一株马腺疫链球菌菌株XZ1及其在马腺疫疫苗中的应用

摘要

本发明涉及一株马腺疫链球菌(又称马链球菌马亚种，Streptococcus.equi subsp equi)XZ1，CGMCC No.7830，具有序列表1中的16S rRNA基因序列；该菌株分离自马腺疫病马，革兰氏阳性细菌，细胞呈球状，排列成对，或呈弯曲的长链条，在普通肉汤和平板生长不良；5％绵羊鲜血平板上发生β型溶血，露珠状小菌落周围形成完全透明的溶血带，宽度可达3mm。兼性厌氧生长，生长温度从25℃到40℃，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4-7.5。发酵葡萄糖产酸，不能发酵乳糖，甘露醇及山梨醇。该菌株可用于制备马腺疫灭活疫苗。由该菌株制备的疫苗针对性好，成本低，安全，保护效果好。

说明书

技术领域

本发明提供的一株分离自新疆伊犁地区的马腺疫链球菌(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1菌株CGMCC No.7830，以及该菌株在马腺疫的防治中制备灭活疫苗的的方法和可能的应用。 

技术背景

随着经济全球化，现代马产业已经转变为以赛马、表演展览、骑乘娱乐等形式的庞大产业，这为中国马产业迎来了前所未有的发展机遇。马产业的快速发展，马的饲养日趋规模化和集约化，使马腺疫的危害表现得日趋明显。 

马腺疫(Stangles)是由马腺疫链球菌引起马属动物的一种急性接触性传染病，主要是在马颈部和头部出现化脓性淋巴管炎。该病俗称喷喉或槽结、喉骨胀，是由马腺疫链球菌引起的马属动物的一种急性、热性传染病。其特征是鼻咽等粘膜发生急性、卡他性、化脓性炎症和领下淋巴结的急性、化脓性炎症。 

该病在养马地区发病率高，呈世界性分布，几乎每年都要流行一次，不仅直接影响马匹的生长发育，还会导致马匹的死亡，已造成严重经济损失，目前仍然困扰着养马业的发展。目前对该病的防治多数情况下以抗生素治疗和环境卫生控制为主，但抗生素治疗常会因为细菌产生的耐药性而导致疗效不佳。 

应用马腺疫链球菌的疫苗可在一定程度上预防和减少本病的发生。目前国内在马腺疫链球菌的商品化的疫苗方面研究和产品极少，不能适应马产业快速发展的需求。此外由于不同地区流行的菌株不尽相同，不同流行株之间相互免疫能力也会有一定差异，此外还发现这类菌株具有变异的特点，仅用一种疫苗株很难达到有效控制不同地区该病的发生。为适应马养殖业的快速发展，尽快净化本病和控制该菌的发生和流行，需要采取新疆伊犁地区马腺疫发病马匹的病料，分离出当地流行的马腺疫链球菌，进行生化和分子鉴定等研究，该菌株应当 为新疆伊犁地区的流行菌株，可用于制备马腺疫链球菌灭活苗，实现对当地马腺疫的有效防治。 

发明目的 

针对目前马业发展中和马病防控中急需解决对马腺疫的防治问题，本发明旨在提供一种针对性强的马腺疫疫苗菌株，该菌株可以被利用来制备马腺疫链球菌灭活苗，该菌苗成本低，安全，可用于马腺疫的预防。 

发明内容

本发明提供的马腺疫链球菌(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1菌株，于2013年6月28日，在北京保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7830。 

1.本发明提供的马腺疫链球菌(Streptococcus.equi subsp equi)XZ1菌株CGMCC No.7830具有以下特征： 

(1)菌落特征：在血琼脂平板上形成灰白色、表面光滑、边缘整齐的细小菌落。 

(2)细胞形态特征：细胞圆形或卵圆形，一般多数呈链状排列，短者4～8个细菌组成，长者有20～30个细菌组成，革兰氏染色阳性。 

(3)生理生化特征：营养要求较高，普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。需氧或兼性厌氧生长生长温度从25℃到40℃，最适温度37℃，pH生长范围6-9，最适PH7.4～7.6。 

(4)16S rRNA基因序列特征见附表1。 

参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，马腺疫链球菌菌株XZ1CGMCC No.7830)被鉴定为马链球菌马亚种(Streptococcus.equi subsp equi)。 

本发明提供的CGMCC No.7830菌株的培养基TM组成： 

PH＝7.4112℃30分钟灭菌后制备而成。 

2.灭活抗原的制备 

将分离菌分别接种于加有2％马血清的TM培养基中，37℃、180 r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2，10mmol)稀释至1×10⁷CFU/mL。与等量氟氏完全佐剂乳化后免疫家兔，3周后以同样浓度的菌与等量氟氏不完全佐剂乳化，制备免疫原。 

3.无菌检验  将制备的灭活抗原分别接种于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24～72h，观察有无细菌生长： 

4.安全性检验 

将制备的灭活抗原皮下注射1.5～2.0kg体重的家兔5只，4mL/只，另取2只皮下注射生理盐水作对照，4mL/只，观察10d。 

5.小鼠免疫试验 

将分离菌分别接种于加有2％马血清的TM培养基中，37℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2，10mmol)稀释至1×10⁶CFU/mL。经过无菌检验和安全检验后合格的灭活菌液与等量的氟氏完全佐剂和氟氏不完全佐剂乳化制备免疫原。将制备的灭活抗原皮下注射20g体重的小鼠8只，0.5mL/只，另取相同小鼠8只，皮皮下注射生理盐水作对照，0.5mL/只，各组均在首免后3周后进行第2次免疫，2免后15d用活菌株攻击，攻击剂量为1×10⁵CFU。 

5.疫苗效价测定 

在相同饲养条件下，随机选择1.5～2.0kg体重的家兔5只，背部皮下多点注射疫苗4mL/只，另取5只皮下注射生理盐水作对照，4mL/只，各组均在首免后3周后进行第2次免疫，15、30、45d用菌体作包被抗原，ELISA法检测抗体。 

发明效果 

(1)本发明提供了一株分离自新疆伊犁地区马腺疫链球菌优势流行株，对于有效预防当地流行菌株引起的马腺疫有重要价值。用其制备的灭活菌苗生产成本低，产品附加值高，市场需求高，有很好的市场前景。 

(2)该菌株可以被利用来生产各种不同类型的马腺疫疫苗包括灭活疫苗和亚单位疫苗。该菌苗免疫效果好，针对性强，特性强。 

(3)本发明提供了一株分离自新疆伊犁地区的马腺疫病马中的马腺疫链球菌，该菌苗因用甲醛彻底灭活，用其制备的灭活菌苗安全性好，无散毒危险。 

附图说明

图1是提取的马腺疫链球菌的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶中进行电泳结果图。 

图2是马腺疫链球菌16SrRNA PCR扩增产物的电泳结果图。 

具体实施方案

为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。 

实施例1：马腺疫链球菌菌株XZ1CGMCCNo.7830的培养及生物学特征。 

马链球菌马亚种XZ1CGMCC No.7830分离自马腺疫病马的脓汁，接种于鲜血为底物培养基中，于37℃培养，12-15h。该菌具有以下特征：(1)菌落特征：在血液琼脂平板上培养1天的菌落直径为0.2-1.0mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，灰白色。(2)细胞形态特征：细胞为圆形或卵圆形；革兰氏染色阳性；细胞直径1.0-2.0μm。(3)生理生化特征：兼性厌氧生长；生长温度从28℃到39℃，最适生长温度37℃；pH生长范围6-8，最适生长pH7.4-7.6；可以发酵葡萄糖，蔗糖，不水解七叶苷，6.5％NaCl中不生长，不液化明胶，分解精氨酸，能利用水杨苷作为碳源，不能利用乳糖、菊糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇。 

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株XZ1CGMCC No.7830被鉴定为马腺疫链球菌菌株(马链球菌马亚种，Streptococcus.equi subsp equi)。 

实施例2：马腺疫链球菌菌株XZ1CGMCC No.7830的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定 

马腺疫链球菌菌株XZ1CGMCC No.7830接种于液体培养基，将生长至对数晚期的发酵 液离心(5000转/分钟，5分钟)去除上清液，用TE(50mM Tris，50mM EDTA-Na₂)溶液洗2遍；用0.5mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温2小时；加入0.2mL20％SDS，60℃保温10分钟；加入0.3mL5M NaClO₄，混匀；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻摇匀5分钟左右，离心(5000转/分钟，5分钟)，吸取上清液，再用酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)处理一遍；然后依次用氯仿-异戊醇(24∶1，v/v)处理两遍，直到没有蛋白膜出现；上清液加入20μl0.2％RNA酶37℃保温30分钟，氯仿-异戊醇(24∶1，v/v)处理三遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70％冰乙醇溶液浸泡5分钟。晾干后溶于TE溶液中作为模板。 

用于16S rRNA基因扩增的PCR反应的正向引物为： 

5’-TGGAACGCACAGATGATAC-3’，反向引物为： 

5’-GACTTCGGGTGTTACAAAC-3’。 

PCR反应体系(50μl)为：10×buffer5μl、25mmol/L MgCl₂4μl、10mmol/L dNTPs1μl、20pmol/L引物各1μl、ddH₂O36μl、Taq DNA酶1μl、模板1μl。PCR反应条件为：95℃10min，95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1312bp。其16SrRNA基因的核苷酸序列如序列表1所示。 

实施例3：灭活抗原的制备 

将分离菌分别接种于加有2％马血清的TM培养基中，37℃、180r/min培养18～24h，加0.4％甲醛灭活36～48h。灭活彻底后，7000rpm/min离心15min去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2，10mmol)稀释至1×10⁷CFU/mL。与等量氟氏完全佐剂乳化后免疫家兔，3周后以同样浓度的菌与等量氟氏不完全佐剂乳化，菌苗充分振荡混匀后进行无菌检验和安全性检验。 

实施例4：无菌检验 

将制备的灭活抗原分别接种于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24～72h，观察有无细菌生长。培养后结果均不见有菌生长，表明灭活效果良好，操作规范无污染。 

实施例5：安全性检验 

将制备的灭活抗原皮下注射1.5～2.0kg体重的家兔5只，4mL/只，另取2只皮下注射生理盐水作对照，4mL/只，观察10d。接种家兔无1例死亡，说明疫苗安全性较好；检查接种局部和全身的反应，结果除1只接种部位有轻微炎症反应外其余接种的家兔无明显的局部和全身反应，精神、体温、食欲、呼吸和脉搏正常。 

实施例6：小鼠免疫试验 

醛灭活36～48h。离心去上清。细菌沉淀以灭菌PBS(pH7.2，10mmol)稀释至1×10⁶CFU/mL。经过无菌检验和安全检验后合格的灭活菌液与等量的氟氏完全佐剂和氟氏不完全佐剂乳化制备免疫原。将制备的灭活抗原皮下注射20g体重的小鼠20只，0.5mL/只，另取相同小鼠20只，皮下注射生理盐水作对照，0.5mL/只，各组均在首免后3周后进行第2次免疫，2免后15d用致死剂量的活菌培养物攻击，每组腹腔接种攻击菌的剂量为5×10⁵CFU，观察一周。结果对照组全部死亡，免疫组的死亡4只，免疫组的免疫保护力可达80％。 

实施例7：疫苗效价测定 

在相同饲养条件下，随机选择1.5～2.0kg体重的家兔5只，背部皮下多点注射疫苗4mL/只，另取5只皮下注射生理盐水作对照，4mL/只，各组均在首免后3周后进行第2次免疫，45d用10⁸菌体作包被抗原，ELISA法检测抗体。检测结果表明家兔经两次免疫后45d的抗体效价为7.3×10⁵。 

试验证明：由该菌制备的灭活疫苗对实验动物安全，毒性小，无明显副作用，免疫家兔2次后可产生较高的免疫效价，2免后的ELISA效价可达7.3×10⁵，对实验动物小鼠的保护率可达80％。