用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组

摘要

本发明公开了一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，属于病毒检测领域。本发明的引物组由三对引物组成，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。应用本发明引物序列通过多重PCR方法可同时对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的不同毒株进行检测，结果均为阳性，而对其他常见猪源病毒检测结果均为阴性，说明本发明的引物组特异性强、重复性好；对病毒cDNA梯度稀释后进行PCR检测，说明该引物灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测猪流行性腹泻病 毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，属于病毒检测领域。

背景技术

流行性腹泻病毒（PEDV）是猪流行性腹泻(PED)的病原体。主要危害仔猪，患 病哺乳仔猪出现水样腹泻和呕吐症状，新生仔猪感染后常发生严重失水和死亡，断 奶猪和育肥猪患病后出现4～6天水样腹泻，康复后生长发育受到影响，育肥后期体 重出现减损。由于该病病程短，传播快，致使该病在我国以及世界各国的传播非常 广泛，每年都造成严重的经济损失。

传染性胃肠炎病毒（TGEV）是猪传染性胃肠炎(TGE)的病原体。各种年龄及品 种的猪对本病均易感，患猪主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水，尤其是仔猪（2周 龄以下）致死率高达100%。由于该病病程短，传播快，致使该病在我国以及世界 各国的传播非常广泛，每年都造成严重的经济损失。

轮状病毒（RV）是轮状病毒病的病原体，轮状病毒病是一种流行广泛的人畜共 患病，主要感染幼龄动物的急性肠道传染病，以腹泻和脱水为主要特征，仔猪死亡 率可达50%。

目前在我国，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒是引起仔 猪病毒性腹泻的主要病原体，同时经常存在一种以上疾病的并发感染，给我国畜牧 生产带来了巨大的经济损失，因此，迫切需要建立一种快速有效，并且能同时针对 三种病原体进行检测的方法。

当前检测PEDV、TGEV、RV的常用的方法主要包括：病毒分离鉴定法，免疫 荧光检测法，酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法。

病毒分离鉴定法可通过流行病学、病变和症状做初步判断，进一步确诊需要实 验室分离培养鉴定病毒，分离鉴定病毒一般可采用乳猪接种试验和细胞培养两种方 法。该方法是目前较为通用的方法，其特点是准确、操作简单，但是需要时间较长， 且结果误差较大，人力物力花费较大，不能满足实际应用中快速检测的需要。免疫 荧光检测法，通过荧光素标记二抗的结合，将信号进行放大，通过荧光显微镜观察 鉴定，这在一定程度上提高了检测的灵敏度，但是免疫荧光法中常因为荧光抗体不 够稳定，且判定主观性较强，易出现交叉反应，同时，有需要荧光显微镜等特殊设 备所以应用时有许多局限性。ELISA法是是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法， 可以做定性或半定量检测的快速检测方法，已发展了间接ELISA、双抗体夹心 ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等，虽然在一定程度上缩短了检测时间，但仍 然需要专门的仪器(如酶标仪)，操作过程仍较复杂。

PCR检测技术是通过设计PEDV、TGEV、RV基因组上保守序列的引物，再通 过PCR反应进行基因扩增，再进行检测，该检测方法具有灵敏度高，结果可靠，操 作简单，检测快速，不受环境因素影响等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一套可用于同 时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR检测引 物组。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮 状病毒的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组由三对引物组成，其中，用于 猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示； 用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所 示。

在本发明引物组中，设计合成了一对针对PEDV S基因的引物，分别如SEQ ID  NO：1和SEQ ID NO：2所示，扩增片段大小约为750bp，通过特性实验表明：

1.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起仔 猪病毒性腹泻的常见病原体猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬 病毒均无交叉反应。

2.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于 LJB-03，SCSZ-1两株不同来源的PEDV都可以被很好的检出。

3.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出 量为4.75ng/μL。

在本发明引物组中，设计合成了一对针对TGEV S基因的引物，分别如SEQ ID  NO：3和SEQ ID NO：4所示，扩增片段大小约500bp，通过特性实验表明：

1.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起 仔猪病毒性腹泻的常见病原体猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒和伪狂犬 病毒均无交叉反应。

2.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于 SCZY-1，TH-98两株不同来源的TGEV都可以被很好的检出。

3.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检 出量为31.1ng/μL。

在本发明引物组中，设计合成了一对针对RV VP6基因的引物，分别如SEQ ID  NO：5和SEQ ID NO：6所示，扩增片段大小约250bp，通过特性实验表明：

1.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起仔猪病毒 性腹泻的常见病原体猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和伪狂犬 病毒均无交叉反应。

2.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于JL94， SL-1两株不同来源的PRV都可以被很好的检出。

3.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为 38.625ng/μL。

同时，本发明还提出了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎 病毒以及猪轮状病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物 组。

进一步的，本发明还提供了所述的引物组在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传 染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒试剂中应用。及

所述的试剂盒在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状 病毒试剂中应用。

更进一步的，本发明提供了一种检测样品中PEDV、TGEV和RV的多重PCR 检测方法，分别针对PEDVS基因、TGEV S基因和RV VP6基因的保守区段设计引 物，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID  NO：2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ  ID NO：4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID  NO：6所示。当样品中有PEDV存在时可扩增片段大小为750bp，当样品中存在TGEV 时，可扩增片段大小约为500bp，当样品中存在RV时，可扩增片段大小约为250bp， 结果如图1所示。

本发明与目前常见检测方法比较具有下列优点:

本发明根据PEDV S基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引 物，该对引物对PEDV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体 无交叉反应。

本发明根据TGEV S基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引 物，该对引物对TGEV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体 无交叉反应。

本发明根据RV VP6基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引 物，该对引物对RV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体无 交叉反应。

本发明在PEDV、TGEV和RV的PCR检测基础上建立了多重PCR检测方法， 经试验验证，该检测方法具有灵敏性高，特异性好，可重复性强的特点。

本发明建立的多重RT-PCR检测方法，与传统的检测方法相比较，具有操作简 单，检测快速，灵敏性高的特点。

附图说明

图1为采用本发明的多重PCR方法对PEDV、TGEV、PRV进行检测的结果；

M：dM2000；1：PEDV细胞培养物；2：TGEV细胞培养物；3：PRV细胞培 养物；4：PEDV、TGEV混合细胞培养物；5：PEDV、PRV混合细胞培养物；6： TGEV、PRV混合细胞培养物；7：PEDV、TGEV、PRV混合细胞培养物；

图2为采用本发明的多重PCR方法对PEDV进行灵敏性检测的试验结果；

M：dM2000；1：PEDV；2：2倍稀释；3：2²倍稀释；4：2³倍稀释；5：2⁴倍 稀释；6：2⁵倍稀释；7：2⁶倍稀释；8：2⁷倍稀释；9：2⁸倍稀释；10：2⁹倍稀释；

检测最大稀释倍数为2⁶，检测的最小病毒核酸检出量为4.75ng/μL;

图3为采用本发明的多重PCR方法对TGEV进行灵敏性检测的试验结果；

M：dM2000；1：TGEV；2：2倍稀释；3：2²倍稀释；4：2³倍稀释；5：2⁴倍 稀释;

检测最大稀释倍数为2⁴，检测的最小病毒核酸检出量为31.1ng/μL；

图4为采用本发明的多重PCR方法对PRV进行灵敏性检测的试验结果；

M：dM2000；1：PRV；2：2倍稀释；3：2²倍稀释；4：2³倍稀释；5：2⁴倍稀 释；6：2⁵倍稀释;

检测最大稀释倍数为2⁴，检测的最小病毒核酸检出量为38.625ng/μL；

图5为本发明的多重PCR方法的重复性实验结果；

M：dM2000；1：PEDV LJB-03株；2：PEDV SCSZ-1株；3：水对照；4：TGEV TH-98株；5：TGEV SCZY-1株；6：水对照；7：PRV JL-94株；8：PRV SL-1株； 9：水对照；

图6为本发明的PEDV检测引物的特异性试验结果；

M：dM2000；1：猪流行性腹泻病毒；2：猪传染性胃肠炎病毒；3：猪轮状病 毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒；

图7为本发明的TGEV检测引物的特异性试验结果；

M：dM2000；1：猪传染性胃肠炎病毒；2：猪流行性腹泻病毒；3：猪轮状病 毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒；

图8为本发明的PRV检测引物的特异性试验结果。

M：dM2000；1：猪轮状病毒；2：猪流行性腹泻病毒；3：猪传染性胃肠炎病 毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而 不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精 神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替 换均在本发明的保护范围之内。

实施例1

1材料和方法

1.1病毒株

PEDV SCSZ-1株(来自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流 行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗)、PEDV LJB-03株(由本实验室分离，保存)，TGEV  SCZY-1株(来自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、 猪轮状病毒三联活疫苗)、TGEV TH-98株(由本实验室分离，保存)和RV SL-1株(来 自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒 三联活疫苗)、JL94株(由本实验室分离，保存)。

1.2主要试剂

Trizol购自Invitrogen(中国)有限公司；反转录酶MLV，购自Prombga（北京） 有限公司；RNA酶抑制剂RRI购自宝生物（大连）有限公司；rTaq酶，购自宝生 物（大连）有限公司。

1.3引物设计

分别针对PEDV S基因、TGEV S基因和RV VP6基因的保守区段设计引物， 引物均由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。序列见表1。

表1多重PCR引物序列

1.4多重PCR方法建立

以PEDV SCSZ-1株，TGEV SCZY-1株和RV SL-1株的cDNA混合物作为多重 PCR的模板，建立多重PCR方法。

1.4.1反转录

首先通过Trizol--哥伦仿共同萃取病毒RNA，以提取的病毒RNA为模板，进行 反转录，反应体系为：模板7.5μL，Oligo（DT）1μL，去离子水3.5μL，Buffer4μL， dNTP2μL，RRI1μL，MLV1μL，42℃反应2h，70℃作用15min，获得模板cDNA。

1.4.2PCR反应

将获得cDNA为模板进行扩增，反应体系20μL：模板3μL，Buffer2.5μL，dNTP （2.5mM）2μL，PEDV、TGEV和PRV引物10pmol/mL各0.5μL，Taq PCR聚合酶 1μL，去离子水8.5μL。反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35 个循环。

1.4.3琼脂糖凝胶电泳

将PCR反应产物与6倍Loading Buffer混均后在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳， 结果如图1所示。当样品中有PEDV存在时，在750bp附近出现特异性条带，当样 品中有TGEV存在时，在500bp附近出现特异性条带，当样品中有PRV存在时， 在250bp附近出现特异性条带。

1.5本发明多重PCR的灵敏性实验

分别测定PEDV，TGEV和RV的模板浓度后，2倍梯度稀释，测定该多重PCR 方法的敏感性。

结果：以本发明建立的多重PCR方法针对PEDV S基因的最小病毒核酸检出量 为4.75ng/μL，如图2所示；本发明针对TGEV S基因最小病毒核酸检出量为 31.1ng/μL，如图3所示；针对PV VP6基因的最小核酸检出量为38.625ng/μL，如图 4所示。

1.6本发明多重PCR的重复性试验：

本研究针对PEDV SCSZ-1株、LJB-03株，TGEV SCZY-1株、TH-98株和RV SL-1 株、JL94株进行检测，结果表明本发明建立的检测方法针PEDV、TGEV、PRV不 同毒株均有较好的检出效果，结果如图5所示。

1.7本发明多重PCR的特异性实验

以本发明建立的多重PCR检测方法分别单独对PEDV、TGEV、RV进行检测， 检测结果只有单一的特异性条带；以本发明建立的多重PCR检测方法对PEDV、 TGEV、RV病毒混合溶液进行检测，检测结果为三条特异性条带，如图1所示。

以本发明建立的多重PCR检测方法对猪瘟病毒、伪狂犬病毒进行检测，检测结 果均未出现条带，表明该检测方法不与其他猪源病毒发生交叉反应，表明该方法具 良好特异性，结果如图6-8所示。