三七总皂苷的发酵辅助提取及其活性评价

摘要

三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)作为三七中主要的生理活性物质，主要由四环三萜达玛烷型人参皂苷和三七中特有的三七皂苷Ri等成分构成。由于其在血液、心脑血管系统、肿瘤抑制、免疫调节及抗衰老等各方面均有较好的功效而越来越被广泛应用到临床，其药物制剂、剂型得到不断增加和更新。其中含量甚微的单体人参皂苷Rh2、Rg3等已成为现代癌症治疗中配合化疗、增效减毒的首选药物之一。
　　 根据人参皂苷在体内的代谢规律及其构效关系可知，天然人参皂苷生物利用率低，作为“天然前药”在胃肠道中被肠道菌逐级代谢为次级苷和苷元吸收进入血液循环后发挥药理作用。构效关系也显示，天然人参皂苷分子结构并不是活性最佳状态，其生物活性依赖于配基上的侧链结构，糖链数目及其与配基结合的位置。如研究指出低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用。然而，低糖链单体皂苷Rg3、Rh2等在生药材中含量甚微，而且C-K等作为代谢产物在生药中并不是天然存在。
　　 本论文探究三七总皂苷的提取方法为其药用提供有效的获取途径，并对生药中含量较高的人参皂苷进行结构修饰，转化成低糖链稀有皂苷以提高其生物活性。采用枯草芽孢杆菌固态发酵辅助提取三七总皂苷，该方法在常规醇提工艺的基础上，增加了发酵处理步骤。通过微生物产生丰富酶系协同作用，破坏三七根组织细胞壁致密结构，使三七皂苷溶出增加，而在有效成分暴露后，糖苷酶进一步水解皂苷配基上的糖链，达到生物转化的效果，反应条件温和。
　　 在单因素实验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计对微生物发酵三七进行工艺优化，并从提取所得总皂苷含量、成分间转化及提取物抗氧化、抑菌、抗癌活性角度与常规提取法相比较。实验结果显示，在培养基质中麸皮添加量31％，料水比1:1.2，pH值7.6的条件下固态发酵三七，提取所得三七总皂苷含量比常规提取含量提高了35.36%，其中人参二醇型皂苷Rb1、Rd溶出明显增加，部分三醇型皂苷特异性转化为稀有皂苷组分Rh1、F1。同时，总皂苷及其组分含量的变化带来了活性改变，相比常规提取，活性测试显示其DPPH清除的IC50由1.226降至0.377 mg/mL，对Fe3+还原力提高；对金黄色葡萄球菌、青霉菌等的抑制活性增强；抗胃癌活性也有一定提高。实验表明，应用发酵法辅助提取三七总皂苷能使有效成分溶出增加，同时能实现成分间的生物转化，进一步提高其生物活性，相比单纯提取具有附加的价值及广阔的实际应用前景。目前未见应用微生物发酵法提取三七总皂苷的相关报道，本研究为微生物发酵辅助提取法在具生物转化特性的天然产物提取新方法中的进一步应用提供了参考。
　　 研究表明，三七总皂苷在各种心脑血管疾病的防治中发挥着重要作用，可改善心肌缺血、抗心律失常、防止动脉粥样硬化等。本研究建立体外拟缺氧模型，考察PNS对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的影响，初步探讨其对血管内皮细胞可能的作用机制。发现在PNS干预下，对比损伤模型组，药物组细胞存活率提高，MDA积累量降低，SOD活力升高，高、中剂量药物组细胞培养液中NO分泌量检测显示增加。推测在缺氧条件下，三七总皂苷以抗氧化损伤及调节内皮源性活性物质释放的途径，对HUVEC形成有效保护，维持血管内皮细胞正常生理功能，从而减少动脉粥样硬化(AS)形成的始动因素，对心血管疾病的发生发展起到一定防治作用。