富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂

摘要

本发明提供一种富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物是以通式C

说明书

本申请是申请日为2010年12月24日、申请号为201010621120.5、发明名称为“富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂”的发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一种富勒烯衍生物，具体地说，涉及富勒醇颗粒C₆₀O_xH_y(10＜y≤x＜50)和富勒烯羧基衍生物C₆₀(C(COOH)₂)_n(n为1-4的整数)以及该富勒烯衍生物的疫苗佐剂、疫苗制剂和其在疫苗领域的应用，属于生物技术和疫苗领域。 

背景技术

在预防和治疗重大疾病尤其是传染病方面，疫苗发挥了极其重要的作用。在疫苗的研究和开发过程中，主要通过抗原和疫苗载体或佐剂的设计优化来获得安全有效的疫苗。目前，临床上唯一批准使用的佐剂为铝佐剂，其能较好地促进机体的体液免疫水平，在疾病的预防过程中发挥了重要作用。然而，铝佐剂在一定程度上抑制了机体的细胞免疫水平，同时其在注射部位能引起一定的炎症和过敏反应，这些都在一定程度上限制了铝佐剂在临床中的广泛应用。目前研究开发的传统意义上的疫苗佐剂则由于安全性或有效性方面的缺陷难以投入临床。 

在免疫反应的发生过程中，抗原呈递细胞尤其是树突状细胞(Dendritic cells,DC)发挥着关键作用，通过抗原呈递细胞的活化，机体的细胞免疫和体液免疫反应得以快速有效地发生。因此，DC疫苗佐剂的研发成为目前人们关注的重点。 

近年来，纳米技术的快速发展已渗透至各个领域。纳米材料由于其粒径小、比表面积大而呈现出块体材料所不具备的新颖特性。同时纳米材料易进行表面修饰加工，从而实现不同的目的。这将为疫苗载体或佐剂的研发注入新的活力。 

富勒烯C₆₀是一种由碳原子构成的纳米尺度的球状分子，具有独特的物理化学性质，在生物医学和材料科学领域具有极大的应用前景。由于富勒烯本身属疏水性物质，这极大地限制了其在生物医学领域的应用。近年来水溶性富勒烯及其衍生物的成功合成为其应用提供了保证。同时富勒烯衍生物在水环境体系中可通过与自身或其他物质的相互作用而团聚成纳米颗粒物，且其安全性问题得到了解决。在众多的纳米材料中，富勒烯衍生物尤其是金属富勒醇(Gd@C₈₂(OH)₂₂)和富勒醇(C₆₀O_xH_y)显示出良好的抗肿瘤活性(专利申请号：200610152170.7，200710175456.1)。同时研究发现金属富勒醇和富勒醇主要通过增强小鼠机体的细胞免疫反应发挥其抑瘤作用，且金属富勒醇可诱导树突状细胞的成熟，且富勒烯衍生物具有良好的生物安全性(Ying Liu,Fang Jiao,Yang Qiu,et al.Biomaterials,2009,30:3934-3945.Ying Liu,Fang Jiao,Yang Qiu,et al.Nanotechnology,2009,20:415102.De Yang,Yuliang Zhao,Hua Guo,et al.ACS Nano,2010,4:1178-1186.)。 

发明内容

本发明人在对富勒烯衍生物的研究过程中发现，其可作为佐剂，显著提高小鼠机体的细胞免疫和体液免疫水平。因此本发明的目的在于提供一种富勒烯衍生物，在其表面引入亲水基团，如羟基(-OH)、羧基(-COOH)等，能够解决富勒烯水溶性差的问题，为其应用奠定基础。本发明的另一个目的是提供所述富勒烯衍生物疫苗佐剂和疫苗制剂，以及该富勒烯衍生物在疫苗领域的应用，其可以增强疫苗的免疫原性，能够解决传统佐剂在安全性和/或有效性方面的缺陷。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一方面，本发明提供的一种富勒烯衍生物在制备用于基因传递的载体和/或用于提高疫苗的免疫原性的药物中的应用。 

进一步，所述富勒烯衍生物是由以下分子式1表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物： 

式1：C₆₀O_xH_y，其中，10＜y≤x＜50；优选地，x=y=10-50；更优选地x=y=15-25； 

式2：C₆₀(C(COOH)₂)_n，其中，n为1-4的整数；优选地，n=1-3；更优选地，n=2。 

另一方面，本发明提供的一种疫苗佐剂，所述佐剂包含富勒烯衍生物，该佐剂可以与疫苗同时混合后对受试者进行免疫，还可以先为受试者注射该佐剂，之后对受试者进行疫苗免疫，或者可以对受试者进行疫苗免疫后再注 射该佐剂，优选该佐剂与疫苗同时混合后对受试者进行免疫。所述佐剂与疫苗对受试者免疫的部位相同或不同。 

进一步，所述富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为1-400nm。 

又一方面，本发明提供的一种疫苗制剂，所述制剂包含所述的疫苗佐剂。 

进一步，所述疫苗包括，但不限于：艾滋病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和人乳头状瘤病毒疫苗等重大传染病疫苗。本发明人以编码艾滋病病毒包膜蛋白基因的(HIV-1 Env)表达质粒(DNA)为研究对象，比较了富勒烯衍生物作为佐剂对HIV DNA疫苗免疫原性的影响，发现该佐剂与DNA疫苗混合免疫小鼠后，可显著增强DNA的免疫原性，且在相同的免疫次数情况下，低剂量DNA+佐剂和单独高剂量DNA引发的免疫反应水平无显著差异。同时，相同剂量的DNA+佐剂在少免疫一次的情况下，所引发的免疫反应水平和单独免疫DNA疫苗无显著差异。 

进一步，所述疫苗制剂的免疫途径选自：皮下注射、滴鼻免疫、腹腔注射、肌肉注射和皮内注射，上述免疫途径均可发挥富勒烯衍生物的免疫佐剂作用。 

本发明提供的一种富勒烯衍生物疫苗佐剂与传统佐剂相比，其有益效果如下： 

1．本发明提供的疫苗佐剂安全性好，对注射部位无明显的刺激作用； 

2．本发明提供的疫苗佐剂可显著提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，同时可减少抗原的使用剂量或减少免疫次数； 

3．本发明提供的疫苗佐剂具有抗氧化和清除自由基的功能，在充当免疫佐剂的同时，还可能提高机体抗氧化的防御能力，使机体维持稳态。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中： 

图1为本发明富勒醇的原子力显微镜表征图片； 

图2为本发明富勒醇的扫描电子显微镜表征图片； 

图3为本发明富勒醇的动态光散射仪检测结果； 

图4为本发明富勒醇对HEK(Human embryonic kidney)293细胞活力的影响； 

图5为本发明富勒醇对HEK293细胞形态的影响； 

图6为本发明富勒醇对NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line)细胞活力的影响； 

图7为本发明富勒醇对NIH3T3细胞形态的影响； 

图8为本发明富勒醇对HEK293细胞的转染效果，其中荧光显微镜的放大倍数为16×20； 

图9为本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响； 

图10为本发明富勒醇对特异性抗体滴度的影响。 

图11为采用不同免疫途径时本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。 

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。 

实施例1富勒醇C₆₀(OH)₂₀的合成

首先，将1ml的40%四丁基氢氧化铵溶液(TBAH)和2ml氢氧化钠溶液(2.22g/ml)加至30ml的C₆₀(Sigma公司)甲苯溶液(1.5mg/ml)中，剧烈搅拌下反应24h；弃去有机相，并用真空旋转蒸发仪(RV06-ML 1-B，德国)除去水相；用50ml甲醇洗涤样品，甲醇通过真空蒸发除去，如此反复洗涤3-5次；之后，将10ml去离子水加至样品中，持续搅拌至溶液呈透明的红棕色，继续加入20ml去离子水，并用Sephadex G-25色谱柱(Amersham公司，英国)纯化样品，最后真空干燥，即可获得富勒醇纳米颗粒。通过调节氢氧化钠的加入量可获得含不同数量羟基的富勒醇。 

利用原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)(BMT AFM3000,德国)和扫描电子显微镜(Scanning electron microscope，SEM)(S-4800，日本日立公司)对所得富勒醇进行表征，结果如图1和图2所示，富勒醇的平均粒径约为120nm。 

利用动态光散射粒度分析仪(DLS)(Zetasizer Nano，英国马尔文公司)检测所得富勒醇的电位，结果如图3所示，富勒醇表面带负电荷，平均电势约为-51.6mv。 

利用X射线光电子能谱仪(XPS,日本电子株式会社)对富勒醇所含的羟基数量进行检测，结果见表1，由表1可知羟基(-OH)数量为： (18.78/55.73)×60=20。 

表1不同碳原子的XPS检测结果 

名称 结合能峰位(ev) 面积百分数(%) 无氧C 284.80 55.73 C-O 286.59 18.78 C=O 288.19 12.78 O-C=O 289.68 8.94 O-(C=O)-O 291.69 3.77

实施例2富勒醇对HEK293细胞(ATCC)活力的影响

1．含富勒醇的完全培养基的配制： 

首先取实施例1中所得的富勒醇适量，用无菌去离子水配制成2mM的水溶液；之后以完全DMEM(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium)培养基(含10%胎牛血清，Gibco公司)将富勒醇水溶液稀释至500μM，并以完全培养基进行梯度稀释，从而获得浓度为500、100、20、4、0.8、0.16μM的系列溶液，备用。 

2．富勒醇对HEK293细胞活力的影响： 

首先以0.25%胰酶消化HEK293细胞，终止消化后，以1000rpm进行离心5min。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液，并以5×10⁴/ml浓度接种于96孔板中，每孔100μl，之后置于培养箱(37℃、5%CO₂)中培养24h。分设空白对照组、阴性对照组和富勒醇试验组，每组设三个平行孔。弃去培养基，之后分别将完全培养基和含富勒醇的完全培养基加至孔中，每孔100μl，置于培养箱(37℃、5%CO₂)中培养48h，之后弃去培养基，以磷酸盐(PBS)缓冲液洗涤2次，最后加入含10%的CCK-8(Cell counting kit-8，日本岛津公司)的含血清培养基，每孔100μl，继续培养2h，之后利用酶标仪(检测波长为450nm)进行检测，确定富勒醇对HEK293细胞活力的影响情况。 

3．结果：富勒醇对HEK293细胞活力的影响见图4，结果显示，与阴性对照组相比，富勒醇纳米颗粒处理细胞48h后，细胞活力未发生明显变化，即使在最高剂量组，细胞活力仍高于90%。图5表示富勒醇对HEK293细胞形态的影响，图5A为正常对照组，图5B表示富勒醇工作浓度为500μM时处理细胞48h后的细胞图片，可见试验组细胞形态与正常对照组一样，呈长 梭形。这些都说明，实施例1所得的富勒醇具有良好的生物相容性。 

实施例3富勒醇对NIH3T3细胞(ATCC)活力的影响

参照实施例2中所述的方法，考察富勒醇纳米颗粒对NIH3T3细胞活力的影响情况，结果见图6，与实施例2中的结果类似，与阴性对照组相比，富勒醇纳米颗粒处理细胞48h后，细胞活力未发生明显变化，即使在最高剂量组，细胞活力仍高于90%。图7表示富勒醇对NIH3T3细胞形态的影响，图7A为正常对照组，图7B表示富勒醇工作浓度为500μM时处理细胞48h后的细胞图片，可见试验组细胞形态与正常对照组一样，呈长梭形。这些都说明富勒醇具有良好的生物相容性。 

实施例4富勒醇对HEK293细胞的转染

1．富勒醇-EGFP质粒(绿色荧光蛋白编码基因，Clontech公司)混合物的配制： 

首先取实施例1中所得富勒醇适量，用无菌去离子水配制成2mM的水溶液；用无血清培养基分别将6μl富勒醇水溶液(2mM)和7.5μL的EGFP水溶液(0.325μg/μl)稀释至150μl，之后将稀释后的富勒醇溶液加至EGFP溶液中，混合均匀，室温下孵育30min，备用。 

2．聚乙二胺(PEI)-EGFP混合物的制备： 

用无血清培养基分别将31.2μl的PEI水溶液(100μg/ml)和7.5μL的EGFP水溶液(0.325μg/μl)稀释至150μl，之后将PEI溶液加至EGFP溶液中，混合均匀，室温下孵育30min，备用。 

3．富勒醇转染HEK293细胞： 

首先以0.25%胰酶消化HEK293细胞，终止消化后，以1000rpm进行离心5min；用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液，并以5×10⁴/ml浓度接种于24孔板中，每孔500μl，置于培养箱(37℃、5%CO₂)中培养24h；之后吸出原培养基，每孔加入400μl含血清的培养基。分设空白对照组、裸EGFP质粒对照组、富勒醇-EGFP混合物试验组和PEI阳性对照组，每组设3个平行孔。空白对照组加入含血清培养基100μl/孔，裸EGFP质粒对照组加入含有EGFP质粒(绿色荧光蛋白的质粒DNA，Biovector-08，Clontech公司)的含血清DMEM培养基(EGFP质粒的浓度为8μg/mL)100μl/孔，富勒醇-EGFP混合物试验组加入上述配制的富勒醇-EGFP混合物100μl/孔，阳性对照组加入PEI-EGFP混合物100μl/孔，轻轻摇匀，置于培养箱(37℃、5%CO₂)中继续培养，并于48h后利用荧光显微镜观察转染效果。 

4．结果：富勒醇对HEK293细胞的转染效果如图8所示，图8A为裸 EGFP对照组，图8B为富勒醇-EGFP试验组，图8C为PEI阳性对照组。由图可见，裸EGFP质粒基本无转染效果，富勒醇则对细胞有一定的转染效果，而阳性对照组则有较好的转染效果。由于富勒醇表面带负电荷，而DNA表面亦呈负电，因此其很难通过静电吸附作用结合在一起，从而将DNA携带至细胞中。然而由于富勒烯本身尺寸很小(小于1nm)，在不同的溶剂体系中，其可与自身或其他物质相互作用从而团聚形成较大粒径的颗粒物，因此可通过控制溶剂体系的不同得到不同尺寸的富勒烯或其衍生物，而富勒烯衍生物在团聚过程中很可能将DNA包裹起来，从而使DNA免受降解，同时可以轻松的进入细胞内部，最终为翻译表达蛋白发挥其生物学作用。 

实施例5富勒醇对小鼠机体免疫反应的影响

本发明以编码艾滋病病毒包膜蛋白基因的(HIV-1 Env)表达质粒(DNA)为研究对象，比较了富勒烯衍生物作为佐剂对HIV DNA疫苗免疫原性的影响。 

1．富勒醇-HIV Env质粒DNA混合物的制备方法： 

取实施例1中所得富勒醇适量，用无菌注射水分别配制成80μM、400μM和2mM的溶液；用无菌注射水将HIV Env质粒DNA(中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心病毒与免疫研究室提供)稀释至800μg/ml。之后分别将不同浓度的富勒醇溶液200μl与同体积的HIV Env质粒DNA溶液混合均匀，室温下孵育30min，备用。 

2．富勒醇对小鼠机体免疫反应的影响： 

将40只雌性Balb/c小鼠(6-8周龄，北京维通利华动物实验技术有限公司)随机分为5组，每组8只，分为空白对照组、裸HIV Env质粒DNA对照组、富勒醇-HIV Env质粒DNA试验组(低、中和高剂量组)；每只小鼠皮内注射20μg的HIV Env质粒DNA，富勒醇的剂量分别为0.1、0.5和2.5μmol/kg；每隔两周免疫一次，免疫体积为50μl，免疫三次，并于第三次免疫结束后2周摘眼球处死小鼠，分离小鼠血清，利用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测富勒醇对抗体滴度的影响；同时无菌采集小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，利用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌IFN(Interferon)-γ的情况，确定富勒醇对小鼠机体细胞免疫水平的影响。 

3．ELISPOT方法检测免疫后小鼠的细胞免疫反应： 

(1)小鼠脾淋巴细胞的制备 

①.摘眼球处死小鼠，之后用75%酒精浸泡片刻，置于无菌超净工作台中； 

②.无菌采集小鼠脾脏，将脾脏置于折叠的无菌纱布(2层)中，并在含5mL的RPMI1640完全培养基(Gibco公司)(含10%胎牛血清，FBS)的平皿中研磨脾脏，之后吸取液体于15ml离心管中，以1000rpm离心5min； 

③.弃去上清，敲击沉淀物(细胞)使其均匀悬浮。加入2ml红细胞裂解液，裂解4-5min，之后加入6ml含血清1640培养基终止裂解，混匀后，以1000rpm离心5min； 

④.弃去上清，再次敲击沉淀物使其均匀悬浮，之后取适量悬浮液稀释10倍，进行细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁷/ml。 

(2)ELISPOT检测小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平： 

①.ELISPOT板子的包被与封闭：用无菌PBS以1:200比例稀释抗IFN-γ的抗体，每孔100μL，置于CO₂培养箱(5%，37℃)中孵育2h，之后弃去包被抗体，用PBST(Phosphate buffered saline Tween-20)洗涤6次，最后，每孔加入200μl含1%BSA(Bovine serum albumin)的PBS，置于培养箱中(5%CO₂，37℃)封闭1h； 

②.弃去封闭液，每孔加入100μl多肽(三条CN54Env蛋白-CD8+T细胞优势表位肽，氨基酸序列为：CKEVHNVWATHACVPTDPNP；SELYKYKVVEIKPLGIAPTA；QQSNLLRAIEAQQHLLQLTV，由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心提供，每条多肽浓度为10μg/ml)和100μl淋巴细胞悬液(1×10⁷/ml)；阴性对照组仅加入RPMI1640完全培养基，阳性对照组不加多肽，加入2.5μl的PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)(25ng/ml)和1μl的Ionomycin(离子霉素，Sigma公司)(1μg/ml)，试验组设2个复孔；之后置于培养箱中(5%CO₂，37℃)培养30h； 

③.弃去细胞，用PBST洗涤8次，每次2min，之后每孔加入100μl生物素化的抗IFN-γ的抗体，封膜，室温下避光孵育2h； 

④.弃去液体，用PBST洗涤8次，每次2min，每孔加入50μl的GABA(γ-Aminobutyric acid)溶液，封膜，室温下避光放置1h； 

⑤.弃去GABA溶液，用PBST洗涤6次，每次2min。PBS洗涤2次，每次2min，之后在吸水纸上将ELISPOT板子拍干； 

⑥.每孔加入100μl显色液(每20μl显色剂与1ml显色底物混合)，室温下避光反应15-40min，之后用蒸馏水冲洗，终止反应； 

⑦.室温下晾干，之后用ELISPOT读板仪(Bioreader5000，德国Bio-Sys GmbH公司)检测，评价小鼠的细胞免疫水平。 

(3)ELISA检测免疫后小鼠的体液免疫反应： 

①.用HIV-1 B/C重组毒株CN54重组gp120抗原蛋白(纯度大于95%)包被酶标板(0.1μg/ml)，每孔加0.1ml，4℃过夜，次日用PBST洗涤3次，甩尽残余液体，以抗体稀释液封闭60min，之后PBST洗涤3次，晾干后4℃保存； 

②.将待检样品(小鼠血清)用PBS缓冲液进行倍比稀释(1:250、1:500、1:1000至1:32000)，之后每孔加入100μl，同时设立空白对照组和阴性对照组，37℃条件下孵育1h； 

③.弃去血清，用PBST洗涤8次，拍干，用PBS将酶标二抗进行1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃条件下孵育1h； 

④.弃去二抗，之后PBST洗涤8次，拍干，于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃避光反应10min，待显色完全后加入50μl的2M硫酸终止反应。 

⑤.利用酶标仪于450nm处(630nm为参考波长)，以空白对照孔调零后检测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即判定为阳性。 

4．结果： 

图9和10分别为细胞免疫和体液免疫的检测结果。由图9可见，与HIVEnv质粒DNA对照组相比，富勒醇低剂量和中剂量试验组IFN-γ的分泌水平显著增强，高剂量组水平有所下降，说明富勒醇对机体免疫反应的影响具有剂量依赖性，低剂量即0.1μmol/kg为最佳剂量，且当富勒醇剂量为0.1μmol/kg，HIV Env质粒DNA剂量为4μg/只时，小鼠机体细胞免疫水平与注射高剂量的HIV Env质粒DNA(20μg/只)时的细胞免疫水平相当，可见富勒醇颗粒可以减少抗原的使用剂量，这将极大的降低未来疫苗的成本，具有重要的实际意义。由图10可见，与HIV Env质粒DNA对照组相比，富勒醇试验组(低剂量组)的抗体滴度明显升高。这些都说明富勒醇作为一种新型免疫佐剂，能更好地促进机体的细胞免疫水平，同时能提高机体产生的抗体滴度。 

此外，富勒醇通过皮下注射、腹腔注射、肌肉注射和滴鼻免疫途径亦可以实现与皮内注射途径类似的效果(图11)。同时，富勒烯羧基衍生物也具有与富勒醇颗粒同样的免疫佐剂效果。