FASAY技术在肝癌p53基因突变检测中的应用及其对p53基因突变体显性抑制效应的研究

摘要

1.FASAY技术在肝癌p53基因突变检测中的应用 肝癌是世界第六大最常见的癌症，但由于预后不良肝癌造成的死亡人数在所有癌症中排第三，中国是肝癌发病率和死亡率最高的国家，占全世界的一半以上。我们希望通过酵母中分离的等位基因功能分析技术(functionalanalysisofseparatedalleiesinyeast，FASAY)检测中国人肝癌中p53基因的突变，研究p53蛋白功能状态对肝癌发病和预后的影响。通过FASAY技术，我们从63对原发性肝细胞癌(HCC)组织样品中检测到了39例p53基因突变。测序分析表明19例249位密码子发生了突变，包括一例在249位密码子上从来没有报道过的双点突变746.747GG一>CT，它造成Arg变成了Thr；另外，我们还检测到了一些以前没有在肝癌中报导的新突变，包括三例移码突变和两例缺失突变．结合临床病理资料分析，63例HCC中p53基因的突变情况和患者的年龄(P=0．309)，肿瘤大小(P=0．269)，肿瘤的分化程度(P=0．359)，病理分期pTNM(P=0．194)无统计学上的相关性。但是我们注意到在8例肿瘤直径小于2cm的肿瘤中，7例检测到p53基因的突变，6例都是249位密码子突变为Ser．249'~r突变型和肿瘤的大小分期呈显著相关性，分别是P=0．024和P=0．004，但和肿瘤的分化程度和患者年龄没有统计学上的相关性，分别是P=0．734和P=O．144。由于在黄曲霉素污染的地区，黄曲霉素导致249-~r突变是肝癌发生的重要因素，我们的研究结果提示了对在黄曲霉素污染较严重地区的人群抽取血样做249位密码子突变检测可能对早期诊断和治疗肝癌有着重要的临床意义。 2.基于FASAY技术的p53突变体显性抑制效应的研究 为了检测突变的p53蛋白对野生型p53蛋白是否有显性抑制效应，我们根据Inga．A的方法改进了基于ADE2报告系统的FASAY检测方法，并检测了在第一部分实验中得到的所有p53突变体。首先这些突变体的突变位点都是位于p53蛋白核心结构域上的。实验结果表明所有的无义突变都是没有显性抑制效应的，说明缺乏p53蛋白形成四聚体的结构域的突变体不会影响野生型p53蛋白的转录功能。并且我们发现不同的缺失突变抑制表型不一样：缺失了L3环上5个氨基酸的突变体对野生型有抑制效应，而缺失了整个S1片层链和U环总共25个氨基酸的突变体没有抑制效应。由于野生型的p53蛋白是热动力学稳定性很低，位于主架结构beta片层链上的突变往往会造成整个p53蛋白的不能正确折叠甚至不能折叠，很可能是这25个氨基酸的缺失突变造成了蛋白的不能正确折叠，可能使它不能和野生型的蛋白形成四聚体，所以没有产生显性抑制效应。进一步，我们分析了第一部分实验中得到的所有错义突变，发现所有位于大loopL3和LSHmotif上的突变都有显性抑制效应，而位于beta片层链和连接beta片层链间的小loop上的突变都不具有抑制效应，这个实验结果和Inga等的报道一致。但是我们对造成隐性表型的原因有不同的看法，我们认为是因为在beta片层链上的突变可能使p53蛋白的不能正确折叠，从而不能参与四聚体的形成，才使野生型p53蛋白转录激活功能不受影响。而Inga的模型认为除失去形成四聚体结构域的突变体外，其它所有类型的突变体都可以参与了四聚体的形成，当缺陷型的P53蛋白转录激活功能被野生型蛋白能够弥补时就为隐性突变(recessivemutant)，当不能弥补时就为显性突变(dominantmutant)。Inga的模型可以很好的解释位于连接beta片层链间的小loop环上的突变。这些突变位点上的氨基酸既不直接参与形成主架结构，也不是位于p53蛋白和DNA相互作用的表面，它们的突变可能对P53蛋白整个的结构和DNA相结合的影响很小，所以功能上的缺陷可以被野生型的p53蛋白弥补。虽然从细胞的水平上看这两种类型的突变都是没有显性的抑制表型，但是前一种类型的隐性突变可能比后一种类型的隐性突变在肿瘤发生的过程中有更重要的作用，因为它们的功能缺陷不能被野生型p53蛋白弥补，可能也更不易被P53蛋白的E3泛素连接酶MDM2，COPl，Pirh2等识别和降解而在肿瘤细胞内聚集。

目录

第一部分FASAY技术在肝癌p53基因突变检测中的应用

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果与讨论

3结果

4讨论

结论

参考文献

第二部分FASAY技术对p53突变体显性抑制效应的研究

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果与讨论

3结果

2讨论

第二部分小结

参考文献

Abbreviation

附表

致谢