酶辅助超声法提取蒙药瞿麦总皂苷的方法

摘要

本发明公开了一种酶辅助超声法提取蒙药瞿麦中总皂苷的方法,包括：称取瞿麦粉末，石油醚回流，过滤，干燥至无石油醚味，HAc-NaAc缓冲液浸泡，加入淀粉酶，60℃水浴加热30min，然后于水浴灭酶，放置至室温，超声处理，过滤，水饱和正丁醇萃取。

说明书

技术领域

本发明涉及药物成分提取领域，特别地，涉及瞿麦总皂苷的提取。

背景技术

瞿麦Dianthus superbus L，别名十样景花、竹节草花、山瞿麦、剪绒 花，蒙药名：高优-巴沙嘎。石竹科多年生草本植物，全草入药，性 苦、寒、辛、无毒。具有利尿通淋，破血通经。用于热淋，血淋，石 淋，小便不通，淋沥涩痛，月经闭止，是蒙医常用药之一。瞿麦皂苷 具有免疫作用，能抑制人体B细胞免疫球蛋白的分泌；还具有抑菌 杀虫作用。瞿麦的水和乙醇提取物对大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌、金 黄色葡萄球菌、枯草杆菌和变形杆菌均有抑制作用；抗脂质过氧化； 兴奋子宫；溶血作用；具有心血管药理活性，表现为提高浆膜的渗透 性、正性肌力、抗心律失常、舒张血管、降低血压、止痛、抗高胆固 醇和保护毛细血管等作用。本实验采用酶辅助超声法提取蒙药瞿麦中 总皂苷，酶能够破坏植物细胞壁，使有效成分快速溶出，而超声波产 生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提 取效率。总皂苷的测定方法有重量法,UV,TLCS,HPLC,GC-MS法。 目前对蒙药瞿麦总皂苷的工艺研究和含量测定尚未见报道

发明内容

本发明提供了一种酶辅助超声法提取蒙药瞿麦中总皂苷的方法, 具体包括步骤：称取瞿麦粉末，按重量体积比1：10加入石油醚于50℃ 水浴加热回流2h,过滤，干燥至无石油醚味，按与瞿麦粉末重量体积 比1：30（料液比）加入pH为6.0的HAc-NaAc缓冲液，浸泡30min， 按与瞿麦粉末重量比1:4(g:mg)加入淀粉酶，60℃水浴加热30min，然 后于95℃水浴灭酶10min，取出后放置至室温，超声功率180W，超声 15min，过滤，滤液用水饱和正丁醇以等体积萃取。

本发明提供了一种新的高效的瞿麦总皂苷的提取方法，同时发明 人发现，淀粉酶的用量、超声功率、时间、料液比四个因素对提取效 率有着重大的影响，因此创造性的确定了最佳的提取工艺，同时发明 人还发现，发明也发现石油醚回流、缓冲液浸泡等工艺步骤对于提取 效率也有一定的影响，也同时确定了最佳的技术参数。

附图概要说明

图1：对照品与供试品光谱叠加图

图2：标准曲线图

图3：酶用量对皂苷提取率的影响，由图3可知，当酶用量为4mg 时总皂苷含量最大，故选取2，4，6mg三个较优的水平做正交试验。

图4：料液比对总皂苷提取率的影响，由图4可知，在料液比为1:30 时，皂苷含量最大，故选取1:25，1:30，1:35三个较优的水平做正交 试验

图5：超声时间对瞿麦提取率的影响，由图5可知，在超声时间为 20min时，皂苷含量最大。故选取15，20，25min作为三个较优的水平 做正交试验。

图6：超声功率对总皂苷提取率的影响，由图6可知，超声功率 为160W时，皂苷含量最大，故选取140，160，180W作为三个较优的 水平做正交试验。

具体实施方式

实施例1

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加10mL石油醚于50℃水浴加热回 流2h,过滤，干燥至无石油醚味，将其置于锥形瓶中，加入pH为6.0 的HAc-NaAc缓冲液30mL（即料液比1:30），浸泡30min，按最佳 工艺条件加入4mg的淀粉酶，60℃水浴加热30min，然后于95℃水 浴灭酶10min，取出后放置至室温，超声功率180W，超声15min。 过滤，滤液与水饱和正丁醇以等体积萃取，萃取三次，合并滤液，挥 干，用无水乙醇洗出，定容至25mL。

实施例2，工艺优选参数的确定

1仪器与试药

TU-1901型双光束紫外分光光度计[北京普析通用有限责任公 司]；LX-07A多功能粉碎机[上海江信科技有限公司]；电热鼓风干燥 箱[上海一恒科学仪器有限公司]；AB135-分析天平[Made in Switzerland];BSA124S型电子天平[北京赛多利斯科学仪器有限公司]； 旋转蒸发仪[上海亚荣生化仪器厂]；循环水式多用真空泵[郑州长城科 工贸有限公司]；旋转蒸发仪[郑州长城科工贸有限公司]；恒温水浴锅 [上海亚荣生化仪器厂]；电子恒温不锈钢水浴锅余[姚市上通温控仪表 厂]；KH5200DE型高功率数控超声清洗器[昆山禾创超声仪器有限公 司]；PHS-25酸度计[成都世纪方舟科技有限公司]。

瞿麦[内蒙古天立药业，经内蒙古医科大学药学院药用植物教研室乔 俊缠教授鉴定为石竹科植物瞿麦Dianthus superbus L.的带花地上部 分]；薯蓣皂苷元对照品[中国药品生物制品鉴定所提供，批号： 111539-200001]；淀粉酶[江苏无锡，活性单位1万U/g]；无水乙醇； 冰乙酸；正丁醇；香草醛；高氯酸；石油醚，以上均为分析纯。

2方法

2.1对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的薯蓣皂苷元对照品5.0mg，用无水乙醇溶 解，定容至25mL，摇匀，即得200μg/mL薯蓣皂苷元对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加10mL石油醚于50℃水浴加热回流 2h,过滤，干燥至无石油醚味，将其置于锥形瓶中，加入pH为6.0的 HAc-NaAc缓冲液，浸泡30min，加入一定量的淀粉酶，60℃水浴加热 30min,然后于95℃水浴灭酶10min，取出后放置至室温，超声。过滤， 滤液与水饱和正丁醇以等体积萃取，萃取三次，合并滤液，挥干，用 无水乙醇洗出，定容至25mL。在提取工艺研究中改变相应参数。

2.3测定波长的选择

精密量取对照品和供试品溶液0.5mL于10mL具塞试管中，于 60℃水浴挥干，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8mL高氯酸于 60℃水浴加热20min，取出放置2min,加入冰醋酸定容至10mL摇匀， 放置15min,在300nm－600nm范围内做波长扫描。结果显示对照品和 供试品均在410nm有最大吸收,故选择410nm做为测定波长，结果见 图1。

2.4标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL分别置于10mL具 塞试管中，按2.3项下显色方法显色，在410nm处测定吸光度，以吸光 度为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=0.025X+0.004,r=0.9999,结果表明浓度在4.176-20.88μg/mL内与吸 光度值呈良好线性关系，结果见表1，图2。

表1回归方程表

3单因素及正交试验

3.1单因素试验

3.1.1酶用量单因素试验

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g在料液比为1:15，超声功率200W，超声 时间30min的条件下，淀粉酶用量分别取1，2，4，6，8，10mg按2.2 项下方法操作，按2.3项下显色方法显色，在410nm处测其吸光度并计 算总皂苷含量，结果见表2、图3。

表2酶用量单因素试验结果

3.1.2料液比单因素试验

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加入淀粉酶4.0mg，在超声功率200W， 超声时间30min的条件下，料液比分别为1:15，1:20，1:25，1:30，1:35， 按2.2项下方法操作，按2.3项下显色方法显色，在410nm处测其吸光 度计算总皂苷含量，结果见表3及图4。

表3料液比单因素试验结果

3.1.3超声时间单因素试验

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加入淀粉酶4.0mg，料液比1：30，超 声功率200W的条件下，超声时间分别为15，20，25，30，35min，按 2.2项下方法操作，按2.3项下显色方法显色，在410nm处测其吸光度 计算总皂苷含量，结果见表4及图5。

表4超声时间单因素试验结果

3.1.4超声功率的单因素试验

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加入淀粉酶4.0mg，料液比1：30,超声 时间20min的条件下，超声功率分别为120，140，160，180，200W， 按2.2项下方法操作，按2.3项下显色方法显色，在410nm处测其吸光 度计算总皂苷含量，结果见表5及图6。

表5超声功率单因素试验结果

3.2正交试验

根据以上单因素实验结果，采用L9(34)正交表以酶用量(A)、超声功 率(B)、超声时间(C)、料液比(D)4个因素，选取各因素较优的3个水 平，酶用量(2,4,6)mg，超声功率(140，160，180)W，超声时间(15， 20，25)min，料液比(1:25，1:30，1:35)g/mL，做正交试验，每个水平 平行做3份，取平均值，见表6，7，8。

表6酶辅助超声法正交试验因素水平表

表8正交试验结果表（2）

表9方差分析表

由表9极差分析结果可知，在影响瞿麦总皂苷提取率的四个因素 中，料液比影响最大，超声时间影响最小。其影响总皂苷的提取率大 小次序先后为D>B>A>C，即料液比>超声功率>酶用量>超声时间。最 佳工艺组合为A₂B₃C₁D₂，即酶用量4.0mg，超声功率180W，超声时间 15min，料液比1:30。

4含量测定（工艺验证性试验）

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，加10mL石油醚于50℃水浴加热回流 2h,过滤，干燥至无石油醚味，将其置于锥形瓶中，加入pH为6.0的 HAc-NaAc缓冲液30mL，浸泡30min，按最佳工艺条件加入4mg的 淀粉酶，60℃水浴加热30min，然后于95℃水浴灭酶10min，取出后 放置至室温，超声功率180W，超声15min。过滤，滤液与水饱和正 丁醇以等体积萃取，萃取三次，合并滤液，挥干，用无水乙醇洗出， 定容至25mL，精密量取供试品溶液0.2mL于10mL具塞试管中，于 60℃水浴挥干，加入0.2mL5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.8mL高氯酸 于60℃水浴加热20min，取出放置2min，加入冰醋酸定容至10mL 摇匀，放置15min，在410nm处测其吸光度，计算总皂苷含量，平行 做6份，总皂苷含量均值为2.367%，RSD为0.35%，结果见表10。

表10工艺验证性试验表

5方法学考察

5.1稳定性

精密量取供试品溶液0.2mL，按2.3项下进行显色,在410nm处每 隔15min定吸光度1次，测定3h，RSD为1.25%，表明供试品溶液 在3h内稳定性良好。结果见表11。

表11稳定性试验表

5.2精密度

精密量取同一供试液溶液6份，每份0.2mL按2.3项下进行显色, 在410nm处测定吸光度，计算总皂苷含量，RSD为0.82%，表明精 密度较好。结果见表12。

表12精密度试验表

5.3重现性

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，6份，在最佳工艺条件下按2.2项 下进行提取，分别精密量取0.2mL按2.3项下进行显色,在410nm处 测定吸光度，计算总皂苷含量，均值为2.367％，RSD为0.35%，表 明该方法重现性良好。结果见表13。

表13重现性试验表

5.4加样回收试验

精密称取蒙药瞿麦粉末1.0g，6份，分别加入80%、100%、120% 的薯蓣皂苷元对照品各2份，在最佳工艺条件下按2.2项下进行提取， 按2.3项下进行显色,在410nm处测定吸光度，计算加样回收率,平均 回收率为98.39％，RSD为0.51％，结果表明本实验的加样回收率良 好，结果见表14。

表14加样回收试验表

6工艺放大性试验

精密称取蒙药瞿麦6份，每份20g，按2.2项下的方法在最佳工 艺条件下（酶用量4.0mg，超声功率180W，超声时间15min，料液 比1:30）提取总皂苷，按2.3项下的方法显色，在410nm处测定吸光 度，由回归方程计算总皂苷含量，平均值为2.388%，RSD为0.56%， 结果表明该方法适合于放大生产，结果见表15。

表15工艺放大性试验表

7、石油醚回流、缓冲液浸泡的影响

表16最佳工艺条件下，经石油醚回流、缓冲液浸泡含量结果

表17最佳工艺条件下，未经石油醚回流、缓冲液浸泡含量结果

由以上最佳工艺条件下，经石油醚回流、缓冲液浸泡含量与未经 石油醚回流、缓冲液浸泡含量比较，前者为2.367%后者为2.184%。

8  讨论

关于石油醚，预试验证明经石油醚脱脂的蒙药瞿麦总皂苷提取率 高，可能由于石油醚可脱去含有的油脂等与皂苷无关的杂质从而影响 总皂苷提取率。故本方法操作过程增加石油醚脱脂这一步骤。关于水 饱和正丁醇萃取，由于皂苷极性介于水和正丁醇之间，较直接用正丁 醇萃取，能够减少乳化现象的发生且可更完全的将皂苷萃出，提高提 取率，故选用水饱和正丁醇。关于标准品，目前国内尚无瞿麦皂苷类 成分的标准对照品，经预试验测得其在410nm处有吸收峰，故选用薯 蓣皂苷元为对照品。关于单因素试验，我们发现提取率均会显著升高 后再降低，究其原因可能由于植物药提取过程中，细胞原生质中的有 效成分向溶媒扩散时，须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力，而酶可 破坏细胞壁，加速有效成分的溶出，但当酶用量过多时，可能会增加 其他杂质的溶出，也有可能使有效成分失活从而降低提取率。超声提 取的主要推动力是有效成分浓度差，有效成分浓度差大，扩散推动力 大，所以提取率高；若溶剂中有效成分浓度过高，扩散推动力就会变 小，反而不利于扩散，使有效成分的提取率降低。又因为料液比过大 和超声功率过高时，容易出现蒸发浓缩等问题，以及增加其他杂质的 溶出，还可能引起皂苷的热敏损失，这些都是可能导致皂苷提取率降 低的因素。