稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用

摘要

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用，功能型分子标记包括Pi-d2A和Pi-d2B，Pi-d2A为由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶MluI酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型；Pi-d2B为由引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶PvuI酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型。利用上述引物对从水稻中扩增出Pi-d2A和Pi-d2B，并用对应的特异限制性内切酶酶切，两段核苷酸序列中至少一段被成功酶切，则水稻中含有稻瘟病抗性基因Pi-d2。本发明能直接鉴定种质资源和育种后代中的抗性基因Pi-d2，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻生物技术领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi-d2 的功能型分子标记及其专用引物序列与应用。

背景技术

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的 主粮。稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的真菌病害之一(Ou et al.Rice  diseases(2nd edition).The Cambridge News Ltd,Cambridge,UK,1985, 380-381)。至今已有80余个国家报道有稻瘟病的发生，其中以亚洲和非洲 发病最为严重。据估计，每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人 （Subhankar et al.,Rice blast fungus sequenced.Current Science.2005,89(6): 930-931）。

在农业生产中，防治稻瘟病的主要途径包括化学药剂防治和选育抗病 品种，虽然化学药剂防治对提高产量起到重要作用，但化学方法也带来了 如环境污染、影响生物多样性等弊端；实践证明，选育和推广抗性品种是 防治稻瘟病最经济有效的途径（杨一龙等，水稻稻瘟病部分抗性基因的定 位与克隆研究进展.作物杂志,2010，6:10-14）。然而，利用传统育种方法 选育抗稻瘟病水稻不仅时间长、周期慢，而且准确性达不到100%。随着 现代分子生物学的不断发展，特别是分子标记的出现，为加快抗稻瘟病育 种进程奠定了基础，为传统育种注入了新的活力。传统育种过程中的表型 选择，与基因型的偏差，会造成选择的不准确性和效率低下。而应用分子 标记辅助选择，可有效的检测基因型，有许多传统选择方法无可比拟的优 势：其一，分子标记是一种中性标记，不会带来任何有害的表型；其二， 分子标记大多为显性或共显性标记，便于识别；其三，分子标记是基于 DNA水平上的选择，可在作物的任何生育阶段进行。

尽管过去开发了大量与抗稻瘟病基因连锁的分子标记，如RFLP标记、 SSLP标记、RAPD标记（Naweed et al.,Identification of RAPD markers  linked to a major blast resistance gene in rice.Molecular Breeding.1995,1(4): 341-348；Naqvi et al.,Development of a sequence characterized amplified  region(SCAR)based indirect selection method for a dominant blast-resistance  gene in rice.Genome,1996,39(1):26-30;朱立煌等，用分子标记定位一个 未知的抗稻瘟病基因.中国科学(B辑),1994,24(10):1048-1052）、STS标 记和SNP标记(Pik-h)（Xu et al.,Efficient authentic fine mapping of the rice  blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster,using new Pik-h-differentiating  isolates.Molecular Breeding,2008,22(2):289-299）等。但这些标记仅是紧 密连锁的标记，而且需要依赖构建相应F2群体才能使用，从而影响了标 记的利用效率。因此，为了提高选择的效率，有必要发展新型的分子标记。

近年来，针对特定基因发展了功能型分子标记，广泛用于高密度图谱 构建、基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等(Andersen and  Lübberstedt.Functional markers in plants.Trends in Plant Science.2000,8: 554–560)。功能型分子标记是建立在关联分析或近等基因系中等位基因功 能性基序中单核苷酸多态性位点基础上的一类新型分子标记，一个分子标 记位点代表一个特定的基因，甚至与某种性状联系起来，因此通过对某个 分子标记的筛选即能对性状进行准确筛选。而传统广泛使用的基于PCR 基础的分子标记如RAPD、SSLP和AFLP等标记则是扩增非编码区域或 随机在基因组中扩增，得到的位点一般与目标性状基因距离较远，这使得 这些标记在应用上与其目标有一定的偏差。

功能型分子标记的优点包括：(1)是一类显性或共显性分子标记；(2) 不依赖于分子遗传作图；(3)辅助选择性高，理论上选择效率可达100%。 主要的缺点：(1)可开发利用的分子标记相对较少；(2)部分基因基因不能 开发相应的功能型分子标记。

截止目前，相关学者已开发了多个用于鉴定抗稻瘟病基因的功能型分 子标记。Jia等(Jia et al.,Direct interaction of resistance gene and avirulence  gene products confers rice blast resistance.The EMBO Journal,2000,19(15): 4004-4014)开发了可特异扩增抗稻瘟病基因Pi-ta内部序列的显性分子标 记YL155/YL87、YL153/YL154、YL100/YL102。Robert等(Robert et al., Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three  Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea pathotypes.Crop  Science,2004,44:1790-1798)设计了能特异扩增Pib基因内部序列的显性 分子标记PibDom；刘洋等(刘洋等,水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅 助选择与应用,中国农业科学，2008,41（1）：9-14)又在此基础上增加了 可扩增Pib等位感病基因的分子标记。高利军等(高利军等,5个抗稻瘟病 基因分子标记的建立及应用．2010,硕士学位论文，中国农业大学图书馆) 利用抗稻瘟病基因Pi-d2、Pi9、Pi2、Pi-ta、Pi5与其等位感病基因之间的 序列差异，开发了特异性的分子标记M-Pid2、M-Pi9、M-Pi2、M-Pita和 M-Pi5。这些分子标记特异性强，能够精确地鉴定水稻抗稻瘟病材料中含 有的抗性基因，并且其辅助选择的准确率高，理论上可以达100%。如王 忠华等(王忠华等，水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择.作物学报, 2004，12:1259-1265)利用显性分子标记YL155/YL87与YL183/YL87对 350个杂交F3代株系进行早期筛选，得到118个抗稻瘟病基因Pi-ta纯和 的株系，并且田间抗性调查结果与Pi-ta基因分子检测结果一致。刘洋等(刘 洋等,水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用,中国农业科学， 2008,41（1）：9-14)用Pib特异性的分子标记对600个杂交F2代单株进行 早期筛选，得到185个抗稻瘟病基因Pib纯合的单株，并且这些单株的田 间抗性调查结果显示Pib基因存在与否与水稻稻瘟病抗性相吻合。

本实验室与中国水稻研究所吴建利课题组合作，针对Pi25基因开发 了一套行之有效的功能型分子标记，选择效率可以达到100%（Wang et al., Development and validation of CAPS markers for marker-assisted selection of  rice blast resistance gene Pi25.Acta Agronomica Sinica,2012,11: 1960-1968）。

尽管授权专利号ZL200310118434.3的发明专利针对Pi-d2基因公开了 一种分子标记dCAPs1，但由于该标记仅是Pi-d2基因的紧密连锁标记， 而非Pi-d2基因的功能型分子标记，因此无疑会影响Pi-d2基因的选择效 率。为了加快Pi-d2基因在抗稻瘟病育种上的应用，使其选择效率在理论 上达到100%，本领域迫切需要针对Pi-d2基因开发更有效功能型分子标 记并应用于分子育种中。

发明内容

本发明提供了一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用 引物序列与应用，不仅能快速有效地区分水稻品种的基因型，而且还能直 接鉴定种质资源和育种后代中的抗性基因Pi-d2，

一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记，其特征在于，包括 Pi-d2A和Pi-d2B：

所述Pi-d2A为由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引 物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶A 酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型；

所述Pi-d2B为由碱基序列如引SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物 对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶B酶 切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型。

所述的功能型分子标记Pid2A和Pid2B的引物序列如下所示：

Pi-d2A上游引物：CTTTTGTACTGAGGGACCAC（SEQ ID NO.1）；

Pi-d2A下游引物：CGATTATCTCAAGCAAAACC（SEQ ID NO.2）。

Pi-d2B上游引物：GAGAATGTTCTACTTGAC（SEQ ID NO.3）；

Pi-d2B下游引物：TCGAAGATGTCCTGACGA（SEQ ID NO.4）。

所述水稻为水稻品种地谷、谷农13、谷梅2号或谷梅4号。

所述特异限制性内切酶A为MluI。

所述特异限制性内切酶B为PvuI。

所述的稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记Pid2A和Pid2B的确 定方法，是通过PCR方法从抗性材料和感病材料中扩增Pi-d2(或pi-d2)等 位基因并进行测序及比对分析，分析得到2处SNP（单核苷酸多态性）， 利用在线软件dCAPS Finder（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）确定 单碱基改变引起的相应限制性酶切位点的变化，最后利用在线引物设计软 件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计了上述功能型分子标记Pid2A和 Pid2B的引物序列。

本发明还提供一种获得稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记 Pi-d2A的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。

SEQ ID NO.1：CTTTTGTACTGAGGGACCAC；

SEQ ID NO.2：CGATTATCTCAAGCAAAACC。

本发明还提供一种获得稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记 Pi-d2B的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4所示。

SEQ ID NO.3：GAGAATGTTCTACTTGAC；

SEQ ID NO.4：TCGAAGATGTCCTGACGA。

本发明还提供了一种鉴定水稻中稻瘟病抗性基因Pi-d2的方法，包括 如下步骤：

由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对从水稻基 因组DNA中扩增出一段核苷酸序列，该段核苷酸序列由特异限制性内切 酶MluI酶切；

由引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从水稻基因组DNA中扩增 出另一段核苷酸序列，该段核苷酸序列由特异限制性内切酶PvuI酶切；

任一一段或两段核苷酸序列能被对应的特异限制性内切酶酶切，则所 述水稻中含有瘟病抗性基因Pi-d2。

本发明的功能性分子标记还用于水稻种质资源的筛选、分子标记辅助 育种、基因聚合育种以及转基因育种中。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

本发明的功能型分子标记Pid2A和Pid2B是通过PCR技术实现的， 不仅能快速有效地区分水稻品种的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和 育种后代中的抗性基因Pi-d2，可以在育种进程的任何阶段进行，不受任 何外界因素的影响，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

附图说明

图1是不同水稻材料的分子标记Pi2A鉴定结果。泳道1-20分别为水 稻品种Bettment、江西984112、浙3-5、光辉、花90-68、三芦占7号、 85-404、早红突B、金龙B、协B、二九南B、明珠1号、寒粳、水源258、 93-11、浙恢7954、02428、谷梅4号、谷梅2号、地谷B。M是DNA标 准物DL2000。

图2是回交水稻材料的叶瘟抗性鉴定结果。1-4分别是回交后代(恩施 地谷B//02428/明直B)BC3F5、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-3、(赣香B/恩 施地谷B)BC3F5-2、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-1。

图3是回交水稻材料的穗瘟抗性鉴定结果。1-4分别是回交后代(恩施 地谷B//02428/明直B)BC3F5、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-3、(赣香B/恩 施地谷B)BC3F5-2、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-1。

具体实施方式

以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在 Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in  Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory  Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,3^rd ED.等文献 均有详细的说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购 买产品。

实施例1：Pi-d2等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定

根据已发表的Pi-d2基因（GenBank accession number: NM_001064221）(Chen et al.,A B-lectin receptor kinase gene conferring rice  blast resistance.The Plant Journal,2006,46(5):794-804)设计3对特异引物 （见表1），利用PCR扩增技术，从持久高抗抗稻瘟病籼稻品种谷梅2号 和稻瘟病敏感粳稻品种日本晴中扩增Pi-d2基因，并进行测序（测序委托 于上海桑尼公司），利用多序列比对软件DNAMAN对测序获得的等位基 因进行比对分析，鉴定得到2个SNP（单核苷酸多态性位点），分别是翻 译起始位点后第1023和2232个碱基发生了变化。

表1.Pi-d2基因的扩增特异引物

实施例2：Pi-d2基因的功能型特异分子标记的设计与验证分析

根据dCAPS标记设计原理（Neff et al.,Web-based primer design for  single nucleotide polymorphism analysis.Trends Genet.2002,18(12): 613-615），利用标记设计在线软件dCAPS Finder2.0 （http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html），针对上述2个SNP分别设计了 相应功能型分子标记及其引物（见表2）。

表2.Pi-d2基因的功能型分子标记及其引物

用表2中的两对引物扩增水稻材料中的抗（或感）病基因，经表2中 的限制性内切酶酶切后，可以被酶切的材料为含有抗性基因，反之则为没 有。

利用上述合成的引物分别扩增抗病品种和感病品种，PCR扩增体系和 反应程序如下：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，30秒，35个循环。72℃延伸5分 钟。

PCR产物经琼脂糖胶确定后，经MluI或PvuI酶于37度条件下酶切 3小时。酶切体系如下：

限制性酶酶切反应体系：

酶切反应完后，经8%的PAGE胶电泳检测，电泳条件100V，跑2小 时。所检测的抗感材料的结果见图1，结果表明，仅有协B、寒粳、谷梅 4号、谷梅2号、地谷B等5个材料中含有Pi-d2抗性基因。根据协B和 寒粳的系圃，其原始亲本中含有抗病材料谷梅2号和中花8号（在chen 等（2006）（Chen et al.,A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast  resistance.The Plant Journal,2006,46(5):794-804）的文献中，中花8号为 含有Pi-d2基因的抗性材料）。因此，可以认为上述功能型标记是可靠的。

实施例3：Pi-d2基因的功能型特异分子标记在回交后代中的辅助应用

利用高抗稻瘟病材料地谷B为亲本，与当前被广泛应用的保持系金 23B、中9B、赣香B和明直B等保持系杂交，经多代回交和自交获得一 批性状优良的保持系（见表3）。根据王宁（2011）（王宁，Pi5基因的分 子标记辅助选育及转甘薯储藏蛋白基因的抗稻瘟病水稻新材料培育， 2011，硕士学位论文，浙江大学图书馆）中的DNA提取方法分别提取DNA。 利用实施例2中开发的功能型标记分析转育后代中的内源Pi-d2基因。结 果表明50%的回交后代中含有Pi-d2抗性基因（见表3）。

与此同时，利用10-139（C13小种）和11-01（B13小种）两个生理 小种进行人工叶瘟鉴定以及在浙江武义进行自然穗瘟鉴定，内源抗性基因 结果见表3、植株叶瘟抗性结果见表3和图2、植株穗瘟抗性结果见表3 和图3。由表3的结果可知，由本发明的分子标记及鉴定方法鉴定的结果 与实测结果基本一致，由本发明方法检测出含有Pi-d2基因的水稻材料的稻瘟 病病抗性一般变现为高抗以上。

表3.回交后代的Pi-d2基因及其稻瘟病抗性鉴定结果

备注：a中“√”为含有Pi-d2基因；“×”为含有pi-d2基因；b中0级 为免疫；1-3级为高抗；4-6级为中抗；7-8级为感病；9级为高感；c中0为无病；1 为发病率低于5%；3为发病率5-10%；5为病率11-25%；7为发病率26-50%；9 为发病率高于50%。