猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立

摘要

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)是临床上引起仔猪腹泻病的3种主要病毒。单独感染其中一种病毒就会引起仔猪严重腹泻、呕吐和脱水，最终导致仔猪死亡;成年猪感染则易成为僵猪，造成饲料报酬降低，严重危害养猪业。由于3种病毒的临床症状和病理变化非常相似，仅靠临床诊断很难区分病原，需要借助实验室方法检测。虽然分离鉴定、免疫相关检测手段已经应用于病毒的诊断，但是由于检测条件、周期、准确性等因素的限制，使得现有相关技术不能用于高效快捷的病原确诊。相比较常规的RT-PCR方法只能做对病原进行定性检测，难以精确定量，荧光定量PCR可以实现高效的DNA定量、定性分析。因此本研究通过设计并制备3种病毒特异基因DNA标准品，探索TaqMan探针荧光定量PCR鉴定的最优条件，并进一步通过条件优化建立检测TGEV、PEDV、PoRV3种病毒的三重实时荧光定量PCR，为临床高效快速的病毒鉴定提供技术基础。
　　本研究首先根据TGEV、PEDV、PoRV的M基因、M基因和VP2基因序列，设计了3对质粒标准品引物和3组荧光RT-PCR引物和探针，通过PCR扩增获得了3种病毒的特异性产物片段，大小分别为834 bp、499 bp和378 bp。将纯化后的DNA片段与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落并提取重组质粒进行PCR和测序鉴定，测定阳性质粒的浓度并计算拷贝数。对重组质粒标准品进行10倍梯度稀释，用于TaqMan探针荧光定量PCR反应。通过优化引物、探针浓度和退火温度，确立了最佳的反应体系和扩增程序，成功建立了3种病毒的TaqMan探针荧光定量PCR方法。
　　为了进一步提高荧光定量PCR方法对多种病毒的检出效率，在单重荧光定量PCR的基础上，建立检测TGEV、PEDV、PoRV三重实时荧光定量PCR方法。通过正交试验对反应体系和条件进行优化，获得最优反应体系为:25μL体系中上下游引物各0.5μL、探针1.2μL、模板2.0μL，反应条件:95℃，30 s;95℃，5s;60℃，34 s，40个循环。敏感性检测结果显示，该方法对TGEV、PEDV、PoRV的检测灵敏度分别为2.49拷贝/μL、4.36拷贝/μL、4.96拷贝/μL。对该方法的组内和组间重复性进行鉴定，结果显示，TGEV、PEDV、PoRV的组内重复试验的变异系数(CV)最大值分别为为2.5％、3.8％、4.3％，组间重复性试验的CV最大值分别为3.7％、3.4％、3.2％，变异系数均不超过5％，表明所建立的方法具有会很好的重复性。选用PRV、PCV-1、PRRSV病毒样本对该方法进行特异性验证，定量PCR反应结果显示均没有发生交叉反应，表明该方法特异性好。用所建立的单一和三重实时荧光定量PCR方法分别对40份临床病料样品进行检测，两种方法均在40份样本中检出TGEV阳性2份，阳性率为5％; PEDV阳性12份，阳性率为30％; PoRV阳性5份，阳性率为12.5％;其中TGEV与PEDV混合感染1例，感染率为2.5％; PEDV与PoRV混合感染2例，感染率为5％。三重荧光定量PCR方法的结果与单一荧光定量PCR方法检测一致，表明建立的方法具有很好的临床应用价值。

目录

摘要

符号说明

第一章 综述

1 猪传染性胃肠炎病毒概述

2 猪流行性腹泻病毒概述

3 猪轮状病毒概述

4 病毒诊断技术

5 实时荧光定量PCR技术

6 研究的目的和意义

参考文献

第二章 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒实时单重荧光RT-PCR检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文结论

致谢

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