月季开花调控基因RoFT在改变植物开花期中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种月季DNA片段的分离、克隆和功能验证及应用。所述的DNA片段包含月季RoFT基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。将上述基因转化烟草，获得转基因植株，生物试验表明，该基因片段能够改变转基因植物的开花时间。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种月季基因片段的分离克隆、功能验证 和应用。所述的基因与植物开花期有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结 合后直接转入一般植物体，转基因植株的开花期发生变化。

背景技术

在高等植物中，由营养生长向生殖生长(开花)的阶段转换，与信号网络的不同排列组 合紧密相关，这些信号包括外界的刺激例如光照和温度等(Davis，2009；Shigeru Hanano and Koji Goto，2011)。通过对拟南芥开花相关突变体的研究，人们发现植物通过4个途径控制开花， 即光周期途径、自主途径、春化途径和赤霉素途径(孙昌辉等，2007)。最近研究表明miR156 调控的SPL转录因子明确了一个新的内生的开花途径，SPL蛋白控制与年龄相关的开花期 (Wang et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009；Reyes et al.，2011)。上述途径中与拟南芥开花有关 的基因相继被克隆。

高等植物FT/TFL1基因家族成员编码的蛋白质与广泛存在于动物、酵母和细菌中的磷脂 酰乙醇胺结合蛋白结构相似，均具有保守的PEBP结构域，因其能在体外结合磷脂酰乙醇胺 而得名(Grandy et al.，1990)。FT亚家族(包括FT基因和TSF基因以及其它物种中的FT直向 同源基因)，它们编码的蛋白均含有保守的Tyr85和Gln140残基，在第4个外显子中含有对 FT活性起关键作用的11个保守氨基酸残基和高度保守的LYN三联体模块(Ahn et al.，2006)， 主要发挥促进开花的作用；FT是花发育途径中的汇集点，它可以整合来自光周期途径、春化 途径和自主途径等不同花发育途径的信号(Parcy F，2005)，在植物花发育中发挥着重要作用。

2007年，世界各地先后有不同的科学家(CORBESIER L et al.，2007；TAMAKI S et al.， 2007)在不同的植物材料中证实了FT蛋白就是人们苦苫寻找的“成花素”，它可以通过韧皮 部从叶片运输到茎端分生组织，FT蛋白与bZIP转录因子FLOWERING LOCUS D(FD)互作， 共同激活花分生组织基因APETALA 1(AP1)表达，从而促进成花转换并启动花发育过程(Abe et al.，2005；Notaguchi et al.，2008；Li et al.，2009，Reyes et al.，2011)。

最近对甜菜(Beta vulgaris ssp.vulgaris)的研究表明，甜菜开花期受两个FT基因的旁系同 源物的对抗作用的调节。BvFT2基因在功能上与FT基因保守，对开花必不可少。相反的， BvFT1基因抑制开花，并且它的下调对甜菜对春花作用的反应至关重要(Pierre A.Pin，2010)。 并且FT基因对围绕叶片气孔的保卫细胞有调节作用(Kinoshita，et al.，2011)。随着研究的深 入，人们对FT基因的功能也逐渐有了新的发现。

迄今为止尚未见有关从月季上分离FT基因对改变植物花期的应用的相关报道

发明内容

本发明的目的在于提供一种从月季上分离克隆植物开花期密切相关基因的应用，申请人 将这个基因命名为RoFT，该基因可以调控植物的开花期。

本发明的技术方案如下所示：

本发明提供了月季中表达的PEBP家族的RoFT的基因编码序列及其功能，具体包括： RoFT基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，将该基因转化烟草宿主，获得转RoFT 基因的植株，对转基因植株进行分子鉴定和花期观测。

具体地，本发明首先从月季中克隆出一种新的FT同源基因，将其命名为RoFT。该基因 片段具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框为534bp(其包括四个外显子：分别是98-304bp， 447-508bp，842-882bp，969-1192bp，)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长 度为1281bp。

本发明还提供了这种月季RoFT蛋白编码序列，有177个氨基酸残基，其对应的氨基酸序 列为SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了用于扩增月季RoFT基因的引物对。该引物对根据RoFT基因设计，使用 该引物对月季叶片样品gDNA进行PCR扩增可获得1281bp长度的基因片段。该引物对的DNA 序列如下所示：

P1正向引物：5’CCGGAATTCGCTACTAGCTGAGCAATAT 3’(见SEQ ID NO：2)

P2反向引物：5’GTCGGTACCGAGAAAGACCCACAACT 3’(见SEQ ID NO：3)

本发明还提供了用于检测月季RoFT基因在转基因烟草中表达的引物对。利用该引物对转 化烟草样品的cDNA进行RT-PCR扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，扩增获得349bp 的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示：

P3正向引物：5’GGACTTTCTACACTCTGGTCTTGGT 3’(见SEQ ID NO：4)

P4反向引物：5’CAACGCTATACTCTCCTTCCACC 3’(见SEQ ID NO：5)

可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转化、电导、农 杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RoFT的基因导入植物细胞或组织，并将转化 的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核 苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株 进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉 素或潮霉素等)。被转化的宿主可以是包括烟草在内的多种植物，也可以是培育不同开花期的 植物种类。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的月季开花调控基因RoFT，序列全长为1281bp。

序列表SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3是扩增上述月季叶片样品gDNA的引物对的DNA 序列。

序列表SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5是检测转基因烟草cDNA引物对的DNA序列。

图1：是本发明的原始载体pMOG22结构示意图。

图2：是本发明构建的重组载体pMOG22-RoFT结构示意图。

图3：野生型烟草(非转基因)与转化RoFT基因的烟草(本发明的转基因)的开花显蕾 期比较。图中：图3A是转基因烟草植株在瓶中生根30天现蕾图，图3B是转基因烟草植株 下地(移栽)15天现蕾图，图3C是转基因烟草植株下地(移栽)1个月左右开花图。

图4：RoFT基因在转基因植株中的表达的胶图。图中：Water为水对照，CK为野生型烟 草(为转化烟草对照)，其余为转基因植株。

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步地说明，但不是限制本发明。

实施例1：RoFT基因的分离克隆

按照常规方法提取月季(对品种没有特殊要求)叶片总DNA，根据已知物种的FT基因 序列，设计同源引物F1正向引物5’GCAACAACGGCGGCAAGCTT3’和R1反向引物5’ CCAGAGCCRCYCTCCCTYTGGCAGTT 3’，得到第3和第4个外显子之间的核心片段316bp：

GCAACAACTGCAGCAAGCTTTGGTGAGTACTTTACAATTCTCCACTTTGTTGAATCGGGCTACT TCTAGTTCCAGCAAGCTAATATATAAACGCACTAACCCTTGCAGGCCGAGAGCTTGTGAGCTATGAA ACTCCACGGCCAGCGATGGGGATCCATCGCTTTGTTTCAGTTTTGTTTCGCCAATTGGGTAGGC AAACAGTATATGCTCCAGAATGGCGCCAAAATTTTAACACCAGAGAGTTTGCTGAGAACTATAA TCTTGGATCACCGGTGGCCGCTGTCTATTATAACTGCCAAAGGGAGAGCGGCTCTGG。

根据上述扩增的片段，设计tail引物，进行tail-PCR扩增。即，往3’端延伸引物SP1：5’ CCAGCAAGCTAATATATAAACGCAC3’，SP2：5’GGTAGGCAAACAGTATATGCTCCAGA 3’， SP3：5’CGGTGGCCGCTGTCTATTATAACTG 3’。往5’端引延伸引物AP1：5’ TGGAGCATATACTGTTTGCCTACCC 3’，AP2：5’TTGCTGGAACTAGAAGTAGCCCGAT 3’， AP3：5’GAAGTAGCCCGATTCAACAAAGTGGA 3’。由于两轮tail-PCR后还没有得到完整的 读码框，继续设计tail引物，往5’端延伸，该引物的DNA序列如下所示： AP4：5’CTTGGACTGGGTGCATCAGGATCTA 3’， AP5：5’ACGATCATCTCCCCCTATCTCAACGC 3’， AP6：5’TCCTCAAAGACACAGACTTCGTAAAC 3’。

最终用所得到的片段拼接设计特异引物P1和P2，扩增得到如下的片段(其中下划线为引物序 列，斜体的序列为外显子序列，其碱基位置分别为序列表SEQ ID NO：1的第98-304bp， 447-508bp，842-882bp和969-1192bp，其间被内含子间隔，内含子的碱基位置分别为序列表SEQ ID NO：1的第305-446bp，509-841bp，883-968bp所示，上述4个外显子的长度之和为534bp。 因为RoFT基因在转录翻译的过程中，把中间的3个内含子剪切掉了，剩下4个外显子的CDS区， 即，534bp\3＝178，最后的终止子是不翻译氨基酸的，也就是该基因编码177个氨基酸)，序列 长度为1281bp，具体序列如下所述：

GCTACTAGCTGAGCAATATATAACCATCATGCATGTATCAGCTCTTGGCTAGCTAGGTGGCCTGTGTA AAATTAGTTAATGCTTAAAAGTTAAAACTATGCCTAGGGCTAGAGATCGGGAGCCACTTGTTGTCGGG AGAGTGATCGGAGATGTTCTAGACCCGTTTACGAAGTCTGTGTCTTTGAGGATGACTTACAGTAATAAC AGGGAGGTTACCAGTGGTTGTGAGCTTAAACCTTCTCATGTTGTTAACCGACCTCGCGTTGAGATAGGG GGAGATGATCTTAGGACTTTCTACACTCTGGTAATTAATTACCTGTAATTTTGGTTACATATATCCATCTA TATATTGCATGCATGTGTATATATCATGCTCTTTGTCTTCTTTGTTTAGAAATGCACGTGTAATATAATCTA CATGCACTTCCATTTATACTTGATTGCAGGTCATGGTAGATCCTGATGCACCCAGTCCAAGTGATCC CAACCTCAAGGAATATTTGCATTGGTACTATTGCTGAGGTTTCTTTCATTCTTTTTATTAATCAAACGA ATAGGGGAGAGAGAAGAGATGAGCTATAAGCCCTCATACGTACTATTGGTCTATTGCTAAGCTTTTTGA GGTTTCAAATTCGATCTTCATGTGTTCTTCAAGCCAAGATGGCAAAAACTCTAGGGGAAGATCTAGAA CAAGAAGGATATATGTAAAGGAGAAGAATATCCGTTCATTTTGATTGACTGGTTTTCTATTTAATTTCAG GATTAGATGTGTCTAGGCTAGGTAGATGATGATGAATAGTAGTACTTTTTCCAAGTATTCATCCTTTACA TGTTTTTCCAGGTTGGTGACTGATATTCCAGCAACAACTGCAGCAAGCTTTGGTGAGTACTTTACA ATTCTCCACTTTGTTGAATCGGGCTACTTCTAGTTCCAGCAAGCTAATATATAAACGCACTAACCCTTG CAGGCCGAGAGCTTGTGAGCTATGAAACTCCACGGCCAGCGATGGGGATCCATCGCTTTGTTT CAGTTTTGTTTCGCCAATTGGGTAGGCAAACAGTATATGCTCCAGAATGGCGCCAAAATTTTAA CACCAGAGAGTTTGCTGAGAACTATAATCTTGGATCACCGGTGGCCGCTGTCTATTATAACTGC CAAAGGGAGAGCGGCTCTGGTGGAAGGAGAGTATAGCGTTGTCTATATAACCAGCACTCGTACTC ATATAGTGTCATAATGATAATAAGTTTCCCCATCTAGCTTGTGAGTTGTGGGTCTTTCTC

具体操作步骤如下所述：

1、采用常用的CTAB法(参照：王关林，方宏筠主编，《植物基因工程》，科学出版社，2009 年版)从月季叶片中提取总DNA，具体步骤如下：

(1)向离心管中加入2×CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(W/V)CTAB， NaCl 1.4mol/L，Tris·Cl 1mol/L，2％(W/V)pvp)和2％的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。

(2)将月季叶片用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴30分钟，期间每隔5min 颠倒混匀一次

(3)取出离心管，待冷却至室温后，加入1/5体积的乙酸铵(7.5mol/L)，冰浴30min

(4)取出离心管，室温下12000r/min，离心10min

(5)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混合液，颠倒混匀，静置10min， 室温下12000r/min，离心10min

(6)取上清，重复步骤(5)

(7)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀20-30min，室温下12000r/min， 离心10min

(8)弃上清，沉淀用70％的酒精和无水乙醇各洗一次

(9)弃上清，沉淀在室温下自然晾干，溶于适量的高盐TE中

(10)用等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提两次，室温下12000r/min，离心10min

(11)取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，室温沉淀20-30min，室温下12000r/min， 离心10min

(12)弃上清，沉淀用70％的酒精和无水乙醇各洗一次

(13)弃上清，沉淀在室温下自然晾干，溶于适量的TE中，于-40℃保存备用

(14)取2μl的DNA样品进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性，稀释后待用 于Tail-PCR反应，反应条件：

第一轮反应：

1.94℃ 4min；

2.94℃ 15s；

3.60-68℃ 1min；

4.72℃ 2.5min；

5.重复 第二步至 第四步，5个循环；

6.94℃ 15s；

7.25℃ 1min，以0.2℃/s升至72℃，72℃ 2.5min；

8.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

9.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

10.94℃ 15s，44℃ 1min，72℃ 2.5min；

11.重复 第八步至 第十步，15个循环；

12.72℃ 10min。

将第一轮反应产物稀释1000倍，作为第二轮反应的模板。

第二轮反应：

1.94℃ 4min；

2.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

3.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

4.94℃ 15s，44℃ 1min，72℃ 2.5min；

5.重复 第二步至 第四步，15个循环；

6.72℃ 10min。

将第二轮反应产物稀释1000倍，作为第三轮反应的模板。

第三轮：

1.94℃ 4min；

2.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

3.94℃ 15s，60-68℃ 1min，72℃ 2.5min；

4.94℃ 15s，44℃ 1min，72℃ 2.5min；

5.重复 第二步至 第四步，15个循环；

6.72℃ 10min。

最后，将第二轮反应的产物和第三轮反应的产物成对点样，用1％的琼脂糖凝胶电泳检 测。

PCR产物切胶回收后，连接到克隆载体上，进行菌落PCR鉴定，阳性 菌送样测序，测序工作委托上海桑尼生物科技有限公司完成，分析试验结果。

获得最终基因全长的反应条件：94℃预变性4min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 1min10sec，35个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入载体(购自 宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。将该克隆命名为 质粒。

实施例2：RoFT基因超量表达载体的构建，转化

FT基因在调控植物开花中起着极其重要的作用，申请人将其在烟草中超量表达，从转基 因植株的表型来验证。

具体步骤是：首先将实施例1中得到的阳性克隆质粒用EcoRI和KpnI双 酶切，回收目的片段。同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化 载体pMOG22(荷兰自由大学MOGEN教授惠赠，MOGEN，Leiden，the Netherlands)。酶切完 毕，用包含RoFT基因的酶切片段和酶切后的pMOG22载体(图1)做连接反应，转化大肠 杆菌DH5α(该菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得重组载体 (即本发明的转化载体)，申请人将其命名为重组载体pMOG22-RoFT(见图2)。

利用常规的农杆菌介导的遗传转化方法将pMOG22-RoFT导入到烟草中，经过侵染、共 培养、筛选具有潮霉素抗性的烟草转化苗，再通过生根、练苗移栽，得到转基因植株。

主要步骤和应用试剂如下：

(1)试剂和溶液配制方法

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄 氨基腺嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef (Cefotaxime，头孢霉索)；Hyg(Hygromycin，潮霉素)

(2)用于烟草遗传转化的培养基配方

表1 列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1 烟草转化培养基设计

注：MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497 报道的方法。

表1中的Hyg(Hygromycin，潮霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，采用0.45μm滤 膜过滤方法灭菌，在上述除Hyg和Cef成分以外的培养基经常规121℃高压蒸汽灭菌20min 后，待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入。

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)农杆菌的培养

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L 氯化钠+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA105 48小时，培养温度28℃；挑 取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母 提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L)中，于28℃ 200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。

2)叶盘转化法

a.剪取烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无 菌烧杯中；

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培 养基上暗培养三天，培养室温度为28℃；

d.三天后，将叶片转入如上所述的出芽选择培养基上，在光(暗)条件下交替培养(光照 强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Hyg抗性芽的筛选分化，培养室 温度为28℃；

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如上所述的壮苗选择培养基上，在光(暗)条件下交替 培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Hyg抗性苗的 筛选，培养室温度为28℃；

f.将筛选得到的抗性苗转入如表1所述的生根选择培养基上使其生根，光照/黑暗的培养条 件(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d；黑暗时间：8h/d)，培养室温度为28℃。

2)移栽

洗掉转基因烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初 的一个周内保持水分湿润。

本实施例共获得13个转基因株系，将PCR检测结果为阳性的植株转入质粒 pMOG22-RoFT(见图2)的T₀代转基因烟草上。

实施例3：RoFT基因转基因T₀代在田间的开花期观测与RT-PCR检测

转基因烟草植株下地后，直至开花期，将转基因烟草与未转化(转基因)烟草的开花期 进行比较，发现转RoFT基因的烟草的开花期明显提前(平均提前120天)，而没有转化的烟 草开花需要营养生长170-200天，转RoFT基因的烟草在培养基中就出现花蕾(大约为转化为 小植株后的30天，见图3A)，下地15天陆续显蕾(见图3B)，1个月左右开花(见图3C)。

为了验证转基因烟草花型的改变是否与转入的RoFT基因有关，本发明采用了常用的 RT-PCR方法对部分转基因烟草植株中RoFT基因表达进行检测(结果见图4)。

具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司，按照试剂说明书操 作)从转基因烟草1-5号株系中提取叶片的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书 操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反 应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。先用看家基因EIF(登录号：X79009)对反 转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因EIF的序列设计一对引物，该引物对 的DNA序列如下所示：

P5正向引物：5’-GCAGCCGTGATCACACAGTATCT-3’

P6反向引物：5’-ACACCCTTCCTTCCAAAACGT-3’，

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，27个循环；72 ℃延伸10min。试验结果如图3所示，看家基因EIF的在野生烟草和转化烟草中均能扩出， 并且亮度一致。然后根据RoFT基因的序列，在靠近3’端设计一对引物其DNA序列如下所示：

P3正向引物：5’-GGACTTTCTACACTCTGGTCTTGGT-3’

P4反向引物：5’-CAACGCTATACTCTCCTTCCACC-3’，

进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec， 30个循环；72℃延伸10min。

试验结果表明，获得的5株转基因烟草内均检测到有RoFT基因的表达(结果如图3所 示)。图3中的各数字表示：1为双蒸水阴性对照；2、3为未转化的烟草的PCR扩增结果； 4-8为转入质粒pMOG22-RoFT的转基因烟草的PCR扩增结果。

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