Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用

摘要

本发明公开一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白（rLj-112）可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成，从而破坏了真菌细胞的完整性，使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解，从而杀死真菌，即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用，发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白（r Lj-112）的新用途，尤其是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。

背景技术

自发现第一个抗真菌抗生素灰黄霉素以来，抗真菌药物领域已取得了长足的进展。现有抗真菌药物根据作用机制可分为：①作用于真菌细胞膜，干扰真菌细胞膜麦角固醇的合成（如唑类、丙烯胺类和吗啉类）以及损害细胞膜脂质结构及其功能的药物（如多烯类）；②影响真菌细胞壁合成的药物（如卡泊芬净）；③干扰真菌核酸合成的药物（如5-氟胞嘧啶，灰黄霉素）；④作用机制尚未明确的药物（如碘化钾等）。但是，现有药物由于存在着疗效、安全性、耐药性等问题而远远不能满足需要。

Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由118个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白。中国专利申请号为201110094370.2、名称为“类HRG的七鳃鳗Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112在抗肿瘤药物中的应用”的发明专利，公开了Lj-RGD3的三个RGD模体全缺失突变体Lj-112基因。Lj-112基因人工合成序列324bp长，其蛋白质由108个氨基酸组成，其中含有17个组氨酸残基，组氨酸所占比例为15.7%，Lj-112蛋白分子量为1.2KDa。Lj-112基因可克隆于载体，获得Lj-112重组蛋白（r Lj-112）并可在大肠杆菌等进行了高效诱导表达等。Lj-112重组蛋白（r Lj-112）具有抑制血管新生、抗肿瘤功能。但是，迄今为止并没有关于Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。

发明内容

本发明是发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白具有抑制真菌的作用，从而发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白

在制备抗真菌药物中的应用。

本发明的技术解决方案是一种Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白（rLj-112）在制备抗真菌药物中的应用。

本发明发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白（rLj-112）可阻止真菌细胞膜麦角固醇的合成，从而破坏了真菌细胞的完整性，使真菌细胞膜破坏、膜通透性增高、细胞内容物质释放、细胞破裂溶解，从而杀死真菌，即能够剂量依赖性的抑制真菌而对细菌无抑制作用，发明了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112重组蛋白在制备抗真菌药物中的应用。

附图说明

图1是rLj-112的最小杀菌浓度（MBC）及抑制率测试结果图。

图2牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性的效果图。

图3 白色念珠菌经rLj-112处理后的扫描电镜图。

具体实施方式

可按现有技术方法获得本发明发现了Lj-RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的重组蛋白（rLj-112）。

实验：

1.最小杀菌浓度（MBC）及抑菌率的测定

（1）菌液制备：将甘油保菌复苏，30℃孵育过夜（18-24h），用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正菌液浓度至1-2×10⁸CFU/ml；所述菌为白色念珠菌，AS2.2086，产品货号：BZW23170，供应商：南京康恩特有限公司。

（2）蛋白的制备：用牛肉膏蛋白胨培养基将蛋白（rLj-112）2倍依次稀释，1~8管蛋白浓度依次为90.4、45.2、22.6、11.3、5.6、2.8、1.4、0.7、0.35μM；然后在每管内加入等量上述菌液，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml。第1管至第8管蛋白浓度分别为45.2、22.6、11.3、5.6、2.8、1.4、0.7、0.35、0.175μM。

（3）阳性对照酮康唑的制备：用甲醇将酮康唑10倍依次稀释，1~5管药物浓度为94、9.4、0.94、0.094、0.0094μM。然后在每管内加入等量上述菌液，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml。第1管至第5管药物浓度分别为47、4.7、0.47、0.047、0.0047μM。

（4）孵育：将接种好的稀释管放入30℃培养箱中孵育16-24h。

（5）酶标仪检测：与阳性对照管比较能够抑制99%以上活菌生长管药物浓度为受试菌MBC；存活百分率（%）= OD _{(抗菌药+菌夜)}—OD_{(抗菌药+液体培养基)} / OD_(水+菌夜)—OD_{(水+液体培养基)}X100。

结果如图1所示：横坐标为受试蛋白或对照药浓度，单位为μM；纵坐标为真菌存活百分率（%）。A，阳性对照，酮康唑 ；B，rLj-112。结果表明rLj-112的MBC值为7.7μM，阳性对照酮康唑（ketoconazole）的MBC值为15μM。

2. 用牛津杯法检测rLj-112的抑菌活性

具体操作方法如下：

（1）指示菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，用0.1MPa压力灭菌20 min；固体培养基中加入2.0%的琼脂;

（2）指示菌菌悬液：白色念珠菌（出处同上）接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃摇床培养24h；

（3）检测平板的制备，牛肉膏蛋白胨固体培养基用0.1MPa压力灭菌20 min，5冷却至60℃左右，取一定量倒入已灭菌的培养皿中，使其凝固，待用；

（4）涂布：取0.2~0.5ml，10⁶CFU/ml白念珠菌均匀涂布在培养皿中，涂布后以平板无可见水滴为准；

（5）加待测蛋白：用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，将待测的蛋白rLj-112加入牛津杯中（牛津杯最大容量200ul）；

（6）4℃扩散：将平皿放置到4℃冰箱中扩散数小时，使待测蛋白均匀扩散到培养基中；

（7）培养：将平皿放置到30℃培养箱中培养16~024h，拍照。

所拍照片如图2所示：A，阳性对照，酮康唑 ；B，rLj-112（30μl）；C，rLj-112（60μl）； D，rLj-112（90μl）；E，rLj-112（120μl）； F，rLj-112（150μl）； G，rLj-112（180μl）； H，阴性对照，Tris。结果表明：随着rLj-112剂量的增加，牛津杯抑菌环增大，即rLj-112剂量依赖性的抑制白念珠菌的生长。

3.rLj-112处理后白色念珠菌的扫描电镜观察

（1）菌液制备：将甘油保菌（白色念珠菌，出处同上）复苏，30℃孵育过夜（18-24h），用牛肉膏蛋白胨液体培养基校正浓度至1~2×10⁸CFU/ml；

（2）孵育：将rLj-112（2.6μM）与上述菌1:1孵育16-24h；

（3）固定：用PBS（pH7.2）冲洗3次，用体积分数3%戊二醛室温下固定 2-4 h；

（4）逐级脱水：PBS（pH6.8）冲洗 2-3 次，每次间隔 20 min，后经系列乙醇（体积分数为 30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水，每次20 min， 其中100%乙醇脱水2次；

（5）干燥、黏样、镀膜后，在扫描电镜下观察。

电镜图如图3所示：A，PBS对照；B，rLj-112。用PBS处理的对照组，白念珠菌细胞形态完整，细胞膜表面光滑；而 rLj-112处理过的白念珠菌显示出了明显的细胞膜破裂，细胞内容物外渗现象。