p53基因突变的快速检测方法

摘要

本发明提供了一种p53基因突变的快速检测方法，本发明分别设计了p53第6号外显子（p53-E6）和第8号外显子（p53-E8）的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

背景技术：

P53基因位于人17号染色体17p13.1上，全长约20Kb，由11个外显子和10个内含子组成，其中第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8分别编码5个进化上高度保守的结构域。P53基因编码一个393个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为53KD，这也是其被命名为“P53”的原因。

野生型P53蛋白(wtP53)具有调节细胞生长的功能，多个途径抑制肿瘤的发生：

①「滞细胞周期P53蛋白通过调控下游基因P21编码蛋白，引起细胞G1期阻滞；此外，P53蛋白通过细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）、压力响应蛋白（CADD45）和14-3-3σ三个下游基因，将细胞周期阻滞在G2/M期。

②「促进细胞凋亡；P53蛋白可以上调B-细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）的表达并下调B-细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达，介导细胞色素C的释放，促进细胞凋亡；此外，P53蛋白可以通过肿瘤坏死因子（TNF）受体和死亡相关因子（factor associated suicide,Fas）蛋白等死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡。

③「维持基因组稳定P53可参与DNA的修复过程，其DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸，结合并调节核苷酸内切修复因子着色性干皮病B基因(XPB)和(着色性干皮病D基因)XPD的活性，影响其DNA重组和修复功能。

④「抑制肿瘤血管生成P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4(drosophila mothers against decapentaplegic protein)等表达，抑制肿瘤血管形成。P53蛋白通过多途径来抑制肿瘤的发生与发展，在肿瘤抑制上发挥及其重要的作用。

P53突变的类型包括基因片段缺失、插入、点突变引起的错义突变以及杂合性缺失。但是在所有P53突变形式中,占主导地位的还是因点突变引起的错义突变,其比例约占总体的80％。而在这些P53错义突变中,发生在DNA结合域（DNA binding doma in,DBD区）的点突变比例高达97％。这些突变中，以下6个位点的突变在肿瘤中高频率出现。与肿瘤进程密切相关的，被称为热点突变，分别是：R175、G245、R248、R249、R273和R282（图1）[1]。这些突变型P53蛋白（mutP53）的功能发生了逆转式的改变。一方面，mutP53丧失了原有的细胞周期阻滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因组稳定和错配DNA修复等抑癌功能。同时，mutP53在肿瘤发生与转移中发挥重要作用[2]。另一方面，mutP53获得了癌基因特性[3]。mutP53通过调节其表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、禽类髓细胞病毒癌基因（c-myc）等下游靶基因，参与到肿瘤的物质代谢、生长调节、血管生成以及耐药性的增强中。并与p63、p73等发生可能性结合，损害p63和p73介导的转录活化和凋亡的执行，削弱了p63和p73的抑癌功能。此外，mutP53干扰MRN-ATM通路的信号转导，衰减转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路的信号转导，促进肿瘤的发生。

P53基因的这些位点的突变与大部分肿瘤的发生相关，包括肺癌、卵巢癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、骨肉癌、白血病、乳腺癌和食管癌等，这些位点上的突变是细胞恶性转化及可能的肿瘤产生的预兆，应引起高度重视。因此，关于P53基因的这些位点的突变的检测有着非常重要的作用。

众所周知，高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异（SNPs,mutations)。SYBR  Green I对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。

与此同时，罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：1、饱和染料毒性低；2、浓度可以使DNA达到饱和；3、降低了染料位置重组的可能。而，PCR（Polymerase Chain Reaction）产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求:仪器:高分辨率高、均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响；试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线；软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件。罗氏荧光定量PCR系统LghtCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。LightCycler Nano System是LightCycler 480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实p53基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

为了解决以上问题，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.

高Tm G：C>A：T>G：G>G：T=G：A＞T:T=A：A>T:C>A：C>C：C 低Tm

纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。

杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.

即，为解决上述技术问题，本发明提供了一种p53基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：

在p53基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物以两个突变片段为模板进行PCR扩增，得到突变型模板，，扩增对应的突变型模板；

不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。

所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量.

所述高Tm G：C>A：T>G：G>G：T=G：A＞T:T=A：A>T:C>A：C>C：C 低Tm。

所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.

所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。

分别设计了p53第6号外显子（p53-E6）和第8号外显子（p53-E8）的野生型引物和突变型引物。

所述的一种p53基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统-LightCycler Nano仪器中进行程序性检测；结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟；40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。

所述p53-E6突变型模板的获取包括：

利用带有突变位点的突变引物获得突变位点前后两段突变片段；

将这两段突变片段连接起来，构成p53-E6突变型模板。

所述野生型模板的获取包括：以已知未突变基因组为模板，p53-E6 F+p53-E6R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型模板；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

本发明的有益效果是：本发明分别设计了p53第6号外显子（p53-E6）和第8号外显子（p53-E8）的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法（HRM法）；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

附图说明：

图1为本发明P53蛋白功能域及热点突变位点示意图；

图2为用野生型引物检测p53第6号外显子（p53-E6）1/10、1/100、1/1000突变型和野生型模板的HRM图；

图3为用野生型引物检测p53第6号外显子（p53-E8）1/10、1/100、1/1000突变型和野生型模板的HRM图；

具体实施方式：

本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

如图1-3所示，本发明分别设计了p53第6号外显子（p53-E6）和第8号外显子（p53-E8）的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。下面以p53-E6为例，说明具体的操作。

1、样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。

2、DNA提取：取200μL抗凝血用QI Amp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。

3、qPCR-HRM检测的体系：

1)对照的设立和检测重复孔

每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突变/野生=1％)阳性对照。对照和样本均采用复孔。

2)10μL反应体系构成（引物序列见附表）

3)在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀，盖上八连管盖子。

4)所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统-LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。

4、qPCR-HRM检测的程序：

1)95℃变性10分钟；

2)95℃变性10秒钟；

3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；

4)72℃延伸30秒钟；

5)重复第2步到第四步45个循环;

6)95℃变性60秒钟；

7)40℃变性60秒钟；

8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。

5、结果分析：

1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。

2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样

品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。

3)结果判定

在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型(如图2、图3)。

4)获取结果图。

6、野生型目的片段的获取：

以已知未突变基因组为模板，p53-E6 F+p53-E6 R为引物进行实验，参照步骤3及步骤4的反应体系及程序，获得条带单一的特异性野生型目的片段。

将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

7、p53-E6突变型目的片段的获取：

突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物（p53-E6 L194F F,p53-E6 L194F R）获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成p53-E6突变型目的片段。

1)突变第一步PCR

以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以p53-E6 F+p53-E6 L194F R，p53-E6 L194F F+p53-E6 R为引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤3及步骤4，获得两个条带单一的片段。

2)突变第一步产物稀释

将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL。

3)突变第二步PCR

以稀释后的第一步两段产物为模板，以p53-E6 F+p53-E6 R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤3及步骤4，获得条带单一的片段。

4)突变第二步产物稀释

将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL。

8、M/W＝1/10、1/100、1/1000阳性对照模板的获取：

混合9μL野生型模板和1μL突变型模板，配制10μL突变型/野生型（M/W)=1/10的混合模板，作为检测用1/10阳性对照模板；将此模板用野生型模板作10倍稀释，分别获得突变型/野生型（M/W)=1/100、1/1000的混合模板，作为检测用1/100、1/1000阳性对照模板。

9、结果分析：

通过HRM方法，我们能区分含1/1000突变型的模板，证明了这个方法的高特异性和高灵敏度，而且，整个操作时间只需要1小时。

附表：p53-E6 L194F、p53-E8 R273H检测引物序列

  引物  引物序列（5’-3’）  p53-E6 F  GAGAGACGACAGGGCTGGTTG  p53-E6 R  CAGTTGCAAACCAGACCTCAG  p53-E6 L194F F  CTCCTCAGCATTTTATCCGAGTG  p53-E6 L194F R  CACTCGGATAAAATGCTGAGGAG  p53-E8 F  GACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTG  p53-E8 R  AATCTGAGGCATAACTGCACCCTT  p53-E8 R273H F  GCTTTGAGGTGCATGTTTGTGCCTG  p53-E8 R273H R  CAGGCACAAACATGCACCTCAAAGC

与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！

上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一致的最宽泛的范围。