一种川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法

摘要

本发明涉及一种川楝子药材及其提取物中柠檬苦素类成分的检测方法，包括1-去乙酰基尼泊里宁B的定量分析，以及尼泊里宁A、尼泊里宁B、川楝里宁和川楝素中的一个或多个成分定性定量分析。具体包括采用1-去乙酰基尼泊里宁B及其他该类成分对照品，采用高效液相一蒸发光散射检测器进行1-去乙酰基尼泊里宁B定量分析以及其他各成分定性定量分析；进行薄层鉴别；采用显色法测定总三萜类含量。本发明以1-去乙酰基尼泊里宁B及其同类成分为对照品，首次系统建立了尼泊里宁类成分定性定量分析方法，该法科学合理、简便易行，适用于川楝子药材和炮制品，以及同属植物果实提取物中尼泊里宁型柠檬苦素类成分的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法，本发明同时涉及所述检测 方法在川楝子及同属植物果实提取物质量控制方面的应用。

技术背景

川楝子为楝科植物川楝(Melia toosendan Sied.Et Zucc.)的成熟果实，是一味传统中药， 功能舒肝行气、止痛、驱虫，用于胸胁、脘腹胀痛，疝痛，虫积腹痛等证有近二千年的用药 历史，为中国历版药典收载。川楝子有小毒，需炮制后使用；其炮制方法包括炒、蒸、炮、 煅、烧等，主流品种是清炒法。现代研究结果表明，川楝子提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎、 镇痛、杀虫等多种药理活性。柠檬苦素类成分是楝属(Melia)植物中的主要药理活性成分， 该类成分为多氧取代的复杂三萜类成分，母核结构多变，不同植物品种和同一植物不同部位 之间均存在较大差别。近年来，通过对川楝子及同属植物苦楝子(Melia azedarach Linn.)、 Melia volkensin果实的化学成分进行研究，从中发现了一些特征性的尼泊里宁(nimbolinin) 型柠檬苦素类成分，该类成分一般存在于楝属植物果实中，具有较强的科属和部位特异性。

川楝子现有分析方法一般均以川楝素为对照品进行含量测定，并采用分光光度法测定总 萜含量[6]。在中国药典2010年版中，制定了采用HPLC/MS方法测定川楝子中川楝素的标准。 但对尼泊里宁类成分在楝属植物果实提取物中的存在形式和含量分析，目前未见相关研究。 为更全面地分析和控制川楝子质量，发明人对川楝子的化学成分进行了研究，从中分离鉴定 了尼泊里宁A、尼泊里宁B、1-去乙酰基尼泊里宁B和川楝里宁等4个主要的尼泊里宁类成分(刘 江云等，一种川楝子提取物及其用途，中国专利申请号201210524604.7)。本发明在此基础上， 进一步研究制定该类成分的分析和质控方法，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法。

本发明的又一目的是提供一种所述检测方法在川楝子提取物、同属植物果实提取物及其 组合提取物质量控制方面的应用。

本发明提供的川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法由以下步骤组成：

(1)供试品溶液的制备：取川楝子提取物适量，精密称定，用甲醇配制为供试品溶液， 即得；

(2)对照品溶液的制备：取1-去乙酰基尼泊里宁B对照品适量，精密称定，用甲醇配 制为对照品溶液，即得；

(3)样品分析：采用高效液相色谱仪，紫外或蒸发光检测器，碳十八改性硅胶色谱柱， 甲醇一水为流动相，洗脱梯度条件为甲醇(％)比例40→60(0-20min)、60(20-70min) 或为适宜等度条件，流速1.0ml/min；分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL和供试品溶液 20μL，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

所述检测方法步骤(1)中，所述川楝子提取物的制备方法为文献中公开的溶剂提取法， 其中优选乙酸乙酯提取；或优选药材经水或含水乙醇提取、浓缩为水浓缩液后，用乙酸乙酯 萃取。所述提取方法可为回流提取、超声提取、微波辅助提取、逆流提取中的任意一种。优 选制备方法为：取川楝子药材生品或炮制品，用8-15倍量乙酸乙酯提取2-3次，提取液合并 浓缩，干燥，即得；或取川楝子药材，用8-15倍量水或含水乙醇提取2-3次，提取液合并浓 缩，用乙酸乙酯萃取2-4次，萃取液合并浓缩，干燥，即得。所述川楝子炮制品炮制方法可 为炒制、醋制、盐制等，均有市售商品。

所述检测方法步骤(2)中，所述对照品还可包括尼泊里宁A、尼泊里宁B、川楝里宁和 川楝素中的一个或多个成分，以用于相关特征谱或指纹谱定性定量分析。

所述检测方法步骤(3)中，检测器优选蒸发光检测器或紫外-蒸发光联用检测器；所述甲 醇-水流动相中可加入乙腈或四氢呋喃作为改性剂，洗脱方式可为优化等度洗脱。可同时对尼 泊里宁A、尼泊里宁B、川楝里宁和川楝素中的一个或多个成分进行定性或定量分析。

本发明提供的川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法，还可包括以1-去乙酰基尼泊 里宁B对照品和川楝子对照药材，使用硅胶基质薄层板，石油醚-乙酸乙酯展开剂，硫酸乙 醇为显色剂，对川楝子提取物进行薄层鉴别。所述石油醚-乙酸乙酯展开剂优选比例为1∶1 (体积比)。

本发明提供的川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法，还可包括以1-去乙酰基尼泊 里宁B为对照品，采用比色法对川楝子提取物中总萜含量进行检测。所述比色法可参考文献 公开的方法进行，例如药典2010版附录。

本发明通过川楝子的化学成分研究和分析，创新性地发现了其中的主要成分为尼泊里宁 类化合物，并揭示了该类成分的互变异构现象；在此基础上，首次采用HPLC/ELSD分析方 法，首次建立了尼泊里宁类成分的定性定量分析方法，并系统建立了该类成分的薄层鉴别和 总萜含量测定方法。尼泊里宁类成分是川楝子及同属植物果实中特有的特征性成分，本发明 所述检测方法专属性强、灵敏度高、方法科学、容易实现，适用于对川楝子及楝属植物果实 提取物及其组合提取物中尼泊里宁类成分的检测和质量控制。

本发明内容是通过大量实验研究和工艺优化完成的，以下述具体实施例进行说明。

附图说明

图1为川楝子提取物的HPLC/ELSD谱图。(A)和(B)图中1为1-去乙酰基尼泊里宁B 为对照品，2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b依次为尼泊里宁B、尼泊里宁A、川楝里宁和川楝素 对照品的12β/α-羟基互变异构体色谱峰。

图2为川楝子提取物的薄层鉴别图。(A)和(B)图中1-4依次为1-去乙酰基尼泊里宁B、 尼泊里宁B、尼泊里宁A、川楝里宁对照品，M孓R为川楝子对照药材，M孓1为川楝子药材 样品，MTp-1～MTp-5为市售川楝子炮制药材样品，MT-2为川楝子提取物。

具体实施方式

本发明所述的川楝子提取物中柠檬苦素类成分的检测方法是按以下实施例所表示的方 法检测，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不 得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1川楝子提取物的制备

取川楝子药材4kg，粉碎成粗粉，用50L75％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提 取液，减压回收溶剂，得川楝子浸膏550g，用4L水分散，用乙酸乙酯振摇萃取4次，每次 4L，乙酸乙酯萃取液合并，减压回收溶剂，得川楝子提取物(180g)。

实施例2川楝子提取物中柠檬苦素类成分的HPLC/ELSD检测方法

(1)对照品溶液的制备：分别取1-去乙酰基尼泊里宁B(对照品1：0.7746mg/ml)、 尼泊里宁A(对照品2)、尼泊里宁B(对照品3)、川楝里宁(对照品4)和川楝素(对照品 5；0.3445mg/ml)适量，精密称定，用甲醇配制，即得。

(2)供试品溶液的制备：取川楝子药材样品或对照药材适量，研细(过三号筛)，取约 5.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，精密加入乙酸乙酯50ml，密塞，称定重量，回流提取 3小时，放置至室温，称重，用乙酸乙酯补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密量取 续滤液25ml，蒸干，转移至5ml量瓶中，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液，即得。另 取实施例1所得川楝子提取物适量，用甲醇配制，即得。

(3)HPLC分析

系统适用性考察：本类成分仅有紫外端吸收(210nm)，在提取物样品中色谱峰易被杂 质掩盖，因而选用蒸发光散射检测器或紫外-蒸发光散射检测器联用检测，本实施例中采用 Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD(检测波长208nm)-ELSD(Alltech2000型)联用检 测。色谱柱：YMC C18色谱柱(5μm，150×6.0mm)；柱温：25℃；流速1.0ml/min。

流动相的考察和优化：试验过程中共选择了以下流动相系统：甲醇-水(65∶35，等度)； 甲醇-水(60∶40，等度)；甲醇-水(梯度洗脱)；乙腈-水(梯度洗脱)；甲醇-乙腈-水(40∶ 20∶40，等度)；甲醇-乙腈-水(30∶30∶40)；甲醇-水-四氢呋喃(50∶40∶10)；甲醇-水- 四氢呋喃(55∶40∶5，等度)。分别采用上述条件进行摸索和比较，各种流动相中均有一定 分离效果，最终优化条件选用甲醇-水梯度洗脱，甲醇(％)为：40→60(0～20min)→60 (20～70min)。代表性川楝子提取物样品色谱图见附图1。

(4)指纹谱分析：选用对照品1-5溶液，和川楝子样品平行操作，对川楝子样品谱图中 相应化合物色谱峰进行归属。结果参见表1和附图1。

表1川楝子指纹图谱的成分归属

(5)含量测定：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl和供试品溶液20μl，注入液相色 谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。以峰面积对数值为纵坐标，进样量对数值 为横坐标，绘制标准曲线，得1-去乙酰基尼泊里宁B回归方程为y＝1.6727x+1.86，r＝0.9996， 在2.3238～19.365μg范围内呈良好的线性关系。经精密度试验、稳定性试验、重现性试验、 回收率试验等方法学考察，结果符合质量分析方法验证的技术要求。

(6)样品测定结果：测得1-去乙酰基尼泊里宁B和川楝素含量在川楝子生药材(MT-1) 中依次为1.1369/0.2131(mg/g生药)；在川楝子炮制药材饮片(MTp-1～MTp-6)中依次为 0.6978/0.4222、0.7368/0.3344、0.3726/0.2579、0.3342/0.3294、0.0523/0.4039、 0.0819/1.4114(mg/g生药)；在川楝子提取物中依次为1.67/0.13(％)。尼泊里宁A、尼泊 里宁B、川楝里宁的含量，由其异构体a和b峰面积(表1)总和，按1-去乙酰基尼泊里宁 B标准曲线进行计算，含量按1-去乙酰基尼泊里宁B计，即得。

实施例3川楝子提取物中柠檬苦素类成分的薄层鉴别研究

分别取川楝子生药材(MT-1)，5批市售川楝子炮制药材饮片(MTp-1～MTp-5)和川楝 子提取物(MT-2)，以川楝子对照药材(MT-R)和1-去乙酰基尼泊里宁B对照品(1)共同 进行薄层鉴别(见附图2)。对照品溶液、供试品溶液同实施例2。

薄层色谱鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取各对照品 溶液、样品溶液各10-20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙 酯(1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至色谱斑点清晰。

结果：1-去乙酰基尼泊里宁只有一个斑点，Rf值适中，可用于川楝子的薄层鉴别研究。 其它3个对照品在薄层上均显示两个斑点，存在互变异构现象。

实施例4川楝子提取物中柠檬苦素类成分的总含量测定

取实施例1川楝子提取物，以实施例2中1-去乙酰基尼泊里宁B为对照品进行总萜含量 测定。操作方法参照孙毅坤，川楝子炮制工艺及质量标准研究，北京中医药大学博士论文， 2004。采用5％香草醛-高氯酸-冰醋酸显色，535nm检测。结果：测得川楝子提取物中总萜含 量为34.7％。