分离的寡核苷酸rno-miR-219-5p及其在学习记忆损伤中的应用

摘要

本发明提供了一种分离的寡核苷酸、一种用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的试剂盒和一种用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的系统。其中所述分离的寡核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。通过利用本发明的试剂盒和系统可以有效地筛选生物样本是否存在学习记忆脑损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及分离的寡核苷酸、用于确定生物样 本存在学习记忆脑损伤的试剂盒和用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的系统。

背景技术

微波技术广泛应用的同时也不可避免地带来环境污染和健康隐患。已有研究证实，脑 是微波辐射的敏感靶器官，其中海马是敏感靶部位，其功能主要与学习和记忆相关。研究 表明，30mW/cm²微波辐射对大鼠空间学习和记忆能力有损伤作用；可导致海马组织中氨 基酸类神经递质含量降低和代谢紊乱；引起海马组织结构和超微结构破坏。上述改变以7 天损伤显著，14天呈恢复趋势。

但目前微波辐射致学习和记忆损伤的生物标志物研究较少，特别是miRNA的标志物研 究尚属空白。因此，迫切需要开发出一种特异、敏感的微波辐射致学习和记忆损伤相关的 的miRNA生物标志物。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于 提出一种能够确定生物样本存在学习记忆脑损伤的miRNA生物标志物，该miRNA生物标 志物具有高特异性和高敏感性的特点。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，所 述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。根据本发明的实施例，发明人确定了生物 样本存在学习记忆脑损伤的miRNA生物标志物，该miRNA生物标志物具有如SEQ ID NO： 1所示的序列，并且确定了该miRNA生物标志物与突触可塑性、神经递质传递、认知等学 习和记忆相关过程密切相关。

其中，上述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示：UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的试 剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含探针，所述探针特异性识别具有如SEQ ID NO： 1所示序列的所述的寡核苷酸。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物 样品是否存在学习记忆脑损伤。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的系 统。根据本发明的实施例，所述用于确定生物样本存在学习记忆脑损伤的系统包括取样设 备，用于从生物体收集生物样本；核酸提取设备，所述核酸提取设备与所述取样设备相连， 用于从所述生物样本获取核酸样品；检测设备，所述检测设备与所述核酸提取设备相连， 用于确定所述核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量；和分析设 备，所述分析设备与所述检测设备相连，用于基于具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核 酸分子的含量确定所述生物体是否存在学习记忆脑损伤。利用该系统，能够有效地确定生 物样品是否存在学习记忆脑损伤，从而可以有效地筛选存在学习记忆脑损伤的生物样品。

另外，根据本发明的实施例的分离的寡核苷酸，还可以具有如下附加的技术特征，所 述寡核苷酸为RNA。由此，可以直接将生物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过 荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片扫描和分析，从而确定生物体是否存在学习记 忆脑损伤。

根据本发明实施例的确定生物样本存在学习记忆脑损伤的试剂盒，还可以具有如下附 加的技术特征，所述探针是以芯片的形式提供的。由此，将上述从生物样品中分离的寡核 苷酸与具有最新更新生物序列信息的芯片进行杂交，进行全面筛选从而可以确定生物样本 存在脑损伤的生物标记物。

根据本发明实施例的确定生物样本存在学习记忆脑损伤的系统，还可以具有如下附加 的技术特征：

根据本发明的实施例，所述检测设备为核酸杂交芯片。由此，将上述从生物样品中分 离的寡核苷酸与具有最新更新生物序列信息的芯片进行杂交并进行扫描和分析，进行全面 筛选从而可以确定生物样本存在学习记忆脑损伤的生物标记物。

根据本发明的实施例，所述核酸样品为所述生物样本的总RNA。由此，可以直接将生 物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片 扫描和分析，从而确定生物体是否存在学习记忆脑损伤。

根据本发明的实施例，所述分析设备适于将所述核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所 示的序列的核酸分子的含量与预定参数进行比较，并且基于核酸样品中具有如SEQ ID NO： 1所示的序列的核酸分子的含量与所述预定参数的差异确定所述生物体是否存在学习记忆 脑损伤。由此，可以将待测生物样本中的具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的 含量与已知生理状态正常的生物样本的预定参数进行比较，从而确定两组样本中的具有如 SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量的差异，从而确定待测生物样本中是否存在学 习记忆脑损伤。

根据本发明的实施例，所述预定参数是正常生物样本的具有如SEQ ID NO：1所示的 序列的核酸分子的含量，其中，基于待测核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的 核酸分子的含量低于所述预定参数，确定所述生物体是否存在学习记忆脑损伤。由此，可 以准确有效地确定待测生物样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量低 于预定参数的倍数，并根据统计学分析筛选出待测样本中是否存在学习记忆脑损伤。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的大鼠海马组织结构经过30mW/cm²微波辐射的变化，其中：

1A为假辐射组大鼠海马组织结构，

1B为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第1天组大鼠海马组织结构，

1C为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第7天组大鼠海马组织结构，

1D为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第14天组大鼠海马组织结构，

1E为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第28天组大鼠海马组织结构;

图2是根据本发明实施例的大鼠海马组织超微结构经过30mW/cm²微波辐射的变化， 其中：

2A是假辐射组大鼠海马组织超微结构，

2B为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第7天组大鼠海马组织超微结构，

2C是假辐射组大鼠海马组织超微结构，

2D为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第7天组大鼠海马组织超微结构；

图3为根据本发明实施例的大鼠海马组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，

1～3为微波辐射后恢复常规喂养的第7天假辐射组海马组织总RNA；

4～6为微波辐射后恢复常规喂养的第7天30mW/cm₂微波辐射组海马组织总RNA；

图4显示了大鼠海马组织miRNA芯片杂交扫描图及局部放大图；

图5显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天大鼠海马组织miRNA表达 谱中rno-miR-219-5p的结果；

图6显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天差异表达的miRNA的聚类 分析图；

图7显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天大鼠海马组织的 rno-miR-219-5p实时荧光定量PCR检测结果；和

图8显示了恢复常规喂养的第7天rno-miR-219-5p预测靶基因文氏图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1对大鼠进行微波辐射

将56只体重为220±20克的二级雄性Wistar大鼠（军事医学科学院），随机分为假辐射 组和微波辐射组。采用军事医学科学院微波辐射源对上述大鼠进行全身均匀辐射，微波辐 射源地平均功率密度为30mW/cm²，隔日辐射1次，共3次，每次10分钟。假辐射组置于 辐射盒中，不予辐射。

实施例2大鼠学习和记忆能力的检测

采用SLY-WMS Morris水迷宫测试系统（购自北京硕林苑科技有限公司，主要由不锈 钢圆形水池、摄像机、软件组成，不锈钢圆形水池内壁为深色，直径120厘米，高50厘米， 水深20厘米，水温控制在23±2摄氏度），将水池分为4个象限，分别定为1、2、3、4象 限，每个象限池壁的中间位置标明4个入水点，任选其中1个象限，正中放置1个直径12 厘米，高19厘米的深色平台。迷宫上方安有摄像机，通过和电脑连接，自动录入大鼠游泳 轨迹以进行分析。

各组大鼠于微波辐射前训练2天，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，如果 大鼠在60秒内找到平台，让其在平台上停留20秒，然后再进行下一个象限。如果60秒内 未找到平台，由实验者将其引至平台，让其停留20秒，再进行下一象限。每只大鼠4个象 限做完，再放回笼中。

采用Morris水迷宫检测大鼠的学习和记忆能力的改变。微波辐射前训练3天，于辐射 后恢复常规喂养的第6小时、1天、7天、14天及28天进行5次定位航行实验。每组10 只动物。将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在60秒内寻找到平台的时间 （逃避潜伏期），以平均逃避潜伏期（average escape latency，AEL）作为观察指标。如果大 鼠在60秒内未能找到平台，则记为60秒，继续进行下一象限实验。结果见表1。

表1微波辐射对大鼠的平均逃避潜伏期的影响（秒）

由表1中的结果可知，微波辐射后恢复常规喂养的6小时～28天各时间点大鼠的平均逃 避潜伏期延长。微波辐射后恢复常规喂养的第6小时和7天，辐射组大鼠的平均逃避潜伏 期均明显高于假辐射组（P<0.05）。微波辐射后恢复常规喂养的第14天，呈现恢复趋势。 至辐射后恢复常规喂养的第28天已基本恢复。由此可知30mW/cm²微波辐射能够造成大 鼠空间学习记忆能力的损伤，且在辐射后恢复常规喂养的第6小时和7天空间学习记忆能 力损伤的最为显著。

实施例3大鼠海马组织氨基酸类神经递质含量的检测

收集辐射后恢复常规喂养的第1天、7天、14天及28天的大鼠脑组织，分离海马后称 重，按1毫升/100毫克的比例加入10%磺基水杨酸溶液；利用高速分散器对大鼠海马组织 的10%磺基水杨酸溶液进行匀浆（以上步骤均在冰上进行）；然后在4摄氏度温度条件下， 以15000rpm离心20分钟，收集上清。采用高效液相色谱法（HPLC）检测天冬氨酸（Asp）、 谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）及γ-氨基丁酸（GABA）4种氨基酸类神经递质的含量。结 果见表2。

表2微波辐射对大鼠海马组织中氨基酸类神经递质的影响（微克×10²/毫克）

由表2中的结果可知，微波辐射后恢复常规喂养的第1天，Asp、Glu、GABA含量及 Glu/GABA明显降低，与假辐射组相比有显著差异（P<0.01或P<0.05）；辐射后恢复常规喂 养的第7天，Asp、Gly含量及Glu/GABA明显升高，与假辐射组相比有显著差异（P<0.05）。 辐射后恢复常规喂养的第14天和28天，4种神经递质含量及Glu/GABA基本恢复。由此 可知，微波辐射可影响大鼠海马氨基酸类神经递质含量，使氨基酸类神经递质代谢紊乱。

实施例4大鼠海马组织结构观察

将辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射后恢复常规喂养的第1天、7天、14天及28天， 采用腹腔注射1%戊巴比妥钠（30毫克/公斤）对大鼠进行麻醉后，取脑组织，并用10%缓 冲福尔马林固定1周后，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为3微米， 脱蜡至蒸馏水，Harris苏木素染核，70%盐酸乙醇分化，1%乙醇伊红染色，梯度乙醇脱水， 二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察并摄像。结果见图1。

假辐射组大鼠海马组织呈正常形态结构，神经元轮廓清晰，多呈圆形，细胞核大而圆， 着色较浅，位于细胞中央，胞质弱嗜酸性。微波辐射后海马组织基本病理改变为：组织水 肿、疏松；神经元呈不同程度的变性、坏死，主要表现为锥体细胞核固缩成三角形蓝色质 块，胞体皱缩呈梭形，颗粒细胞变化较轻，间质毛细血管扩张；部分胶质细胞固缩变形， 胞浆深染；血管周间隙增宽。其动态变化规律为：辐射后恢复常规喂养的第1天，海马组 织见部分神经元固缩，血管周间隙稍增宽，7天内病变进行性加重，神经元胞体变小，胞 核呈三角形和梭形，血管周间隙明显增宽，14天呈恢复趋势，28天基本恢复。表明微波辐 射可造成海马组织结构破坏。

实施例5大鼠海马组织超微结构观察

将辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射后恢复喂养的第7天进行处死，分离新鲜脑组织， 冰上玻璃海马，取1mm³海马组织，迅速放入2.5%戊二醛固定2小时，1%锇酸后固定2 小时，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片（厚70 纳米），醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄像。结果见图2。

由图2结果中可见，假辐射组海马神经元胞核染色质均匀，胞质内富含线粒体、粗面 内质网和大量的游离核糖体。辐射后恢复常规喂养第7天，辐射组海马神经元粗面内质网 扩张，线粒体肿胀，嵴断裂，核膜间隙增宽，突触囊泡减少。

实施例6大鼠海马组织miRNA表达谱筛选

6.1大鼠海马组织总RNA质检

将辐射组与假辐射组大鼠分别于微波辐射后恢复常规喂养的第7天分离大鼠海马（7 天假辐射组标记为A，7天30mW/cm²微波辐射组标记为B，每组各3个样品），进行总 RNA抽提和质量检测。完整无降解的RNA进行miRNA的荧光标记、miRCURYTM LNA  Array芯片（丹麦Exqion公司）杂交、芯片扫描和分析，结果见表3及图3。

表3大鼠海马组织内总RNA含量及浓度

注：A1～A3为微波辐射后恢复常规喂养第7天假辐射组大鼠海马组织总RNA；B1～B3 为微波辐射后恢复常规喂养第7天经过30mW/cm2微波辐射组大鼠海马组织总RNA。

从表3中结果可见，提取的大鼠海马组织总RNA的OD_260/280比值均在1.8～2.1之间， OD_260/230比值均大于1.8。从图3电泳结果图可见，总RNA中18s和28s核糖体RNA电泳 条带均较清晰、明亮，并且28s条带比18s明亮。以上结果表明提取的大鼠海马组织总RNA 成份比较完整，无降解，无污染，可进行后续的芯片杂交实验。

6.2miRNA芯片样品杂交信号相关性

采用杂交信号相关性来初步判断miRNA芯片杂交实验的质量和样品之间的差异。结果 见表4。

表4大鼠海马组织miRNA芯片杂交信号相关系数

A1 A2 A3 A1 1 0.96996 0.959635 A2 0.96996 1 0.982319 A3 0.959635 0.982319 1 B1 B2 B3 B1 1 0.936445 0.956784 B2 0.936445 1 0.987826 B3 0.956784 0.987826 1

注：A1～A3为微波辐射后恢复常规喂养第7天假辐射组大鼠海马组织总RNA；B1～B3 为微波辐射后恢复常规喂养的第7天经过30mW/cm²微波辐射组大鼠海马组织总RNA。

由表4中的结果可见，同一组内大鼠海马组织的相关系数较高，表明组内差异小，实 验重复性好。

6.3大鼠海马组织miRNA差异表达谱

采用Exiqon公司研发的miRCURYTM LNA miRNA芯片（Hy3^TM单色荧光基团标记） 对上述6个大鼠海马组织的miRNA表达情况进行检测，每只大鼠海马组织使用一张芯片。 从图4的芯片扫描图及局部放大图可观察到芯片的光点清晰、各点距均匀，规则，无背景 色干扰。将扫描结果转换成数字数据保存，并进一步进行计算分析。

将恢复常规喂养的第7天的30mW/cm²微波辐射组大鼠海马组织miRNA表达谱与假辐 射组大鼠海马组织miRNA表达谱进行比较。对原始数据进行中值标准化后，以两组荧光信 号强度比值大于1.5定为上调，小于0.7为下调。结果发现，30mW/cm²微波辐射后恢复喂 养的第7天，显著上调的miRNA有12个，显著下调的miRNA有73个。图5显示 rno-miR-219-5p显著下调，倍数Fc为0.123558，P=0.001485。

热图（heat map）能够显示miRNA之间以及样品之间的双向聚类分析。图6每行代表 同一个miRNA，每列代表同一个样品。左侧为miRNA的聚类树状图，上端为样品的聚类 树状图。根据聚类分析图可显示每个样品中各miRNA的相对表达水平。从图6中可见，各 组内大鼠海马组织rno-miR-219-5p表达相似性高，表明重复性好，个体差异小。但30 mW/cm²微波辐射组与假辐射组相比，大鼠海马组织miRNA表达谱有着较为明显的差别， 表明其表达量呈现不同，显著下调。

实施例7芯片rno-miR-219-5p表达验证

7.1反转录

将辐射组与假辐射组大鼠于微波辐射后恢复常规喂养的第7天分离大鼠海马组织，并 提取海马组织总RNA，按照Gene Expression Master Mix（美国Invitrogen公司） 说明配制反转录混合反应液：

试剂名称 体积（1个反应） 100mM dNTP混合物 0.075微升 Multiscribe^TM酶 0.5微升 10×反转录缓冲液 0.75微升 Rnase抑制剂 0.095微升 无核酸酶水 2.08微升 反转录引物 1.5微升 RNA样品 2.5微升 总体积 7.5微升

反应条件为16摄氏度30分钟，42摄氏度30分钟，85摄氏度5分钟。反应结束后， 放入-80摄氏度保存。

7.2实时荧光定量PCR

按照MicroRNA Reverse Transcription Kit（美国Invitrogen公司）说明配制实 时荧光定量PCR反应体系：

反应条件为50摄氏度2分钟，95摄氏度10分钟，95摄氏度15秒，60摄氏度1分 钟，进行50个循环，并绘制扩增曲线。

图7显示了Real-time PCR方法检测海马组织rno-miR-219-5p的表达情况。与假辐射组 相比，30mW/cm²组辐射后恢复常规喂养的第7天，rno-miR-219-5p的表达显著降低 （P<0.01），与芯片结果一致。

实施例8rno-miR-219-5p靶基因预测与功能分析

8.1rno-miR-219-5p靶基因预测

通过miRbase(www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)、miRanda (www.microrna.org/microrna/home.do)以及miRDB(mirdb.org/miRDB/)3个数据库对 rno-miR-219-5p的靶基因进行预测，选择两个或两个以上数据库共有的靶基因。通过Gene  Ontology(http://www.geneontology.org/)对靶基因进行功能分类分析。

图8显示了通过miRbase、miRanda以及miRDB数据库对rno-miR-219-5p的靶基因进 行预测。从图8中可见，miRanda预测到561个靶基因，miRbase预测到802个靶基因， miRDB预测到41个靶基因，其中3个数据库共有的靶基因有12个。

8.2rno-miR-219-5p靶基因功能分析

表5rno-miR-219-5p靶基因功能分析（学习和记忆相关）

表5显示了应用GO注释系统对rno-miR-219-5p靶基因进行功能分类，可见其中与学 习和记忆密切相关的基因主要包括：CAMK2G、RIMS1、Plk2、Grin1、Synj2bp、Wee1、 Ndel1、Stxbp1、Slc24a2、Map2、Ywhah、Gpm6a、Hrh3、Slc17a8、Gucy1b3、Syt5、Adnp、 Stk3。它们主要参与了与突触可塑性、神经递质传递、认知等学习和记忆相关过程。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点 包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一 定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。