一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括一抗标记E2F1特异性抗体、对应一抗来源的荧光二抗、固定液、透化液、封闭液、细胞核染料、封片剂、阳性对照。试剂盒的操作方法包括免疫荧光法标记E2F1和DNA；荧光显微镜测量E2F1在核仁与核基质中免疫荧光强度比值。本发明经济、快速、对设备要求不高，观测结果可数据化，为研究DNA损伤诱发的早期核仁应激提供了准确、简单易行的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂盒及其应用，具体 涉及通过免疫荧光定量检测E2F1在细胞核仁和核基质的比值的方法判定DNA损 伤诱导的早期核仁应激，属于检测试剂盒领域。

背景技术

核仁一直被认为是核糖体合成加工的场所。核仁是一个在普通光学显微镜下就 能观察到的细胞器。在电子显微镜下，核仁可被分为三层——纤维中心、致密纤维 组分和颗粒组分。2006年，核仁蛋白质组学分析将核仁中350种蛋白拓展到750 种。而2009年，这一数据库将核仁蛋白更新到4500种以上。随着分子生物学技术 的日益成熟、高通量技术的发展、表观遗传学的发展，人们发现核仁不仅仅是一个 进行核糖体亚基装配的区域，它还参与细胞周期调控、应激反应、衰老、肿瘤、病 毒感染等多种人类疾病过程。各种细胞胁迫（包括DNA损伤）可引起核仁结构紊 乱及功能失调，发生核仁应激。DNA损伤造成的核仁应激对调节肿瘤细胞周期、 细胞凋亡以及对维持基因组的稳定性具有重要的意义。利用生理生化、分子和细胞 生物学手段研究DNA损伤对核仁应激影响刚刚引起相关领域科学家的关注。

E2F1（或E2F-1，以下统称E2F1）属E2F转录因子家族成员，对细胞周期进 程调控、自噬以及在DNA损伤反应中促进细胞凋亡均具有重要意义。E2F1可通 过转录激活很多与细胞周期调节相关的基因表达，促进细胞周期进程。在细胞周期 进程中，视网膜母细胞瘤蛋白RB和其他口袋蛋白家族成员p107、p130与E2F1 发生相互作用，调节E2F1的转录活性。RB-E2F1复合物的解离可释放、激活E2F1， 进而激活E2F1调节的下游靶基因，从而促进细胞周期从G1期向S期过渡。E2F1 除了在细胞周期调控中扮演重要角色外，在DNA损伤反应中也起重要作用。近年 研究发现，E2F1也是一种核仁转录因子，参与核仁内核糖体DNA转录。

近年来，免疫荧光染色技术的发展非常迅速。在细胞生物学与分子生物学研究 中，人们常常采用免疫荧光标记B23、Fibrillarin、p14ARF等核仁蛋白，来示踪核 仁结构。但是，DNA损伤诱导的核仁应激的情况下，尚没有核仁应激标志物提示 核仁应激。虽然可以采用电子显微镜观察核仁结构的变化提示DNA损伤诱导核仁 应激，但是此种方法十分费力，不能将测量数据量化，对材料、设备的要求很高。

发明内容

发明人研究发现在DNA损伤诱导的早期核仁应激的过程中，E2F1在核仁中 高度聚集；而在DNA损伤诱导的晚期核仁应激的过程中，E2F1在核仁中聚集降 低。由此可见，E2F1在核仁中高度聚集可作为DNA损伤诱导的早期核仁应激的 标志性事件。由此，本发明提供了一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂 盒及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂盒，包括：一抗标记E2F1特 异性抗体、对应一抗来源的荧光二抗、固定液、透化液、封闭液、细胞核染料、封 片剂、阳性对照。优选的，所述的一抗标记E2F1特异性抗体为一抗标记兔来源多 克隆E2F1抗体，所述的荧光二抗Alexa Fluor488标记的羊抗兔Ig G。

优选的，所述的固定液为由pH7.2-7.4的PBS配制的4%多聚甲醛；

所述的透化液为含有0.5%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS（PBST）；

所述的封闭液为含有0.2%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS配制的5%BSA （Albumin From Bovine Serum，牛血清白蛋白）；

所述的细胞核染料为Hoechst33342；

所述的封片剂为甘油与pH7.2-7.4的PBS的体积比例为9:1；

所述的阳性对照为阿霉素（Adriamycin）。

上述的试剂盒在制备检测DNA损伤诱导的早期核仁应激试剂中的应用；

上述的试剂盒在检测DNA损伤诱导的早期核仁应激中的应用，操作步骤如下：

1免疫荧光法标记E2F1和DNA

将制备好的细胞中加入一抗标记E2F1特异性抗体及对应一抗来源的荧光二 抗，然后弃去二抗孵育液，加入Hoechst33342对DNA进行标记。

2荧光显微镜测量E2F1在核仁与核基质中免疫荧光强度比值

当检测样品的比值大于对照样品的比值时，且单因素方差分析或T检验结果 有显著性差异则DNA损伤诱导的核仁应激发生。

优选的，所述的一抗标记为兔来源多克隆E2F1抗体，所述的荧光二抗为Alexa Fluor488标记的羊抗兔Ig G。

本发明通过荧光显微镜免疫荧光定量检测E2F1在细胞核仁和核基质的比值的 方法判定DNA损伤诱导的早期核仁应激的发生。提供了E2F1作为DNA损伤诱导 的细胞早期核仁应激标志物的用途。为研究DNA损伤诱导的核仁应激的标记提供 了简便、经济、准确、快速的方法。

附图说明

图1为E2F1在阿霉素（ADR）诱导的核仁应激中聚集的免疫荧光图；其中A 为对照组、Ch1（DNA染色）免疫荧光结果图；B为实验组（ADR刺激6小时）、 Ch1（DNA染色）免疫荧光结果图；C为对照组、Ch2（E2F1染色）免疫荧光结 果图；D为实验组（ADR刺激6小时）、Ch2（E2F1染色）免疫荧光结果图；图中 数字标注为线性ROI号；

图2为Line Series分析的特定通道对应线性ROI的对长度的荧光强度值直方 图；其中，A为对照组、Ch1（DNA染色）线性ROI的对长度的荧光强度值直方 图；B为阿霉素处理组、Ch1（DNA染色）线性ROI的对长度的荧光强度值直方 图；C为对照组、Ch2（E2F1免疫荧光染色）线性ROI的对长度的荧光强度值直 方图；D为阿霉素处理组组、Ch2（E2F1免疫荧光染色）线性ROI的对长度的荧 光强度值直方图；

图3为统计85个细胞的核仁与核基质E2F1荧光强度比值的统计分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验试剂：兔来源多克隆E2F1抗体购自Santa cruz公司，sc-193；Alexa Fluor 488标记的羊抗兔Ig G（购自Invitrogen公司，A11008）；阿霉素购自Sigma公司。

试验仪器：激光共聚焦扫描显微镜购自OLYMPUS，型号为FV1000S。

实施例1一种检测DNA损伤诱导的早期核仁应激的试剂盒，包括：

（1）固定液：4%多聚甲醛（pH7.2-7.4的PBS配制）；

（2）透化液：含有0.5%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS（PBST）；

（3）封闭液：含有0.2%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS配制的5%BSA （Albumin From Bovine Serum，牛血清白蛋白）；

（4）一抗标记兔来源多克隆E2F1抗体；

（5）Alexa Fluor488标记的羊抗兔Ig G；

（6）细胞核染料：Hoechst33342；

（7）封片剂：甘油和pH7.2-7.4的PBS的比例为9:1；

（8）阳性对照：阿霉素（Adriamycin）。

实施例2

1建立阿霉素诱导早期核仁应激模型

1.1接种细胞:在六孔板中铺2.5×10⁵个H1299细胞，6孔板的每个孔中预先置 有边长为1.8厘米的方形盖玻片。

1.2处理细胞：待1.1中盖玻片上细胞汇合度达到60%时，用1μM阿霉素处 理细胞，同时不加阿霉素的对照组用溶解阿霉素的生理盐水处理细胞后，继续在 37°C，5%CO₂及饱和湿度条件下培养细胞6小时。

2.免疫荧光法标记E2F1和DNA

2.1固定细胞：将1.2中的盖玻片置于含有冰冷pH7.2-7.4的PBS的新6孔板中， 弃去pH7.2-7.4的PBS并加入1ml4%多聚甲醛中（pH7.2-7.4的PBS配制），室温 固定15分钟。pH7.2-7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

2.2透化细胞：弃去2.1中pH7.2-7.4的PBS，加入1ml含有0.5%Triton-X100 的pH7.2-7.4的PBS（PBST）室温透化细胞30分钟。

2.3封闭：弃去2.2中pH7.2-7.4的PBST，加入1ml封闭液（含有5%BSA和 用pH7.2-7.4的PBS配制的0.2%Triton-X100）室温封闭1小时。

2.4弃去2.3中封闭液，加入40μl稀释于封闭液中的一抗标记兔来源多克隆 E2F1抗体（购自Santa cruz公司，sc-193；体积比1：200），将边长为1.8厘米封 口膜盖在盖玻片上面，将气泡赶出封口膜，4°C孵育过夜，或室温孵育1小时。

2.5二抗标记：弃去2.4中一抗孵育液，用600μl PBST洗三次，每次5分钟。 加入40μl稀释于封闭液中的Alexa Fluor488标记的羊抗兔Ig G（购自Invitrogen 公司，A11008；体积比1:500），将边长为1.8厘米封口膜盖在盖玻片上面，将气泡 赶出封口膜，避光4°C孵育过夜，或室温孵育1小时。

2.6标记DNA：弃去2.5中二抗孵育液，用600μl PBST洗3次，每次5分钟。 加入稀释于pH7.2-7.4的PBS中的终浓度为5μg/μl的Hoechst33342，室温孵育10 分钟。

2.7封片：弃去2.6中标记DNA孵育液，600μl pH7.2-7.4的PBS洗3次，每 次5分钟。用封片剂（甘油：PBS体积为9:1）封片到载玻片上，盖玻片面向下。

2.8激光共聚焦扫描显微镜摄像：将2.7中载玻片正面朝下于OLYMPUS FV1000S激光共聚焦扫描显微镜100倍油镜下观察。E2F1以氩（离子）激光(488nm) 激发，通道为Ch2；DNA以紫外线(364nm)激发，通道为Ch1。

3.测量E2F1在核仁与核基质中免疫荧光强度比值

3.1以OLYMPUS FV1000S激光共聚焦扫描显微镜为例，使用OLYMPUS  FLUOVIEW Ver.1.6软件中的ROI工具（ROI tool）中的线性按钮（Line button），利 用Hoechst33342染不上核仁的特性，在扫描图像中DNA染料对应的Ch1中穿过单个 核仁与核基质的部分画线（不要画到核基质以外），依次记为1、2、3等（见图1）。

3.2在Analysis菜单中选择Line Series，将出现Line Series Analysis窗口。点击相 应的ROI No.勾选对应的Ch1或Ch2，点击SAVE按钮。在Save as type下拉菜单中选 择Bitmaps（*.bmp），即可保存特定通道对应线性ROI的对长度的荧光强度值直方图 （见图2）。

3.3在Analysis菜单中选择Line Series，将出现Line Series Analysis窗口。点击相 应的ROI No.勾选对应的Ch1或Ch2，点击SAVE按钮。在Save as type中选择Tab  delimited（*.xls），即可保存特定通道对应线性ROI特定点的该通道荧光强度值的 EXCEL表格。

3.4根据3.3中所述Ch1（DNA染色通道）中线性ROI各点对应荧光强度值，结 合3.2所保存相应荧光强度值直方图判断突然下降的对应点即为核仁区。

3.5根据3.4中所述核仁区对应点编号找出Ch2（E2F1染色通道）对应点编号， 将该区域荧光强度值做平均值；再将其余点（即核基质区）荧光强度值做平均值。

3.6将3.5中核仁区荧光强度平均值除以核基质区荧光强度平均值，得到核仁 与核基质荧光强度比值。

3.7重复3.2至3.6步骤，测量多个细胞的核仁与核基质荧光强度比值，并进行 单因素方差分析。结果如图3所示，对照组核仁与核基质荧光强度比值为1.4955965， 阿霉素组核仁与核基质荧光强度比值为3.0780291。比较两组（n=85）差异P-value= 6.25316×10^-18<0.01，具有极显著差异。