试验中评估特定治疗方法的效 力，或者监视单个患者的治疗。一旦确定存在某种病症并开始某种治疗方案， 便可以规律地重复诊断测定，确定患者体内的表达水平是否开始近似于正常 对象体内观察到的水平。从连续测定中获得的结果可用于显示在数天到数月 期间的治疗效力。

配体的纯化

多核苷酸或其片段可以用于从样品中纯化配体。使用多核苷酸或其片段 纯化配体的方法可能涉及在允许特异结合的条件下将多核苷酸或其片段与 样品合并，检测特异性结合，回收结合的蛋白质，和使用合适的试剂将多核 苷酸与纯化的配体分离。

在另外的实施方案中，多核苷酸可以在任何尚未被开发的分子生物学技 术中使用，只要该新技术依赖于目前已知的多核苷酸的性质即可，包括，但 不限于，三联体遗传编码和特异碱基对互作等性质。

DNA聚合酶的组成

本发明还构想了持续性DNA聚合酶的变体。这些变体与DNA具有更 强或减弱的结合亲和性。这些变体还可以具有增高或降低的反应速度。例如， 在KF中，反应性酪氨酸残基可以被例如色氨酸取代。

对肽序列进行的氨基酸取代可以高达1、2、3、4、5、10、20或30个 取代。保守取代用具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其它 氨基酸代替氨基酸。被引入的氨基酸可以与其所取代的氨基酸具有相似的极 性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守取代可以引入 另一种芳香族或脂肪族氨基酸代替先前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守 氨基酸改变是本领域众所周知的，并可以根据下面表1中定义的20种主要 氨基酸的性质加以选择。当氨基酸具有相似性质时，这可以参考表2中氨基 酸侧链的亲水性程度(hydropathy scale)加以确定。

表1-氨基酸的化学性质

Ala 脂肪族，疏水，中性 Met 疏水，中性 Cys 极性，疏水，中性 Asn 极性，亲水，中性 Asp 极性，亲水，带电(-) Pro 疏水，中性 Glu 极性，亲水，带电(-) Gln 极性，亲水，中性 Phe 芳香族，疏水，中性 Arg 极性，亲水，带电(+) Gly 脂肪族，中性 Ser 极性，亲水，中性 His 芳香族，极性，亲水，带电(+) Thr 极性，亲水，中性 Ile 脂肪族，疏水，中性 Val 脂肪族，疏水，中性 Lys 极性，亲水，带电(+) Trp 芳香族，疏水，中性 Leu 脂肪族，疏水，中性 Tyr 芳香族，极性，疏水

表2-亲水性程度

保守取代是指除去了氨基酸序列中的至少一个残基，并插入不同的残基 来代替之。当期望保持蛋白质的活性时，这种取代一般是根据表3进行的。 表2显示了能够取代蛋白质中的氨基酸并且通常被看作是保守取代的氨基 酸。

表3

残基 保守取代 Ala Ser Arg Lys Asn Gln;His Asp Glu

Gln Asn Cys Ser Glu Asp Gly Pro His Asn;Gln Ile Leu;Val Leu Ile;Val Lys Arg;Gln Met Leu;Ile Phe Met;Leu;Tyr Ser Thr;Gly Thr Ser;Val Trp Tyr Tyr Trp;Phe Val Ile;Leu

相似取代是指，除去氨基酸序列中的至少一个残基并插入不同的残基来 代替之。当期望保持蛋白质的活性时，这种取代一般是根据表3进行的。表 4显示了能够取代蛋白质中的氨基酸并且通常被看作是结构性和功能性取代 的氨基酸。例如，表4第1列中的残基可以被第1列中的残基取代；此外， 表4第1列中的残基可以用第1列中的残基取代。

表4

残基 相似取代 Ala Ser;Thr;Gly;Val;Leu;Ile Arg Lys;His;Gly Asn Gln;His;Gly;Ser;Thr Asp Glu,Ser;Thr Gln Asn;Ala Cyc Ser;Gly

Glu Asp Gly Pro;Arg His Asn;Gln;Tyr;Phe;Lys;Arg Ile Ala;Leu;Val;Gly;Met Leu Ala;Ile;Val;Gly;Met Lys Arg;His;Gln;Gly;Pro Met Leu;Ile;Phe Phe Met;Leu;Tyr;Trp;His;Val;Ala Ser Thr;Gly;Asp;Ala;Val;Ile;His Thr Ser;Val;Ala;Gly Trp Tyr;Phe;His Tyr Trp;Phe;His Val Ala;Ile;Leu;Gly;Thr;Ser;Glu

保守性小于表2中的取代可以通过挑选对保持如下性质具有更显著不同 影响的残基加以选择：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如，折叠片或螺 旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。一般会预期对 蛋白性质产生最大改变的取代是，(a)用亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰，取 代疏水残基(或反之)，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰、丙氨酰； (b)用半胱氨酸或脯氨酸取代其它残基(或反之)；(c)用具有正电侧链的残 基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰，取代负电残基(或反之)，例如谷氨酰或 天冬氨酰；或(d)用具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代不具有侧链的残 基(或反之)，例如甘氨酸。

跨膜蛋白孔也优选地来自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7个相同 的单体或亚基形成（即，其为七聚体）。α-溶血素-NN的单体或亚基的序列 如SEQ ID NO:2所示。跨膜蛋白孔优选地包括7个单体，每一个均包含SEQ  ID NO:2所示的序列或其变体。SEQ ID NO:2的氨基酸1，7-21，31-34，45-51， 63-66，72，92-97，104-111，124-136，149-153，160-164，173-206，210-213， 217，218，223-228，236-242，262-265，272-274，287-290，和294形成环 区。SEQ ID NO:2的残基113和147形成α-HL桶或通道缢痕的一部分。

在这些实施方案中，本发明的方法中优选地使用如下的孔，其包含7个 蛋白或单体，其中每一个均包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体。7个蛋 白可以是相同的（同七聚体）或不同的（异七聚体）。

SEQ ID NO:2的变体是如下的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2 的不同，但保持孔形成能力。变体形成孔的能力可以用任何本领域已知的方 法加以测定。例如，可以将变体和其它合适的亚基一起插入到脂双层中，并 可以确定其寡聚体化从而形成孔的能力。将亚基插入分子内，例如脂双层中， 的方法是本领域已知的。合适的方法在上文已有讨论。

变体可以包括方便共价结合或者与Phi29DNA聚合酶的相互作用的修 饰。变体优选地包括一个或多个反应性半胱氨酸残基，其方便附着到核酸结 合蛋白质上。例如，变体可以在SEQ ID NO:2的一个或多个如下位置处包 含半胱氨酸：8,9,17,18,19,44,45,50,51,237,239和287，和/或在其氨基末 端或羧基末端。优选的变体在SEQ ID NO:2的8,9,17,237,239和287位 包含半胱氨酸取代(A8C,T9C,N17C,K237C,S239C或E287C)。变体优选地 是国际专利申请No.PCT/GB09/001690(公开为WO2010/004273), PCT/GB09/001679(公开为WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开为 WO2010/086603)中描述的任何一种变体。

变体还可以包含便于任何与核苷酸的相互作用的修饰。

变体可是天然发生的变体，其被生物体例如葡萄球菌属细菌自然表达。 或者，变体可以被细菌例如大肠杆菌体外或重组表达。变体还包括通过重组 技术产生的非天然发生变体。在SEQ ID NO:2的整个氨基酸序列长度上， 变体基于氨基酸同一性优选地与该序列具有至少50%的同源性。更优选地， 变体多肽基于氨基酸同一性与SEQ ID NO:2的氨基酸序列在整个序列上可 以为至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%， 至少85%，至少90%，更优选地至少95%，97%或99%同源。在200个或更 个连续氨基酸的序列段上，例如230、250、280或280或更多的连续氨基酸 序列上可以有至少80%，例如至少85%，90%或95%的氨基酸同一性（“硬 同源性”）。同源性可以如上面所讨论地加以确定。

除了上面讨论的之外，在SEQ ID NO:2的氨基酸序列上可以制造例如 高达1,2,3,4,5,10,20或30个氨基酸取代。保守取代可以如上所述地加以 制造。

可以从上面讨论的多肽上额外地缺失一个或多个SEQ ID NO:2氨基酸 序列的氨基酸残基。可以缺失多达1,2,3,4,5,10,20或30个残基，或者更 多。

变体可以是SEQ ID NO:2的片段。这些片段保留孔形成能力。片段的 长度可以是至少50、100、200或250个氨基酸。片段优选地包括SEQ ID NO: 2的孔形成结构域。片段通常包含SEQ ID NO:2的残基119、121、135、114 和139。

上述的多肽可以可选择地或额外地添加一个或多个氨基酸。SEQ ID NO: 2氨基酸序列或其变体或其片段的氨基端或羧基端可以具有延伸。延伸的长 度可以非常短，例如1-10个氨基酸。或者，延伸可以比较长，例如长达50 或100个氨基酸。担载体蛋白可以被融合到孔或变体上。

如上面所讨论的，SEQ ID NO:2的变体是亚基，其氨基酸序列与SEQ ID  NO:2的不同，但保留形成孔的能力。变体典型地包含SEQ ID NO:2负责孔 形成的区域。含有β-桶的α-HL的孔形成能力由每个亚基中的β-链提供。SEQ  ID NO:2的变体典型地包含SEQ ID NO:2形成β-链的区域。SEQ ID NO:2 中形成β-链的氨基酸在上面有讨论。可以对SEQ ID NO:2形成β-链的区域进 行一个或多个修饰，只要最终的变体保留其形成孔的能力即可。可以对SEQ  ID NO:2的β-链区域进行的特定修饰在上文有讨论。

SEQ ID NO:2的变体优选地在其α-螺旋和/或环区域中包括一个或多个 修饰，例如取代、添加或删除。形成α-螺旋或环的氨基酸在上文有讨论。

变体可以被修饰，以便于其如上文所讨论的鉴定或纯化。

在一些实施方案中，跨膜蛋白孔被化学修饰。孔可以用任何方式在任何 位点被化学修饰。跨膜孔优选通过下列方式化学修饰：附着分子到一个或多 个半胱氨酸上（半胱氨酸连接），附着分子到一个或多个赖氨酸上，附着分 子到一个或多个非天然氨基酸上，表位的酶修饰，或末端修饰。实施这些修 饰的合适方法是本领域众所周知的。跨膜蛋白孔可以通过附着任何分子进行 化学修饰。例如，孔可以通过附着染料或荧光团进行化学修饰。

可以对孔中任何数目的单体进行化学修饰。一个或多个，例如2、3、4、 5、6、7、8、9或10个单体，优选地被如上面所讨论地被化学修饰。

半胱氨酸残基的反应性可以通过相邻残基的修饰而被提高。例如，侧翼 精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱性基团会改变半胱氨酸巯基的pKa，变成 更具反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可以被巯基保护基团， 例如dTNB保护。这些可以在附着接头之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基 反应。

（用于化学修饰孔的）分子可以被直接附着在孔上，或者通过接头附着， 如在下列文献中公开的：国际专利申请Nos.PCT/GB09/001690(公开为WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公开为WO2010/004265)或 PCT/GB10/000133(公开为WO2010/086603)。

任何Phi29DNA聚合酶均可以根据本发明加以使用。Phi29DNA聚合酶 优选地包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体。野生型Phi29DNA聚合酶 具有聚合酶和核酸外切酶活性。在正确条件下，它还可以解开双链多核苷酸。 因此，酶可以在三种模式下工作。这在下文有更详细的讨论。SEQ ID NO:4 的一种变体是如下的酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:4的不同，并保持多 核苷酸结合活性。该变体必须以下面讨论的三种模式中的至少一种模式工 作。优选地，变体以全部三种模式工作。变体可以包含修饰，其便于处理多 核苷酸和/或便于在高盐浓度和/或室温下发挥活性。变体可以包含Fidelity  Systems的TOPO修饰，其可以提高酶对盐的耐受。

在SEQ ID NO:4氨基酸序列的全长上，变体优选地基于氨基酸同一性 与该序列具有至少40%同源性。更优选地，变体多肽基于氨基酸同一性与 SEQ ID NO:4的氨基酸序列在整个序列上可为至少55%，至少60%，至少 65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，更优选地至 少95%，97%或99%同源。在200个或更多连续氨基酸的序列段上，例如230、 250、280或280或更长的连续氨基酸序列段上可以有至少80%，例如至少 85%，90%或95%的氨基酸同一性（“硬同源性”）。同源性如下面所描述地加 以确定。变体可以在任何在下文中参考SEQ ID NO:2讨论的方式上与野生 型序列不同。聚合酶可以共价连接在孔上。

这些方法是有可能的，因为跨膜蛋白孔可用于根据它们对通过孔的电流 的不同影响，区分具有相似结构的核苷酸。当它们与孔相互作用时，可以从 它们的电流幅度在单分子水平上鉴定单个核苷酸。如果电流以某种核苷酸特 异的方式流过孔（即检测到与某种核苷酸相关的独特电流流过孔），则孔中 存在该核苷酸。连续鉴定靶多核苷酸中的核苷酸可以确定多核苷酸的序列。 如上面所讨论的，这就是链测序。

在单链多核苷酸中的核苷酸与孔相互作用期间，该核苷酸以该核苷酸特 异的方式影响流过孔的电流。例如，某个特殊的核苷酸会以某个特定的平均 时长和特定的程度降低流过孔的电流。换言之，流过孔的电流对特定核苷酸 是独特的。可以实施对照实验，确定特定核苷酸对流过孔的电流的影响。然 后，可以将在测试样品上实施本发明方法获得的结果与对照实验中获得的结 果进行比较，以便确定靶多核苷酸的序列。

该测序方法可以用任何适于研究其中孔插入在膜之中的膜/孔系统的设 备来实施。该方法可以用任何适合于跨膜孔感知的设备加以实施。例如，所 述设备包括室，其含有水溶液和将室分隔成两个部分的屏障。该屏障具有开 孔，在其中形成含有孔的膜。

测序方法可以用国际专利申请No.PCT/GB08/000562中描述的设备加以 实施。

本发明的方法涉及测量在与核苷酸相互作用期间通过孔的电流。因此， 该设备还包括能够施加电压并测量跨越膜和孔的电信号的电路。该方法可以 用膜片钳或电压钳来实施。该方法优选地涉及使用电压钳。

本发明的测序方法涉及测量在与核苷酸相互作用期间通过孔的电流。适 合用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的条件是本领域已知的，并且在实施 例中有公开。该方法典型地用施加跨越膜和孔的电压实施。所用的电压典型 地为–400mV到+400mV。所用电压的范围优选地具有从下组选出的下限： -400mV,-300mV,-200mV,-150mV,-100mV,-50mV,-20mV和0mV，和独 立从下组选出的上限：+10mV,+20mV,+50mV,+100mV,+150mV,+200 mV,+300mV和+400mV。所用电压的范围更优选地是100mV-240mV，最优 选的范围是160mV-240mV。通过使用更高的施加电势，有可能增加孔对不 同核苷酸的区分。

测序方法典型地在任何碱金属盐酸盐的存在下实施。在上面讨论的设备 示例中，盐存在于室内的水溶液中。典型地使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl) 或氯化铯(CsCl)。KCl是优选的。盐浓度通常为0.1-2.5M,0.3-1.9M,0.5-1.8M, 0.7-1.7M,0.9-1.6M或1M-1.4M。盐浓度优选地为150mM-1M。在一些可选 择的实施方案中，理想地包含处于饱和浓度的盐。Phi29DNA聚合酶令人惊 讶地在高盐浓度下工作。盐浓度优选地至少为0.3M，例如至少0.4M或0.5M。 高盐浓度提供高信噪比，并可以相对于正常电流波动的背景鉴定出指示核苷 酸存在的电流。如果在酶的存在下进行核苷酸检测，可以使用较低的盐浓度。

该方法典型地在缓冲液存在下实施。在上面讨论的设备实例中，缓冲液 存在于室内的水溶液中。本发明方法可以使用任何缓冲液。典型地，缓冲液 是HEPES。另一种合适的缓冲液是Tris-HCl缓冲液。方法典型地在如下的 pH下实施：4.0-12.0,4.5-10.0,5.0-9.0,5.5-8.8,6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5。所 用pH优选地为大约7.5。

方法可以在如下的温度下实施：0°C-100°C,15°C-95°C,16°C-90°C,17°C -85°C,18°C-80°C,19°C-70°C,或20°C-60°C。方法典型地在室温下实施。方法 可以任选地在支持酶功能的温度下，例如大约37°C下实施。

如上面所提到的，如果温度提高，可以在低盐浓度下实现良好的核苷酸 区分。除了提高溶液温度之外，可以采用许多其它的策略提高溶液的导电率， 同时保持适合于酶活性的条件。一种这样的策略是使用脂双层划分两个不同 浓度的盐溶液，在酶的一侧是低盐浓度的盐，在相反侧是更高的浓度。这种 方法的一个实例是，在膜的顺侧使用200mM KCl，在反室中使用500mM  KCl。在这些条件下，通过孔的导电率在正常条件下预期与400mM KCl大 致相当，而如果酶被置于顺式侧，则其仅经受200mM。使用不对称盐浓度 的另一个可能的好处是诱发出的跨孔的渗透压梯度。可利用这种净水流将核 苷酸拉到孔内用于检测。使用中性渗透物，例如蔗糖、甘油或PEG，可以实 现相似的效果。另一种可能是使用具有相对低水平KCl的溶液，并依赖一种 对酶活性干扰较小的额外电荷携载物质。

被分析的靶多核苷酸可以和已知的保护性化学物组合，以保护多核苷酸 在体相溶液中免于结合蛋白的作用。然后，可以利用孔除去保护性化学物。 这可以通过使用在施加电势下可以被孔、结合蛋白或酶解杂交(unhybridised) 的保护性基团(WO2008/124107)，或者通过使用当被保持在孔极近时被结合 蛋白或酶除去的保护性化学物(J Am Chem Soc.2010Dec 22;132(50):17961-72)来实现。

当靶多核苷酸与Phi29DNA聚合酶及孔接触时，靶多核苷酸首先与 Phi29DNA聚合酶形成复合体。当跨孔施加电压时，靶多核苷酸/Phi29DNA 聚合酶复合体与孔形成复合体，并控制多核苷酸移动通过孔。

如上面所讨论的，野生型Phi29DNA聚合酶具有聚合酶和核酸外切酶活 性。在正确的条件下它还可解开双链多核苷酸。因此，该酶可以按照三种模 式工作。本方法可以根据Phi29DNA聚合酶的三种模式以三种优选方式中的 一种实施。每种方式均包括序列校读的方法。第一，该方法优选地使用Phi29 DNA聚合酶作为聚合酶来实施。在这种实施方案中，步骤(a)和(b)在游离核 苷酸和酶辅因子的存在下实施，从而聚合酶使靶序列逆着所施加电压形成的 电场移动通过孔。靶序列沿着5’至3’方向移动。游离核苷酸可以是一个或多 个上面讨论的各种核苷酸中的任意一种核苷酸。酶辅因子是允许Phi29DNA 聚合酶作为聚合酶或核酸外切酶发挥功能的因子。酶辅因子优选地是二价金 属阳离子。所述二价金属阳离子优选地是Mg²⁺,Mn²⁺,Ca²⁺或Co²⁺。酶辅因 子最优选地是Mg²⁺。所述方法优选地进一步包括(c)除去游离核苷酸，从而 使聚合酶将靶序列沿着所施加电压产生的电场移动通过孔(即沿着3’和5’方 向)，并且靶序列的一部分核苷酸与孔相互作用，和(d)测量每次相互作用期 间流过孔的电流，藉此校读在步骤(b)中获得的靶序列的序列，其中步骤(c) 和(d)也在施加的跨膜电压下实施。

第二，方法优选地将Phi29DNA聚合酶作为核酸外切酶使用实施。在这 种实施方案中，其中步骤(a)和(b)在不存在游离核苷酸但存在酶辅因子的条件 下实施，从而使聚合酶将靶序列沿着所施加电压产生的电场移动通过孔。靶 序列沿着3’至5’方向移动。该方法优选地进一步包括(c)添加游离核苷酸，从 而使聚合酶将靶序列逆着所施加电压产生的电场移动通过孔(即沿着5’-3’方 向)，并且靶序列的一部分核苷酸与孔相互作用，和(d)测量每次相互作用期 间流过孔的电流，藉此校读在步骤(b)中获得的靶序列的序列，其中步骤(c) 和(d)也在施加的跨膜电压下实施。

第三，方法优选地将Phi29DNA聚合酶以解链模式使用来实施。在这种 实施方案中，其中步骤(a)和(b)在不存在游离核苷酸和酶辅因子的条件下实 施，从而使聚合酶控制靶序列沿着所施加电压产生的电场移动通过孔（在它 被解链的同时）。在这种实施方案中，聚合酶发挥类似刹车的功能，阻止靶 序列在施加电压的影响下太快地移动通过孔。该方法优选地进一步包括(c) 降低所施加的跨孔电压，从而使靶序列沿着与步骤(a)和(b)中相反的方向移动 通过孔（即在它重新退火的同时），并且靶序列中的一部分核苷酸与孔相互 作用，和(d)测量每次相互作用期间流过孔的电流，藉此校读在步骤(b)中获 得的靶序列的序列，其中步骤(c)和(d)也在施加的跨膜电压下实施。

本发明的方法优选地涉及一种来自MspA的孔和Phi29DNA聚合酶。 Phi29DNA聚合酶优选地分开双链靶多核苷酸，并控制所得的单链多核苷酸 移动通过孔。这个实施方案具有三个预料不到的优点。第一，靶多核苷酸以 商业上可行的并且允许有效测序的速度移动通过孔。靶多核苷酸移动通过 Msp孔的速度比其通过溶血素孔的速度更快。第二，在多核苷酸移动通过孔 时观察到的电流范围增加，这允许更容易地确定序列。第三，当特定孔和聚 合酶一起使用时观察更小的电流差异，藉此提高信噪比。

其它方法

本发明还提供了形成用于测序靶多核苷酸的传感器的方法。该方法包括 在靶多核苷酸的存在下使孔与Phi29DNA聚合酶接触。然后施加跨孔电压， 以形成孔与聚合酶之间的复合体。该复合体就是用于测序靶多核苷酸的传感 器。该方法优选地包括在靶核酸序列的存在下使源自Msp的孔与Phi29DNA 聚合酶接触，并施加跨越孔的电压，以在孔与聚合酶之间形成复合体。上面 参考本发明测序方法讨论的任何实施方案均同等地适用于本方法。

本发明进一步提供了提高Phi29DNA聚合酶活性速率的方法。该方法包 括在多核苷酸的存在下使Phi29DNA聚合酶与孔接触。跨越孔施加电压以在 孔与聚合酶之间形成复合体，这提高Phi29DNA聚合酶的活性速率。该方法 优选地包括在核酸序列的存在下使Phi29DNA聚合酶与源自Msp的孔接触， 并跨越孔施加电压，以在孔与聚合酶之间形成复合体。上面参考本发明测序 方法讨论的任何实施方案均同等地适用于本方法。

试剂盒

本发明还提供了用于测序靶多核苷酸的试剂盒。该试剂盒包括(a)孔，和 (b)Phi29DNA聚合酶。上面参考本发明测序方法讨论的任何实施方案均同 等地适用于所述试剂盒。

该试剂盒可以进一步包括膜的组分，例如形成脂双层需要的磷脂。

本发明的试剂盒可以额外地包括一种或多种其它能够使上述任一实施 方案得以实施的试剂或器材。这些试剂或器材包括如下的一个或多个：合适 的缓冲液（水溶液），从受试者获取样品的手段（例如包含针头的容器或器 材)，扩增和/或表达多核苷酸的手段，如上定义的膜或电压钳或膜片钳设备。 试剂可以在试剂盒中以干燥状态存在，使得液体样品重悬浮该试剂。试剂盒 还可以任意地包括能够使试剂盒用在本发明方法中的使用说明，或者有关适 用本方法的患者的细节。试剂盒可以任意地包括核苷酸。

设备

本发明还提供了用于测序靶多核苷酸的设备。该设备包括多个孔和多个 Phi29DNA聚合酶。该设备优选地进一步包括用于实施本发明测序方法的使 用说明。该设备可以是任何用于多核苷酸分析的常规设备，例如阵列或芯片。 上面参考本发明测序方法讨论的任何实施方案均同等地适用于本发明的设 备。

该设备优选地被设置以实施本发明的测序方法。

该设备优选地包括：

a.传感装置，其能够支持膜和多个孔，并可操作以使用孔和蛋白质实施 多核苷酸测序；

b.至少一个用于容纳用于实施测序的材料的储库；流体系统，其被配置 成可控地从所述至少一个储库向所述传感装置供应材料；和

c.多个用于接收各自样品的容器，该流体系统被配置成选择性地从所述 容器向所述传感装置供应样品。

该装置可以是下列任一文献中描述的装置：国际专利申请No.No. PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734),PCT/GB10/000789(公开为WO 2010/122293)，国际专利申请No.PCT/GB10/002206(尚未公开)或国际专利申 请No.PCT/US99/25679(公开为WO00/28312)。

通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例仅是出于举例 本发明某些方面和实施方案的目的，并无限制意义。

实施例

这里描述了多个实施例，用于展示测量大分子和聚阴离子或聚阳离子的 能力。

实施例I：用封闭(blocking)引物防止酶与DNA寡核苷酸酶结合

D355A、E357A核酸外切酶缺陷型KF(100,000U ml^-1;比活性20,000U mg^-1)得自于纽英伦生物技术有限公司（New England Biolabs）。野生型phi29 DNAP(833,000U ml^-1;比活性83,000U mg^-1)得自于Enzymatics。DNA寡核 苷酸在斯坦福大学蛋白与核酸工厂(Stanford University Protein and Nucleic  Acid Facility)合成并通过变性PAGE加以纯化。

实施例II：引物延伸和切离测定

一个用6-FAM标记5′端的67聚体、含14个碱基对的发夹DNA底物通 过90°C温育4分钟，随后在冰水中快速冷却来自退火。在10mM K-Hepes,pH 8.0,0.3M KCl,1mM EDTA,1mM DTT中(在标明时添加MgCl₂至10mM)， 添加dNTPs至指示浓度，用1μM退火发夹和0.75μM phi29DNAP(外切+) 进行反应。反应在室温下温育标明的时间，并通过添加缓冲液饱和的苯酚终 止反应。在抽提和乙醇沉淀后，将反应产物溶解在7M尿素、0.1X TBE中， 并在含有18%丙烯酰胺:双丙烯酰胺(19:1)、7M尿素、1X TBE的凝胶上变性 电泳来分离。延伸产物在UVP凝胶记录系统(UVP Gel Documentation system) 上使用Sybr金滤镜(Sybr Gold filter)可视化。条带强度用ImageJ软件(NIH) 定量分析。

实施例III：纳米孔实验

纳米孔装置以及将单个α-HL纳米孔插入到脂双层中已经描述过。用集 成膜片钳放大器(Axopatch200B,Molecular Devices)以电压钳制模式测量通 过α-HL纳米孔的离子电流通量。用模数转化器(Digidata1440A,Molecular  Devices)在全细胞设置中以100kHz进行数据采样，并用低通Bessel滤波器 以5kHz进行滤波。对于电压钳制实验，以每个图片中指定的电压测量电流 阻塞（反式-正极）(trans-positive)。实验在含有10mM K-Hepes pH8.0,1mM  EDTA,1mM DTT,0.3M或0.6M KCl(如图所示),和10mM MgCl₂(当有标 明时)的缓冲液中，在23±0.2°C下进行。在每次实验之前，通过95°C加热 3分钟并在冰浴中快速冷却将DNA发夹底物退火，以防止分子间杂交。

实施例IV：主动电压控制实验

纳米孔上DNAP-DNA复合体的主动电压控制用有限状态机(FSM)逻辑 实现，该有限状态机用LabVIEW软件(Version8,National Instruments)编程， 并在FPGA系统(PCI-7831R,National Instruments)上实现，如前人所述(Benner  et al.2000supra;Wilson et al.2009，上文)。在图2和S2所示实验中采用的 FSM逻辑的细节在图面说明中给出。

实施例V：纳米孔数据分析

KF(外切-)-DNA二元复合体的驻留时间(dwell time)和振幅用本实验室 开发的软件加以定量，该软件检测并定量捕获事件的EBS和终端电流阶跃 (terminal current steps)的驻留时间和振幅。phi29DNAP复合体的电流阻塞用 Clampfit10.2软件(Axon Instruments)加以定量。使用Clampfit软件获得phi29 二元和三元复合体的主I_EBS值，以确定在捕获事件初始阶段中1-5秒窗口内 测得的所有点振幅柱状图的峰。

实施例VI：phi29DNAP-DNA二元复合体和KF-DNA二元复合体的相 对稳定性

为了实施纳米孔实验，将单个α-HL纳米孔插入到将含有缓冲液的两个 室（称作顺室和反室）分开的脂双层中，并且膜片钳放大器施加电压并测量 离子电流(图1a)。为了检查phi29DNAP与DNA之间形成的二元复合体，我 们使用14个碱基对的DNA发夹底物(图1b)。如先前已经证明的(Benner et al. 2000supra;Hurt et al.2009，上文)，当用该底物形成的KF-DNA二元复合体 被捕获在α-HL孔中时，所得的离子电流标记以初始酶结合状态(EBS)为特 征。这在KF停留于孔顶，将DNA底物的双链/单链结合点保持在聚合酶活 性位点范围内时发生(图1c,ii)。在该KF-结合状态下，DNA模板链悬垂通过 纳米孔内腔(lumen)，其宽度足够容纳单链DNA，但不能容纳双链体DNA。 通过在模板链内插入无碱基(1′,2′-H)残基，插入位置使得当聚合酶-DNA复 合体位于孔顶端时其位于纳米孔的内腔中，例如图1b所示DNA发夹模板位 置+12-+16之间的5个无碱基残基，可以选择性放大该状态(I_EBS)的振幅。对 于KF-DNA二元复合体，EBS典型地在180mV施加电势下维持数毫秒(图 1c,ii)。其之后是较短的低振幅状态(图1c,iii)，这个状态在牵拉模板链的力 导致KF与DNA解离，并且双链体DNA落入纳米孔前庭(vestibule)时出现。 当其出现时，在EBS期间位于孔内腔的无碱基模块被移位到孔的反侧，在 那里，它对该终端电流阶跃振幅的影响可以忽略不计(在180mV时～20pA)。 DNA发夹在前庭内解链，随后通过电泳将链移动到反室，开放通道电流得 以恢复(图1c,iv)。

phi29DNAP与DNA底物之间的二元复合体能够在不存在5′-3′聚合酶 和3′-5′核酸外切酶活性必需的二价阳离子的条件下形成。当phi29 DNAP-DNA二元复合体用图1b的发夹底物形成并在180mV下被捕获在 α-HL孔内时(图1d,ii)，～35pA I_EBS典型地保持数十秒(中值=17.6s,IQR= 25.6,n=62)。这比KF-DNA二元复合体在相同条件下(中值=1.9ms,IQR= 2.4ms,n=199)长大约10,000倍，与KF-DNA复合体的捕获事件相反，这些 phi29DNAP-DNA事件不以单个终端阶跃结束，而是以在一系列离散的离子 电流阶跃中结束(图1d,iii)，我们称之为“终端级联”(terminal cascade)。野生 型phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶在实验条件下(1mM EDTA，不添加Mg²⁺) 被抑制，因此这些电流阶跃不是由于引物链的消化所致。因此，我们有理由 认为，DNA二聚体可以在与酶结合时解链(图11d,iii)。在这种情况下，当模 板在张力下解链离开复合体时，无碱基模块被以单个核苷酸递增的方式拖离 内腔，导致以终端级联的方式产生一系列离散的振幅阶跃(图1d,iii)。

图1图示了聚合酶-DNA二元复合体被捕获在α-HL纳米孔内。(a)纳米 孔装置的示意图。单个α-HL纳米孔被插入在30μm直径的脂双层内，该脂 双层分隔两个含有23°C10mM K-Hepes,pH8.0,300mM KCl,1mM DTT和 1mM EDTA的100μL小孔(well)。纳米孔缓冲液不含添加的MgCl₂。跨双层 膜的膜电势通过与Axon200B放大器串联的AgCl电极加以确定。b)本实验 中使用的DNA发夹底物。DNA链被设计成自身折叠，形成14bp双链体茎， 其被一个含有4个dTMP残基的环连接。引物链的3′残基是ddCMP。红色 的X指示5个无碱基(1′,22-H)残基，其位于DNA模板链的+12-+16位（用 序列上方的数字箭头指示）。模板链编码是相对于位置n=0的第一个非配对 残基(dCMP)（以蓝色指示）。无碱基单体的化学结构在DNA序列下方显示。 c)在180mV施加电压下捕获KF(外切-)-DNA复合体的相应离子电流标记。 (i)是开放通道电流；(ii)是酶结合态电流(I_EBS)；(iii)是当电压促进的KF(外切 -)与DNA解离导致发夹的双链体区段落入孔前庭时导致的电流；(iv)是通过 使DNA发夹当其在纳米孔前庭内时解链并随后被电泳到反室时，导致的返 回到开放的(return to open)通道电流。KF(外切-)二元复合体中值EBS驻留时 间为1.9ms(n=199)，与由相同发夹底物形成的二元复合体在5mM MgCl₂存在下的驻留时间相同。(d)在180mV电势下捕获phi29DNAP-DNA复合 体时的离子电流标记。(i)是开放通道电流；(ii)是phi29DNAP-DNA二元复 合体的I_EBS；(iii)是DNA双链体在与phi29DNAP结合的状态下假定解链并 且随后DNA步进通过孔时导致的电流终端级联；和(iv)是在解链DNA电泳 到反室之后开发通道电流的恢复。小图(c)中KF(外切-)和小图(d)中phi29 DNAP的浓度是0.75μM；两个小图中DNA的浓度均为1.0μM。注意小图 (c)和(d)之间时间尺度的差异。

这个模型提示，phi29DNA与DNA之间的相互作用足够强，在phi29 DNAP与DNA之间的结合得以被打断之前DNA二级结构由于牵拉模板链 的力量而解链。这进一步预测，在终端级联期间降低施加电压将允许DNA 双链体重新退火，同时与酶保持缔合，从而将phi29DNAP-DNA复合体重置 到其在DNA模板链上的原始位置，显示为返回到～35pA状态。为了检验这 个预测，我们比较了在存在或不存在Mg²⁺时捕获的复合体经过人为控制的 电压降后恢复到原始的180mV处的EBS振幅的能力。这种比较的先决条件 是保证在Mg²⁺存在下被捕获的DNA分子的完整性的手段，从而使纳米孔测 定仅比较它们在捕获后的命运。因此，在实验期间，体相中引物链的核酸外 切必须最小化。

我们在凝胶测定中检验了DNA底物3′-H末端是否抑制phi29DNAP的 3′-5′核酸外切速度，该测定比较2个携带dCMP(泳道1-6)或ddCMP(泳道 7-12)末端的67聚体5′-6-FAM标记发夹底物的降解(图2a)。与phi29DNAP 3′-5′核酸外切酶功能需要二价阳离子一致，在含有1mM EDTA但没有添加 Mg²⁺的纳米孔缓冲液中温育45分钟后，均没有观察到DNA底物的切割（图 2a，泳道1和7）。在10mM Mg²⁺存在下，3′-H底物的DNA消化程度可辨 识地小于3′-OH底物。10分钟后，仅有24.5%的全长DNA分子保持dCMP 末端发夹，而90.5%的ddCMP末端底物则保持完整(图2a，泳道4和10)。 45分钟后，4%的dCMP末端底物和45%的ddCMP末端底物保持完整(图2a， 泳道5和11)。由3′-H末端提供的切割保护进一步得到在所有4种dNTP存 在下引物延长程度的证实。对3′-H末端底物，DNA合成开始需要首先切离 ddCMP残基。因此，在45分钟内，具有3′-OH末端的发夹有>80%的分子 延长为全长102聚体产物(图2a，泳道6)，而具有3′-H末端的发夹，79.8% 的分子仍保持完整，而只有20.1%的全长延长产物(图2a，泳道12).因此，3′-H 末端的DNA底物在添加Mg²⁺后提供了一个窗口，在此期间phi29 DNAP-DNA复合体能够被捕获而DNA底物保持完整。因此，我们在设计用 于评估在phi29DNAP末端级联开始后用于发夹重折叠的电势的纳米孔实验 中，使用了图1b所示的以ddCMP为末端的发夹。

在该实验中，当phi29DNAP-DNA复合体在180mV下被捕获时，有限 状态机(FSM，见实施例IV)实时监视离子电流，直到检测到终端级联的向下 电流阶跃为止(图2b，ii)。当离子电流下降到31pA以下达至少0.5ms时(图 2b中的红色箭头)，FSM将施加电压降低到70mV(图2b,iii)。在70mV2 秒后，将施加电压恢复到180mV，并重新测量phi29DNAP-DNA复合体的 振幅。当不存在Mg²⁺时，在11种测试分子的每一个中的I_EBS水平均可重复 地被重置到最初的35pA水平。这种EBS振幅指示这样一种初始状态，其 中phi29DNAP与碱基配对双链体在位于聚合酶活性位点中的n=0模板残 基处结合(图2b,iv)；并与具有完整引物链的DNA模板的重新退火一致。

重要的是，在70mV的间隔期间，主要的振幅是～10.2pA，偶尔偏移到 ～8.5pA，可测量地高于对照实验中未结合的DNA在70mV下确定的6.8pA 的数值(图S2)。这表明，phi29DNAP复合体在整个较低电压间隔期间保持 在纳米孔洞顶上而没有解离，与如下的模型一致，其中当发夹与phi29DNAP 在孔上方缔合时，在180mV发生解链并且在70mV发生重折叠。

当在10mM Mg²⁺存在下实施重折叠实验时，在添加Mg²⁺后的最初12.5 分钟内24个被捕获的复合体中有16个具有～35pA I_EBS水平，表明它们是由 完整的DNA底物分子形成的(图2c,i)。这种35pA状态保持数秒(中值=10.2 s,IQR=12.7s,n=16)，之后以振幅下降为结束(图2c,ii)。35pA状态之后出 现的阶跃特征与不存在Mg²⁺时终端级联的表征不同(比较图2b,ii与2c,ii)。 对于这些复合体，当电压降低到70mV达2秒钟然后恢复到180mV时，35 pA I_EBS水平对于所测试的任何复合体均未重置(图2c)。这与不存在Mg²⁺时 捕获的phi29DNAP-DNA复合体相反，表明以完整状态被捕获的DNA底物 在它们被保持在孔顶上时被核酸外切修饰。这种DNA在与phi29DNAP结 合的纳米孔上系统性非催化解链随后重退火的过程可以在主动电压控制下 被重复多次。

图2图示了，DNA发夹在180mV施加电势下从phi29DNAP解离的期 间发生的双链体解链在70mV下被逆转。(a)ddNMP(3′-H)末端的引物链在 体相中保护14bp DNA发夹底物免于phi29DNAP催化的3′-5′核酸外切降 解。将携带3′-OH(泳道1-6)或3′-H(泳道7-12)末端的5′-6-FAM标记的发夹 底物(1μM)，在室温下在含有10mM K-Hepes,pH8.0,300mM KCl,1mM  DTT和1mM EDTA的缓冲液中与0.75μM phi29DNAP温育指示的时间。 泳道1和7中的反应不含有外加的MgCl₂；泳道2-6和8-12中的反应含有 10mM MgCl₂。泳道6和12的反应还含有dATP,dCTP,dGTP和dTTP各200 μM。反应产物在18%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。相应于完整的67聚体起 始底物和102聚体全长延伸产物的凝胶位置用凝胶侧面的箭头指示。 5′-6-FAM标记的DNA发夹的序列如图S1所示。(b)电压促进的phi29 DNAP-DNA复合体解离通路中的阶跃是可逆的。在本实验中，缓冲液含有 1mM EDTA但未添加MgCl₂，以阻止phi29DNAP3′-5′核酸外切酶活性。(i) 与图1b所示发夹底物形成的phi29DNAP-DNA二元复合体的捕获。这将位 于模板链的+12至+16位之间的无碱基插入物定位到纳米孔内腔的限制性开 孔内，产生一个35pA的I_EBS；(ii)在该35pA状态保持数秒后，通过纳米孔 的电流逐步减小，同时180mV施加电势促进DNA双链体解链并使5个无 碱基模块持续地移出该限制性开孔；(iii)当电流振幅下降到低于31pA达至 少0.5ms时，有限状态机(FSM)将电压降低到70Mv(电流轨迹中的红色箭头) 达2秒钟，以允许DNA双链体重退火到其原始状态(在示意图中用弯曲的红 色箭头指示)，同时将phi29DNAP-DNA复合体保持在α-纳米孔上；(iv)在 70mV达2秒后，FSM将施加电压恢复到180mV。最初35pA电流水平的 恢复(虚线)表明，phi29DNAP-DNA复合体已经重置到其原始的捕获状态。 (c)phi29DNAP-DNA复合体在允许从DNA引物链3’-5’核酸外切切离核苷酸 的条件下解离。在该实验中，向小图b中所述的缓冲液添加10mM MgCl₂。 (i)将phi29DNAP-DNA复合体捕获在α-HL纳米孔中，使得5个无碱基模 块定位到纳米孔内腔的限制性开孔中，产生35pA的I_EBS，这一现象可以诊 断复合体携带具有完整ddCMP末端的DNA底物；(ii)5个无碱基模块移出限 制性开孔导致通过纳米孔的电流减小，这可以由下导致：1）DNA双链体解 链，或2）phi29DNAP催化的引物链的3′-5′核酸外切降解，同时复合体被 保持在孔顶；(iii)如在小图b(iii)中一样，当电流振幅降低到31pA之下达至 少0.5ms时，FSM将电压降低到70mV达2秒钟，以使DNA双链体重退 火(电流轨迹中的红色箭头)，同时将phi29DNAP-DNA复合体保持在纳米孔 上；(iv)与小图b(iv)相反，2秒后通过FSM恢复施加180mV的电压不会恢 复最初的35pA I_EBS(红色虚线)，表明在允许催化位于孔顶上的phi29 DNAP-DNA复合体中的3′-5′核酸外切的条件下，不恢复最初的捕获状态。

实施例VII：模板无碱基插入位置对与phi29DNAP结合的DNA底物 的I_EBS的影响的作图

我们对由保持在纳米孔顶上的聚合酶-DNA复合体催化的DNA合成的 检测策略采用当聚合酶沿着模板前进、将模板链中的无碱基残基模块以单核 苷酸递增的方式拉入和通过纳米孔内腔时，监视离子电流的变化。这种方法 能够识别受酶驱动的顺次埃级(Angstrom-scale)移动。

作为使用phi29DNAP的DNA复制实验的前奏，我们建立了参考图， 其将I_EBS与5个无碱基模块在DNA发夹底物模板链中的位置相关联(图3)。 为了构建该图，使phi29DNAP结合于一系列含有5个连续无碱基残基的模 块的底物中的每一个，依次偏移一个核苷酸(图3a)。我们测量了含有0.3M KCl的缓冲液中用于在如下两个条件下捕获复合体的I_EBS：i)1mM EDTA， 不添加Mg²⁺，其在没有支持性的核苷酸切除或添加的同时允许形成二元复 合体(图3b，泳道1)；和ii)10mM Mg²⁺,400μM ddCTP,和100μM dGTP。 后面的两个条件在体相中分别使98.2%和96%的3′-H末端发夹分子保持完 整状态达10和45分钟(图3b，泳道6和7)。由ddCTP提供保护，若ddCTP 被核酸外切功能切除时，phi29DNAP可发挥聚合酶功能从而恢复分子的 ddCMP末端(图3b，泳道3和4)。dGTP的存在提高了保护作用，其与n=0 处的模板残基互补，并能够在3′-H末端DNA底物的存在下形成phi29 DNAP-DNA-dGTP三元复合体，其可以增加引物末端位于聚合酶结构域而非 核酸外切酶结构域中的时间的比例(图3b,泳道6和7；图S3)。因此，在 Mg²⁺,ddCTP和dGTP存在下形成的复合体在本研究中被操作性地定义为三 元复合体。

图3c显示了phi29DNAP二元复合体(蓝点)和三元复合体(红点)的I_EBS图。两个图均与使用6个无碱基模板插入物在80mV下对KF(外切 -)-DNA-dNTP三元复合体确定的映射相似。在0.3M KCl、180mV下，I_EBS范围是22.3pA，即用5ab(6,10)底物(无碱基模块位于模板位置+6-+10，从聚 合酶催化位点n=0起测量)形成的三元复合体的I_EBS，到35.4pA，即用 5ab(11,15)和5ab(9,13)底物(无碱基模块分别位于模板位置+11-+15和+9-+13) 形成的二元复合体的I_EBS。这给出了至少13pA的动态振幅范围，用于检测 聚合或核酸外切反应期间酶的移动。

在图中的所有点，二元和三元复合体的I_EBS均相互偏移(offset from one  another)。偏移的方向和程度部分地取决于沿着图的位置。例如，在位置(i)(图 3c)，二元复合体变为三元复合体导致I_EBS从31.5pA增加到34.5pA。相比之 下，在位置(ii)(图3c)，二元到三元的变化导致相对较小的电流增加，从34.4 到35.2pA；在位置(iii)(图3c)，二元向三元转变导致较大的I_EBS电流降低， 从31.5pA到25.5pA。有趣的是，二元状态下离子电流闪烁(flicker)的方向和 大小经常预示从由相同底物形成的三元复合体观察到的主要振幅(图3d)。

图3图示了phi29DNAP-DNA复合体在180mV的EBS振幅是DNA模 板链中无碱基插入位置的函数。(a)在phi29DNAP作图实验中使用的DNA 发夹。在每个序列中，红色X指示无碱基(1′,2′-H)残基的位置。无碱基构型 标示为5ab(x,y)，其中5是插入物中无碱基残基的数目，x和y指示插入物 中第一个与最后一个无碱基残基的距离(以核苷酸计)，从聚合酶催化位点中 n=0的模板链dNMP起量度。形成14个碱基对发夹的自身互补序列模块加 下划线。每个发夹的无碱基构型标示在每个序列的左侧。(b)在绘制phi29 DNAP-DNA复合体振幅的纳米孔实验期间体相中发夹底物的状态。将一种 5′-6-FAM,3′-H14bp发夹(1μM)在室温下与0.75μM phi29DNAP在含有1 mM EDTA、不含(泳道1)或含有(泳道2-7)10mM MgCl₂的缓冲液中温育指 示的时间。反应包括了400μM ddCTP(泳道4和5)或400μM ddCTP与100 μM dGTP(泳道6和7)。泳道1中的条件是用于绘制phi29DNAP-DNA二元 复合体的振幅的条件。泳道6和7中的条件是用于绘制phi29 DNAP-DNA-dGTP三元复合体的振幅的条件。(c)在含有0.3M KCl的缓冲液 中对phi29DNAP-DNA二元(蓝圆)或phi29DNAP-DNA-dGTP(红圆)复合体 的主要振幅值绘图。每个点代表从三个独立实验确定的平均I_EBS+/-标准误 差。蓝色和红色虚线分别指示与由正常DNA残基且不带无碱基插入构成的 DNA发夹底物形成的phi29DNAP二元和三元复合体的振幅。(d)显示在二 元(标记为-Mg²⁺,-ddCTP/dGTP)或三元(标记为+Mg²⁺,+ddCTP/dGTP)作图条 件下捕获的与含有无碱基构型(i)5ab(13,17),(ii)5ab(12,16),或(iii)5ab(8,12) 的DNA发夹底物形成的复合体的代表性事件区段的电流轨迹。图中用这些 底物形成的复合体的位置在小图3c中用相应的小写罗马数字指示。

作图实验结果容许根据关于导致终端级联的分子事件提出的模型进行 预测(图1和2)：在二元复合体捕获事件的终端级联中，电流阶跃的顺序应 当以依赖于复合体中无碱基模块的初始位置的方式改变。这已经得到证实。 例如，当5ab(6,10)底物的复合体片段在终端级联期间解链时，无碱基模块被 从其位于酶附近的位置向反室拖拽。这导致在无碱基模块穿过孔内腔时产生 一系列～36pA峰值的电流阶跃(图S4,a)。相反，对于与5ab(18,22)底物形成 的二元复合体，无碱基模块的初始位置远离酶。当该底物在终端级联中被解 链时，观察不到振幅峰(图S4,b)。

实施例VIII：由phi29DNAP催化的DNA模板在纳米孔内的受控转位

来自我们实验室的结果显示，在T7DNAP(外切-)复制期间，可以以单个 核苷酸的精度检测到DNA模板在α-HL纳米孔中的前进。然而，对于大部 分与这种酶形成的复合体，只有一个或两个核苷酸添加循环可以被监视到。 为了确定phi29DNAP是否在纳米孔上更高效地催化顺序核苷酸添加，我们 测量了在其模板链中带有5个无碱基插入的合成DNA底物分子在phi29 DNAP驱动下的位移。利用图3中的图来解释当单个核苷酸被酶促添加到或 从DNA3′端除去时I_EBS的变化。

图2c中的实验显示，在体相中ddNMP残基的缓慢切离可用于在Mg²⁺存在下捕获其中引物链保持完整的复合体。重要的是，该实验还显示，可以 在孔上实现ddNMP残基的切离，暴露-1残基的3′-OH，从而产生这样的底 物，其在dNTP的存在下可以在孔顶潜在竞争合成反应。与先前的发现一致， 图2a中的凝胶实验显示，在dNTP存在下，体相中聚合反应相对于核酸外 切反应占主导地位。这些发现对于我们DNA复制实验策略是至关重要的： 在dNTP存在下捕获带有完整3′-H末端底物的phi29DNAP复合体允许在孔 上发生切离反应，并且在模板链中使用无碱基模块标签来明确确定是否观察 到保持在孔顶的复合体的聚合反应。使用这种策略，大部分被捕获在纳米孔 中的复合体应在相同的模板位置(相对于起始底物最初n=0位置是-1)开始 复制。

因为dGTP能够通过形成三元复合体减慢ddCMP的切离速度(图3b,图 S3)，所以我们选择使用20μM每种dATP,dCTP,dTTP和5μM dGTP进行最 初的纳米孔合成实验。我们使用5′-6-FAM,3′-H发夹底物在凝胶测定中确定 了这些条件对体相中DNA底物分子状态的影响(图4b)。10分钟之后，67聚 体起始底物中82.5%的保持完整，13.6%被延伸成102聚体产物。20分钟后， 这些比例是69.4%和26.1%延伸产物，到45分钟为止，大约30%的荧光素 标记发夹被延伸。因此，在我们的纳米孔实验中，将测量限定到向顺室添加 Mg²⁺和dNTP底物后的最先10分钟。

在这些条件下的初始纳米孔复制实验中(图4)，我们使用的DNA底物具 有起始无碱基构型5ab(15,19)并带有3′ddCMP末端(图4a)。图4c和4d分别 显示了在存在10mM Mg²⁺且具有或没有dNTP的条件下，使用该底物在180 mV下捕获phi29DNAP-DNA复合体的典型离子电流轨迹。在两种条件下， 捕获时的主要初始I_EBS为～29pA，并偏移到～26pA，与5ab(15,19)二元和三 元复合体图谱值之间的波动(图3c)一致。在两种条件下，起始I_EBS水平都存 在滞后，这是由于3′ddCMP末端的缓慢切离导致的，之后产生了一系列电 流变化。我们对在不存在dNTP时进行的实验中电流变化(图4c)的解释如下： 当ddCMP切离时，phi29DNAP核酸外切酶持续地从引物末端顺次切割核苷 酸，产生持续缩短的双链体区段，并且酶与无碱基插入物之间的距离持续增 大。因此，该无碱基片段通过孔并向着反室移动，导致持续性离子电流降低。 最终，离子电流返回到开放通道状态，这与DNA与phi29DNAP解离并随 后电泳进入反室一致。

相反，当实验在存在20μM每种dATP,dCTP,dTTP和5μM dGTP下实 施时，产生不同的离子电流模式，特征是出现35.4pA峰(图4d)。我们推测， 发生这些电流变化是因为，在phi29DNAP切离保护DNA3′端的ddCMP残 基后，dNTP的存在有利于孔顶上phi29DNAP催化的核苷酸添加。随着phi29 DNAP持续性移动靠近DNA模板内的无碱基插入物，双链体DNA片段被 延伸，将其牵引通过纳米孔内腔，伴随着在图3b的图中主离子电流峰在无 碱基构型5ab(15,19)和5ab(6,10)之间往返移动。图4e显示了在本实验期间， 由一系列被捕获的phi29DNAP-DNA复合体催化的多个DNA模板复制反 应。

在图4b所示的凝胶实验中，除了起始67聚体发夹底物和全长延伸产物 之外，相应于部分延伸产物的中间条带随着时间而积累(图4b,泳道6和7)。 这些产物的出现可能是由于体相中dNTP池的耗尽，因为在凝胶和纳米孔实 验中存在的1μM DNA底物分子中有更多部分被复制。因为这会潜在影响孔 顶上的phi29DNAP复合体所催化的延伸和合成速度，所以我们检查了通过 使用更高浓度的dNTP是否能够将其最小化。

我们测量了在100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，5′-6-FAM, 3′-H末端发夹的引物延伸程度作为时间的函数(图5a和b)。在这些条件下， 全长产物的积累速度慢于图4b中的实验(使用dCTP,dTTP,dATP各20μM和 5μM dGTP)，可能是由于更高浓度的dGTP会更高效地抑制ddCMP末端的 切离。20分钟后，86.3%的起始DNA底物保持完整，而13.6%的被完全延 伸(图5a，泳道6,和5b)。相比之下，在使用更低浓度的dNTP和相同时间 量进行的反应中，这些物质分别为69.4%和26.1%(图4b，泳道6)。重要的 是，即使在30分钟后，较短延伸产物的积累仍然低于该测定的检出限。因 此，我们在随后的复制实验中使用100μM浓度的每种dNTP底物。

为了检验为在图4d和4e的复制实验中观察到的离子电流标记提出的模 型，我们使用一种DNA发夹底物，其中第一个模板dTMP残基位于相对于 无碱基插入的限定位置(图5)。当在100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和ddATP 存在下用该底物进行DNA合成反应时，可以添加12个核苷酸，期间无碱基 模块将被从5ab(18,22)的起始位置，跨越5ab(11,15)的35.4pA峰，牵引至位 置5ab(6,10)。在到达位于+12的dTMP残基后，预期复制将终止。相反，在 存在100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和dATP下进行的复制反应将可以进展 通过该+12位置。

图4图示了纳米孔上由phi29DNAP催化的DNA复制。(a)用于纳米孔 复制实验的DNA发夹底物。该底物的起始无碱基构型是5ab(15,19)。开始引 物延伸需要核酸外切离末端ddCMP残基，在此之后当酶到达无碱基模块之 前可以添加添加15个核苷酸。随着复制的进行，5个无碱基残基模块将被牵 引通过孔，并从无碱基构型5ab(15,19)变为5ab(6,10)，其构成图3图谱中的 主峰。(b)在纳米孔实验条件下，Phi29DNAP在体相中催化的DNA发夹底 物的引物延伸。在含有10mM K-Hepes,pH8.0,0.3M KCl,1mM DTT,和1 mM EDTA,不存在(泳道1)或存在(泳道2-7)10mM MgCl₂,及添加标示的 dNTP的缓冲液中，将67聚体5′-6-FAM,3′-H14bp发夹(1μM)与0.75μM  phi29DNAP在室温下温育指定时间。反应产物在18%变性聚丙烯酰胺凝胶 上分离。泳道5-7在小图d和e中显示了在纳米孔实验的dNTP底物条件下 (5μM dGTP,dATP,dCTP和dTTP各20μM)体相中10、20和45分钟时的引 物延伸程度。(c)在存在1mM EDTA和11mM MgCl₂、不存在dNTP的条件 下用小图a所示5ab(15,19)发夹形成的phi29DNAP-DNA复合体的代表性捕 获事件。(d)在存在1mM EDTA、11mM MgCl₂和5μM dGTP及20μM每 种dATP,dCTP和dTTP的条件下用小图a所示5ab(15,19)发夹形成的phi29 DNAP-DNA复合体的代表性捕获事件。(e)由Phi29DNAP催化的被系列捕 获的各个DNA底物分子的复制。实时显示电流轨迹；4个系列中的第一个 事件是小图d所示事件的扩大。小图c-e所示的电流轨迹是在添加MgCl₂(c) 或MgCl₂和dNTPs(d,e)后最初10分钟内收集的，以便使由于体相反应导致 的dNTP耗竭最小化。

当与该DNA底物形成的phi29DNAP复合体在这两种条件下被捕获时， 出现了一段数秒的最初时期，其间主要的电流幅度为～31A，伴随到～27pA 的振荡(图5d和e)，与该5ab(18,22)构型的三元和二元复合体的图谱值相似(图 3c)。在该状态结束后，35.4pA离子电流峰被快速通过，指示无碱基模块被 牵引通过内腔。如果在顺室中存在dGTP,dCTP,dTTP和ddATP，在通过该 峰后，聚合酶停止于如下状态，其中电流在～25pA-28pA的主要振幅之间 振荡数秒(图5d)。相反，在dATP而非ddATP存在下，聚合酶前行通过并超 过25pA状态而无停止(图5e)。这证明，在ddATP存在下观察到的停止状态 （其表明复制复合体到达了dTMP残基）是在导致振幅峰的模板片段穿过内 腔之后实现的。因为到达该dTMP模板残基需要穿越5ab(17,21)到达5ab(7,11) 无碱基构型所必需的核苷酸掺入，所以这些实验证明，该特征振幅峰是由于 ddCMP在孔上切离后发生的复制导致的。

图5图示了phi29DNAP催化的复制到达或通过特定模板位置。(a)在 phi29DNAP和100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，DNA发夹 底物在体相中引物延伸的时间过程。在含有1mM EDTA、不存在(泳道1)或 存在(泳道2-7)10mM MgCl₂和所有四种dNTP各100μM(泳道1-10)的缓冲 液中，将67聚体5′-6-FAM,3′-H14bp发夹(1μM)与0.75μM phi29DNAP 在室温下温育指定时间。引物延伸的开始需要在持续性添加dNTP之前核酸 外切切离末端ddCMP残基。反应产物在18%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。 (b)在小图的凝胶中相应于完整、未延伸发夹（蓝色菱形）和延伸产物（红色 菱形）的条带的荧光强度用ImageJ软件(NIH)定量。对于每个泳道，将这两 个条带的总荧光的分数作为反应时间的函数进行描点作图。(c)用于纳米孔反 应实验的DNA发夹底物。起始无碱基构型是5ab(18,22)。在dGTP,dCTP,dTTP 和ddATP存在下，可以最多添加12个核苷酸，直至响应于第一个模板dTMP 残基（蓝色）的ddATP被添加。该dTMP残基被如此定位，使得到达该终 点需要复制一段模板，而在此期间无碱基模块（红色X）被牵引进入并通过 纳米孔内腔。在掺入ddATP之后，可以形成具有无碱基构型5ab(6,10)的phi29 DNAP-DNA-dTTP三元复合体。在dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，复制 可以进行通过+12位置，并到达无碱基模块。(d)在含有0.3M KCl和10mM  MgCl₂的缓冲液中，在100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和ddATP存在下，phi29 DNAP催化的小图c所示发夹底物的复制。(e)在向小图(d)所示的实验中添加 200μM dATP之后，phi29DNAP催化的复制。小图d和e所示的事件是数 十个被捕获复合物的代表。对照实验(其中添加了100μM每种dGTP,dCTP, dTTP和dATP但没有ddATP)中的事件与小图e所示的代表性事件相同。复 合体在向纳米孔室添加MgCl₂后的最初10分钟内被捕获。

实施例IX：phi29DNAP催化DNA复制的速度受到所施加的跨纳米孔 电压的影响

使用光镊的实验显示，由phi29DNAP催化的复制速度被模板上～20-～ 37pN的张力所减慢。这个结果预示，phi29DNAP复制的速度会受到跨纳米 孔施加的电压的影响。然而，会发生这个现象的电压模式(voltage regime)并 不知道。

图6显示了对于如下实验，当phi29DNAP沿着DNA发夹底物的25nt 模板片段进行复制反应期间的代表性事件(图6a)，在这些实验中，施加电压 在220mV-100mV的范围内以40mV递增。该底物的起始无碱基构型是 5ab(25,29)；因此，在DNA合成期间，5个无碱基插入物将被牵引通过纳米 孔内腔的限制性开孔，跨越无碱基构型5ab(18,22)到5ab(6,10)，从而跨越图 3c中描绘的振幅。这些峰在每个电压下均被穿过，且穿过的速度似乎随着施 加电压的降低而增加(图6b)。我们测量了在对应于主电流峰两侧位置的两个 容易区分的电流振幅（图6b,i中的蓝色箭头）之间前进所需的时间，它们之 间间隔大约5个核苷酸。在220mV，复制整个该距离所需的中值时间为227 ms(IQR=174ms,n=45)；在100mV，复制的中值时间为67ms(IQR=41ms, n=59)。

图6图示了在不同电压下phi29DNAP催化的被保持在纳米孔上面的复 合体的复制。(a)用于纳米孔复制实验的DNA发夹底物。该底物的起始无碱 基构型是5ab(25,29)。在引发DNA合成必需的核酸外切切离末端ddCMP残 基之后，在酶到达无碱基模块之前可以添加25个核苷酸。在DNA合成期间， 5个无碱基插入物被牵引通过并越过无碱基构型5ab(18,22)到达5ab(6,10)， 其跨越图3中图绘的位置。(b)显示在100μM每种dGTP,dCTP,dTTP和dATP 存在下，在含有0.3M KCl,10mM MgCl₂的缓冲液中，小图a所示发夹底物 的phi29DNAP复制的代表性电流轨迹。显示了在(i)220mV,(ii)180mV,(iii) 140mV和(iv)100mV施加电压下的合成的轨迹。合成在向纳米孔室添加 MgCl₂后的最初10分钟内进行检查。220mV轨迹下方的蓝色箭头指示用于 定量220和100mV下的合成速度的起始和结束状态。

实施例X：在纳米孔上phi29DNAP对较长DNA模板的复制

预想到天然DNA模板在纳米孔上的复制，我们测量了合成DNA发夹 底物中较长区段的phi29DNAP依赖性复制。该发夹底物具有5ab(50,54)的 起始无碱基构型，在酶到达无碱基模块之前可以添加最多50个核苷酸(图 7a)。当与该底物形成的phi29DNAP-DNA复合体在180mV下在含有0.3M KCl的缓冲液中被捕获时，最初存在数秒钟的间隔，此期间电流在～23pA 的主要振幅到～25pA的跃迁之间振荡。47个被捕获的复合体中有27个以该 振荡开始，当这个时期结束后，聚合酶继续通过图绘的振幅峰(图7b)。

我们推测，该振荡标记相应于带有完整ddCMP末端被捕获的复合体， 其捕获发生于允许后面发生合成的ddCMP切离反应之前，这是因为(i)在图 4、5、6和7所示的实验中，在每个成功复制反应的捕获和合成之间总是出 现相似的模式，其随后穿越无碱基35.4pA峰；(ii)振荡的上下振幅水平在这 些实验间依赖于DNA底物起始无碱基构型而不同；(iii)那些水平与针对每个 底物无碱基构型图绘的二元和三元复合体的振幅非常接近；和(iv)在上下振 幅状态中花费时间的比例可以按照dGTP浓度的函数加以调节（数据未显 示）。

因此，我们使用该振荡状态的结束作为起点，估计phi29DNAP穿越～50 nt模板片段所需的时间。我们从在振荡刚刚结束时出现的小但是可重复的电 流微降(dip)（图7b中的左边蓝色箭头）开始测量，直到图上主峰远端侧上 可识别的振幅状态（图7b中的右边蓝色箭头）。在含有0.3M KCl的缓冲液 中复制整个该距离所需的中值时间为1.39s(IQR=0.57s;n=27)。

对于这种嗜热聚合酶，令人惊讶的是，在含有0.6M KCl的缓冲液中也 可以检测到phi29DNAP对5ab(50,54)底物的复制（图7c）。与在0.3M KCl 中的复制反应相似，这些事件以如下状态开始，其中电流在开始复制前在两 个水平之间振荡数秒钟（图7c）。在这些更高离子强度的条件下，电流在～32 pA的主要水平与～34pA的跃迁之间振荡。在以该电流振荡开始的41个事 件中，有25个随后出现了牵引无碱基片段通过纳米孔内腔、并导致无碱基 模块穿越图绘的振幅峰的复制。在0.6M KCl下，穿越从振荡周期结束（图 7c中的左蓝色箭头）到主无碱基振幅峰远端侧（图7c中的右蓝色箭头）之 间的距离所需的中值时间为2.41s(IQR=1.13s;n=25)。

图7图示了由phi29DNAP在纳米孔上催化的持续性DNA复制。(a)用 于纳米孔复制实验的DNA发夹底物。该底物的起始无碱基构型是 5ab(50,54)。在引发DNA合成必需的末端ddCMP残基被核酸外切切离之后， 在酶到达无碱基模块（由模板链序列上方的蓝色箭头指示）之前可以添加50 个核苷酸。在DNA合成期间，随着最初32个核苷酸被掺入并且到达无碱基 构型5ab(18,22)，5个无碱基插入被拉向孔的内腔；随后的核苷酸添加将该 模块拉到并且拉过构型5ab(6,10)。因此，图3中振幅图中的无碱基构型被跨 越。(b)180mV施加电势下的代表性电流轨迹，其显示了在含有0.3M KCl 的缓冲液中小图a所示发夹底物的phi29DNAP复制。(c)180mV施加电压 下的代表性电流轨迹，其显示了在含有0.6M KCl的缓冲液中小图a所示发 夹底物的phi29DNAP复制。小图b和c中，左右蓝色箭头分别指示用于估 计沿着该模板复制～50nt所需时间的起始和结束点。合成反应在dGTP,dCTP, dTTP和dATP各100μM存在下实施，并在向纳米孔室添加MgCl₂后的最初 10分钟内检查合成反应。

这些结果出人意料地比考虑现有技术的预期更好。

实施例XI：电流轨迹中的噪音能够帮助鉴定沿聚合物链的相邻单体

图9a：这个轨迹显示了伴随着带有无碱基残基的DNA链在phi29DNA 聚合酶控制下移动通过α-HL孔的6个平均电流水平(i-vi)。电流水平iv中的 峰-峰噪音显著比所有其它水平的噪音都大。这是由于位置iv左右的模板运 动导致的，其可以探测邻近的位置iii和v。与位置iii和v相关的电流与位 置iv非常不同，因此iv周围的噪音更能够预测其近邻的身份。

图9b：这个轨迹显示了由于在带有无碱基残基的DNA模板在phi29 DNA聚合酶内移位时产生的～3-5埃链位移导致的电流差异。在没有底物的 小图(i)中，主要电流是31pA，伴有到大约34pA的电流偏移（噪音），预测 由于链相对于传感器的位移导致的下一个主要状态将是34pA。在小图(ii) 中，下一个位置（偏离第一个位置大约3-5埃）被底物稳定化于预测的34pA 水平。偶尔向31pA的向下噪音扰动证实了先前占据传感器的一个或多个单 体的身份。iii)在沿着与phi29DNA聚合酶结合的模板链的不同的位置处， 主要电流（没有底物）是31pA。向～25pA的噪音偏移预示了当链被稳定化 1个核苷酸（～3-5埃）时的主要电流。在底物存在下(小图iv)，～25pA水平 被稳定化，证实了(iii)中的预测。在(iv)中偶发的从25pA向31pA的噪音扰 动证实了传感器中先前单体一个或多个单体的身份。

图9c：这个轨迹显示了纳米孔中由phi29DNA聚合酶催化的DNA模板 的复制和伴随的1nt移动。DNA模板中的单个无碱基报告者导致大的电流 动态范围。这里，催化仅在存在每种dATP,dCTP,dTTP各100μM，但仅有 1μM dGTP的条件下发生。一些状态之间截然不同的闪烁(flicker)是由于， 当模板中的dC单体到达phi29DNA聚合酶的催化结构域但无法掺入dG核 苷酸，因此返回到先前状态，从而导致模板链发生3-5埃(1nt)的位移所导致 的。如在(b)中一样，闪烁预示下一个稳定的振幅。这在位置i,ii和iii中被 突出显示。注意在这些位置处，闪烁围绕电流平均值是不对称的。

图9c：这个轨迹显示了我们预测后随的离子电流振幅的能力对于所有 DNA模板均是有效的。在该实例中，催化在存在dATP,dCTP,dGTP各100 μM，但仅有1μM dTTP的条件下发生。当phi29DNA聚合酶试图在催化结 构域中添加相对于模板dA的dT时，在(i)处出现23pA向22pA的闪烁。添 加dT失败导致模板在180mV负载下返回到其先前状态(距离1nt)。最终（ii， 红色箭头）dT得以添加，使得电流稳定在22pA，从而允许模板进一步前进。

实施例XII：DNA通过纳米孔的速度的降低

我们已发现phi29DNA聚合酶(DNAP)与单链DNA(ss-DNA)结合会显著 降低ss-DNA在180mV施加电势下穿过α-溶血素纳米孔的速度。单链DNA 以接近1个核苷酸/1-100ms的速度通过phi29DNAP和α-溶血素纳米孔。

图10a显示了典型的具有跨膜电势差的纳米孔。图10b显示了与短寡核 苷酸探针杂交的实验多核苷酸ss-DNA。在该实例中，‘X’代表无碱基核苷酸。 图10c图示了不存在phi29DNAP时的一个典型循环，其代表了与ss-DNA 部分杂交的寡核苷酸的行为，并显示了跨膜(film)或膜(membrane)的电流的伴 随变化。在该实例中，两条链均通过α-溶血素。图10d图示了，在存在phi29 DNAP时，ss-DNA靶序列被顺次通过α-溶血素纳米孔，但是寡核苷酸反复 地从ss-DNA去杂交，而ss-DNA保持在纳米孔的相同位置处，直至所有寡 聚体解离，然后ss-DNA可以自由通过。相关电流图显示了相关步骤（步骤 (ii)至步骤(v)）中电流的峰。

实施例XIII：保护引物DNA免于phi29DNAP活性

我们发现，通过在引物模板连接点附近结合经过修饰的DNA寡聚体， 可以保护引物DNA免于phi29DNAP的功能。Phi29结合于寡聚体5′-端， 并且用180mV施加电势将该复合体捕获在α-溶血素纳米孔上，可以除去寡 聚体，并将phi29置于引物末端，之后可以发生DNA复制。

图11a图示了典型的寡核苷酸与靶DNA的结合；‘X’代表无碱基核苷酸， ‘S’代表C3(CPG)间隔物。图11b图示了不存在dNTP和Mg²⁺(上面部分)或 存在dNTP和Mg²⁺(下面部分)时明显不同的信号电流。

实施例XIV：使用登记寡聚体(Registry Oligomer)控制Phi29DNAP沿 着ss-DNA底物的结合位置

我们发现，phi29DNAP能够结合并沿着ss-DNA移动。我们使用登记寡 聚体——一种经过修饰的DNA寡聚体——控制phi29DNAP在ss-DNA上何 处结合并坐落。使用180mV施加电势将这些DNAP-DNA复合体捕获在α- 溶血素纳米孔上可以除去寡聚体，并允许s-DNA转位通过phi29DNAP和α- 溶血素。

图12a图示了典型的登记寡核苷酸与靶DNA的结合；‘X’代表无碱基核 苷酸。图12b图示了当存在phi29DNAP时作用于α-溶血素纳米孔上的多核 苷酸复合体的典型循环。

实施例XV：保护模板3′端免于消化

我们发现，具有3′-5′核酸外切酶的DNA聚合酶能够消化模板DNA的 3′端。该方法使用引物DNA5′端保护模板3′端免于被DNA聚合酶(DNAP) 消化。

图13A显示了在α-溶血素纳米孔处使用phi29DNAP的典型结果。图 13B显示，该方法可以用于ss-DNA和封闭寡聚体(i)，ss-DNA和具有第二引 物结合的封闭寡聚体(ii)，和自身形成发夹环的ss-DNA(iii)，进一步显示多 核苷酸的长度可以长达48kb，这是本发明的另一个优点。

实施例XVI：使用稀的dNTP底物比例在纳米孔上进行DNA聚合酶指 导的DNA测序

在本实验中，我们使用酶指导的DNA合成对经过修饰的DNA模板的 短(～20聚体)片段通过纳米孔进行了测序。这里，我们用180mV施加电压将 被phi29DNAP结合的引物/模板(p/t)DNA捕获在纳米孔上(图14a,ii)。通过 结合于引物/模板连接点附近的经修饰DNA链（红色）保护引物链免于酶指 导的DNA合成。模板链具有5个无碱基残基（红色圆圈），在它们穿过纳米 孔时发挥报告链移动的报告者的作用，。

DNA-酶复合体的捕获将通过纳米孔的离子电流从60pA减小到～24pA (图14a-b,ii)。施加电压使模板缓慢地向前步进通过纳米孔，去除经修饰的链 并激活p/t DNA以供合成。这被模板中的5个无碱基残基（红色圆圈）穿过 纳米孔时电流中的35pA峰所报告（图14a-b,ii-iv)。然后DNA合成启动， 其以更快的速度将模板沿着相反的方向步进通过纳米孔，导致再次出现35 pA的离子电流峰(图14a-b,iv-vi)。在添加25个核苷酸后，当5个无碱基残 基进入酶活性位点时，DNA合成停止。

随着DNA模板将25个碱基步移向前然后返回通过纳米孔，报告了33 个离散的离子电流振幅（描点于图14c中）。这些振幅围绕指示DNA合成开 始的25pA中点（箭头，位置0）对称分布。DNA合成速度，在位置0-16 报告，可以通过反应中dNTP底物的浓度加以条件。例如，当[dNTP]=100μM 时，大约每20毫秒向引物链添加一个dNTP，当[dNTP]=1μM时，大约每 2秒添加一个dNTP，反应时间相差100倍。

当向纳米孔反应添加100nM的一种dNTP(例如dTTP)和100μM所有 其它dNTP(dATP,dCTP和dGTP)时，添加每个dTTP的时间大约比任何其它 dNTP的添加长1,000倍。因此，报告的离子电流信号会停止在图14c的每 个位置0-16处(其指示dTTP向引物链的添加)。当进行一系列4个实验时， 其中在每个实验中独特的一种dNTP是稀的，就可以分辨添加到模板链上的 一系列dNTP，由此可以对未知的模板DNA进行测序。

图14d-g总结了一系列4个实验的结果，其中向纳米孔反应中添加了100 nM的dTTP(图14d),dCTP(图14e),dGTP(Fig,14f)或dATP(图14g)以及各 100mM的其它三种dNTP。在添加每种稀释dNTP期间，报告离子电流或者 停止在稳定的位置，或者在两个位置之间波动。在电流在两个位置之间波动 的情况下，将第二个位置标记为停止位置。使用这个标准，我们能够通过阅 读停止的序列重建模板DNA序列，0=C.0-1(1)=T,1-2(2)=A,和2=T,2-3 (3)=C,和3=A,3-4(4)=C和4=T,4-5(5)=C,5-6(6)=T,6-7(7)=A,7-8 (8)=G,8-9(9)=C,10=T,10-11(11)=A,11-12(12)=C,12-13(13)=T,14 =A,14-15(15)=C。总之，模板序列被重建为 CTATCACTCTAGACT*ACT*AC。两个dT（在这里用星号标记）没有被检 测，因为这些位置的报告振幅与序列中先前dT的振幅相同。这些数据显示， 我们能够精确测序经过修饰的模板链中的短DNA插入。

实施例XVII：纳米孔上电压激活的DNA向前和向后步移

图15b图示了被设计来与phi29DNAP一起使用的封闭寡聚体的特征。 DNA底物是一种23聚体引物，其与合成的79聚体DNA模板退火。为了保 护体相中DNA引物免于phi29DNAP依赖的延伸和消化，将封闭寡聚体立 即退火到DNA引物/模板连接点附近。每个封闭寡聚体包括与模板链互补的 ～25nt(图15b(i))。在一个实例中(图15b(ii))，封闭寡聚体的5′核苷酸与引物 的3′端邻接，形成缺口(nick)。在另一个实例中(图15b(iii))，两个吖啶残基 附着在封闭寡聚体的5′端。这些吖啶中的一个取代核苷酸，并与引物3′端邻 接；另一个是添加的5′-突出(overhang)，其被认为会插入到引物链内。每个 封闭寡聚体均附加有一个3′-C3间隔物(S)，随后是7个无碱基残基（显示为 ‘Xs’）。该附加的片段具有两种功能：保护封闭寡聚体免于被phi29DNAP核 酸外切；和当DNA/phi29DNAP复合体被施加电压拉入纳米孔时，方便封闭 寡聚体的除去。

图15c图示了使用这些封闭寡聚体对DNA引物的保护。DNA底物在23 °C的纳米孔缓冲液(+10mM Mg²⁺)中温育5个小时。随后通过聚丙烯酰胺凝 胶电泳对产物进行分析。在没有封闭寡聚体时，phi29DNAP消化DNA引物 链(-dNTP,泳道3)或延伸它们(+dNTP,泳道4)。相反，当通过任一种封闭寡 聚体构建体进行保护时，引物链既没有被phi29DNAP消化(-dNTP,泳道6 和9),也没有被延伸(+dNTP,泳道7和10)。

我们的下一个目标是从被捕获在纳米孔上的每DNA模板上除去封闭寡 聚体。我们最初考虑了一种已经证实的策略，其中使用主动电压控制将封闭 寡聚体从DNA模板解下，随后通过电压极性反转驱动新暴露的DNA引物- 模板连接进入顺室，并“钓取”聚合酶。然而我们发现，主动控制对于本应用 而言不是必需的：当向纳米孔浴中添加phi29DNAP时，它与体相中的DNA 底物形成稳定的复合体，但是由于封闭寡聚体的存在，其不能被酶修饰（图 19）。

我们利用这个发现预先结合，随后在纳米孔处激活DNA底物，然后测 量各个与聚合酶结合的DNA模板的伴随复制（图16）。我们使用的DNA底 物为79聚体模板，在相对于n=0位置的位置+25至+29处带有5个无碱基残 基（图16a）。该无碱基插入物在链移动通过α–HL孔期间发挥离子电流报告 者的作用。将该DNA模板与一个23聚体引物退火，该引物的3′端被上述的 封闭寡聚体之一保护（图15b(iii)）。

图16b显示了来自代表性实验中200个复制事件的典型离子电流轨迹。 DNA模板的捕获(图16b(i))导致一个23-24pA离子电流，其持续数秒(图 16b(ii))。随后，在持续的180mV负载下，该离子电流逐步通过一系列离散 的离子电流水平，穿越35pA的最大值(图16b(iii))，之后下降到22pA，并 稳定在典型的25pA振幅处(图16b(iv))。当到达25pA振幅时，离子电流反 转方向并返回35pA峰(图16b(v))，其速度大约是第一次峰穿越速度的10倍， 然后停止于24pA(图16b(vi))。

我们解释该模式的模型包括图16c中图解的5个连续阶段：i)开放通道； ii)纳米孔捕获与封闭寡聚体结合的聚合酶-DNA复合体；iii)通过施加电压使 封闭寡聚体机械解链，并使DNA模板步进通过纳米孔。这在无碱基插入通 过主孔缢痕(constriction)时产生第一个35pA电流；iv)释放封闭寡聚体，从 而暴露phi29DNAP催化位点内的DNA引物的脱氧核糖末端；v)通过phi29 DNAP进行DNA复制，其使模板沿着相反方向步进通过纳米孔，产生第二 个35pA电流峰；vi)当模板链的无碱基残基到达phi29DNAP催化位点时， DNA复制停止。

该模型做出了两个预测。第一，因为穿越第二个35pA离子电流峰需要 DNA复制，所以该过程在没有关键dNTP底物时应当会停止。附件中描述 了与这一预测一致的结果（图18）。第二，我们的模型预测，进行通过假定 复制依赖性的峰应当会受到DNA引物末端组成的影响。尤其是，用2′,3′- 二脱氧胞苷单磷酸(ddCMP)引物末端代替2′-脱氧胞苷单磷酸(dCMP)引物末 端会延迟第二个35pA电流峰的出现。这个预测也被证明是正确的（图16d）。 使用ddCMP修饰的引物，与对照中一样，第35pA峰由于封闭寡聚体的机 械解链而被穿越，但是离子电流随后在25pA停止数秒钟（箭头，位置0）。 最后，观察到第二个35pA峰的穿越。该延迟和恢复是由于末端ddCMP被 phi29DNAP核酸外切酶除去，随后在dGMP核苷酸相邻的新暴露的3′-OH 处开始链延伸。

从这些实验，我们推断，phi29DNAP能够用于控制单个DNA模板以单 个核苷酸的精度向前和向后步进通过α-HL孔。然而，对于纳米孔DNA测序， 需要确定这一控制过程的误差率。换言之，当单个DNA分子步进通过孔时， 由于倒滑(backsliding)（对相同核苷酸位置检查超过1次）或由于向前跳跃（遗 漏核苷酸位置）导致的不能登记正确核苷酸的概率如何？为了解决这个问 题，我们使用一个标准振幅图来检测早前总结的200个转位事件的精度（图 16）。该标准是这样建立的：首先从X个随机选取的轨迹构建组成电流振幅 系列（图17a,b）。解析了33个可重复的振幅，其围绕25pA中点(位置0)对 称。当纳米孔缓冲液中一次将一种dNTP底物降低到100nM而所有其它 dNTP保持在200uM时，通过测量催化期间的电流振幅暂停，对该图谱的精 度进行独立的确认（图18）。这些实验的结果总结在图17b中，其中字母G、 A、T和C指示phi29DNAP聚合酶催化结构域中的DNA模板碱基，其中暂 停与给定的离子电流水平相关。在一些实例中，多于一个字母被指定给同一 个振幅，这是因为顺序的模板位置给出了相同的离子电流值。因此，所有25 个模板核苷酸位置均在组成图谱的催化驱动侧的16种离子电流振幅中得到 了反映。

我们接着确定在其它190个DNA模板来回穿越α-HL孔时，每个标准振 幅位置被跳过或重复的频率（图18c）。在该分析中，我们使用3ms作为我 们的最小持续时间截止限（cutoff）。当前后两个方向均同时被考虑时，它也 可以有效地计算对每个捕获链产生核苷酸登记误差的概率。因此，图18d显 示了离子电流系列中遗漏或重复两个相应位置（例如位置-15和15）的频率。 平均而言，分别有5%和2%的机会遗漏或重复两个相应振幅。

最后，我们修饰了封闭寡聚体以提高通量。这是通过将封闭寡聚体的结 合序列从25个核苷酸减少到15个核苷酸实现的（见图19），其在体相中提 供了同等的p/t DNA保护（见图19），并允许更快地在纳米孔上除去封闭寡 聚体，从而激活p/t DNA。使用这种优化的封闭寡聚体，在单个纳米孔上通 过3.8小时的实验处理了总共500个分子（～130个DNA模板/小时）。

实施例XVIII：其它酶研究

FPGA/FSM纳米孔系统还可用于其它的酶研究。在捕获DNA/酶复合体 时施加电压斜坡(voltage ramps)，能够产生数据，使用电压力谱计算键能景 观图(bond energy landscape)。另外，DNA与孔的相互作用能够用施加电压的 反馈控制加以表征。酶催化的调节可以通过向占据孔的DNA施加拉力，抵 消酶的持续进行力，来实现。

实施例XIX：基因组DNA的分离

通过肺导管从患者收集血液样品（2-3ml）并在含EDTA的试管中保存 于-80°C，直至使用。使用DNA分离试剂盒按照制造商的使用说明 (PUREGENE,Gentra Systems,Minneapolis MN)从血液样品提取基因组 DNA。DNA纯度用Beckman分光光度计测量260与280nm下吸光度的比 值(1cm光程;A₂₆₀/A₂₈₀)来确定。

实施例XX：SNP鉴定

使用针对该区设计的引物通过PCR从患者DNA样品扩增基因区。PCR 产物用上面所述的方法进行测序。在序列轨迹中鉴定的SNP用 Phred/Phrap/Consed软件加以确认，并与NCBI SNP数据库中保存的已知SNP 进行比较。

实施例XXI：cDNA文库构建

使用从哺乳动物组织分离的RNA构建cDNA文库。使用POLYTRON 匀浆机(Brinkmann Instruments,Westbury N.J.)在异硫氰酸胍溶液中将冷冻组 织匀浆和裂解。裂解物在5.7M CsCl保护垫(5.7M CsCl)上在L8-70M超速 离心机(Beckman Coulter,Fullerton Calif.)中使用SW28转子在室温下以 25,000rpm离心18个小时。RNA用pH4.7酸性苯酚抽提，用0.3M醋酸钠 和2.5倍体积乙醇沉淀，重悬浮在无RNA酶水中，并在37°C用DNA酶处 理，如前所述重复RNA提取和沉淀。mRNA用OLIGOTEX试剂盒(Qiagen, Chatsworth Calif.)分离，并用于构建cDNA文库。

在SUPERSCRIPT质粒系统(Invitrogen)中根据推荐的操作流程对mRNA 进行处理。cDNA在SEPHAROSE CL4B柱(APB)上进行分离，将超过400bp 的cDNA连接在表达质粒中。随后将质粒转化进入DH5α感受态细胞 (Invitrogen)。

实施例XXII：探针标记和杂交分析

从生物来源分离核酸，并用作其中一种如下方法的标准杂交规程的底 物。靶核酸混合物，其是基因组DNA的限制性消化物，通过在1x TAE[Tris- 乙酸-乙二胺四乙酸(EDTA)]电泳缓冲液中电泳通过0.7%琼脂糖凝胶进行分 离，并使用20x咸柠檬酸钠(SSC)通过毛细管转移将其转移到尼龙膜上。或 者，靶核苷酸单独地与载体连接并插入到细菌宿主细胞，从而形成文库。靶 核苷酸通过如下之一的方法排列在基底(substrate)上。在第方法中，含有单个 克隆的细菌细胞被机器人拾取并排列在尼龙膜上。将膜置于细菌生长培养基 上，含有羧苄青霉素的LB琼脂，并在37°C温育16个小时。将细菌克隆变 性、中和、并用蛋白激酶K消化。在STRATALINKER UV-交联剂(Stratagene) 中将尼龙膜暴露于UV辐射，使DNA与膜交联。

在第二个方法中，使用与插入物两侧载体序列互补的引物通过30个循 环PCR从细菌载体扩增靶核酸。扩增的靶核酸用SEPHACRYL-400球珠 (Amersham Pharmacia Biotech)纯化。纯化的靶核酸被机器人排列到玻璃显微 片(Corning Science Products,Corning NY)上。滑片先前用0.05%氨丙基硅烷 (aminopropyl silane)(Sigma-Aldrich,St.Louis Mo.)涂布，并在110°C处理。 在STRATALINKER UV-交联剂(Stratagene)中将排列的玻璃滑片（微阵列） 暴露于UV辐射。

cDNA探针从mRNA模板制成。5微克mRNA与1μg随机引物(Life  Technologies)混合，在70°C温育10分钟，并冻干。将冻干的样品重悬浮在 50μl含有dNTP混合物,[α-³²P]dCTP,二巯基乙醇和MMLV逆转录酶 (Stratagene)的1x第一链缓冲液(cDNA合成系统;Life Technologies)中，在42° C温育1-2个小时。温育后，探针用42μl dH₂O稀释，加热到95°C3分钟， 并在冰上冷却。探针中的mRNA通过碱降解加以除去。将探针中和，并用 PROBEQUANT G-50微柱(Amersham Pharmacia Biotech)除去降解的mRNA 和未合并的核苷酸。探针可以用荧光标记物，Cy3-dCTP或Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech)，取代放射性核苷酸[³²P]dCTP进行标记。

杂交在含有0.5M磷酸钠(pH7.2),7%SDS,和1mM EDTA的杂交缓冲 液中在65°C下进行。底物在杂交缓冲液中于65°C温育至少2个小时后， 缓冲液用10ml含有探针的新鲜缓冲液代替。在65°C温育18小时后，除去 杂交缓冲液，随后在65°C在强度递增的条件下清洗底物，最高达40mM磷 酸钠、1%SDS、1mM EDTA。为了检测由杂交在膜上的放射性标记探针产 生的信号，将底物暴露于PHOSPHORIMAGER盒(Amersham Pharmacia  Biotech)，并用IMAGEQUANT数据分析软件(Amersham Pharmacia Biotech) 对图像进行分析。为了检测由杂交在微阵列上的荧光探针产生的信号，用激 光共聚焦显微镜对底物进行检查，收集图像，并用基因表达分析软件进行分 析。

实施例XXIII：互补多核苷酸

使用与多核苷酸或其片段互补的分子检测、降低或抑制基因表达。尽管 描述的是使用包含大约15-大约30个碱基对的寡核苷酸，但是相同的程序可 以用于更大或更小的片段或其衍生物（例如肽核酸,PNAs)。寡核苷酸用 OLIGO4.06引物分析软件(National Biosciences)和SEQ ID NOs:1-163进行设 计。为了通过阻止转录因子与启动子结合而抑制转录，设计互补寡核苷酸与 最独特的5'序列结合，最优选地位于开放阅读框起始密码子之前大约500-10 个核苷酸之间。为了抑制翻译，设计阻止核糖体与编码哺乳动物蛋白质的 mRNA结合的互补寡核苷酸。

实施例XXIV：特异抗体的生产

使用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化包含多核苷酸与结合蛋白的复合体的偶 联物，并用于免疫小鼠或家兔。使用下面的规程生产抗体。在完全弗氏佐剂 中用复合体免疫家兔。之后在不完全弗氏佐剂中以一定间隔重复免疫。对于 小鼠最少7周，对于家兔最少12周后，抽取抗血清，并检测抗肽活性。检 测涉及将肽结合于塑料制品(plastic)，用1%牛血清白蛋白封闭，与兔抗血清 反应，清洗，与放射性碘标记的羊抗兔IgG反应。使用本领域众所周知的方 法确定抗体滴度和复合体形成量。

实施例XXV：筛选与多核苷酸或蛋白偶联物特异结合的分子

多核苷酸或其片段分别用³²P-dCTP,Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Amersham  Pharmacia Biotech)或用BIODIPY或FITC(Molecular Probes,Eugene OR)标 记。类似地，包含多核苷酸及其结合蛋白的复合体的偶联物可以用放射性核 苷酸或荧光探针标记。将先前排列在基底上的候选分子或化合物文库在标记 多核苷酸或蛋白的存在下进行温育。在用于多核苷酸或氨基酸分子的条件下 温育之后，清洗基底，并分析基底上任何保留标签(其指示特异结合或复合 体形成)的位置，并鉴定配体。将使用不同浓度多核苷酸或蛋白获得的数据 用于计算标记多核苷酸或蛋白与结合分子之间的亲和力。

本领域的技术人员会意识到，在不背离本发明范围和精神的前提下可以 构想出对上文描述的实施例的各种修改和修饰。根据在这里描述的本发明说 明书，本领域的技术人员能够在多种多样的具体的形式中采用本领域中已知 的其它合适技术和方法。因此，应当理解，本发明可以用与这里的具体描述 不同的方式来实施。

上面的说明书意图举例说明，而没有限制性。在回顾上面的说明时，本 领域的技术人员能够明了许多其它的实施方案。因此，本发明的范围应当参 考随附的权利要求，以及与这些权利要求所提出的等同的全部范围加以确 定。