绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离及表达模式鉴定

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离克隆及表达模式鉴定。从绵羊基因组中分离克隆并鉴定出一个具有毛囊组织表达特异性的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。利用克隆得到的启动子片段构建了sKAP11.1p-GFP真核表达载体，并在启动子后插入了ZsGreen1绿荧光报告基因。将构建好的载体利用原核显微注射的方法整合到转基因小鼠基因组中，在个体水平上验证了该启动子的在哺乳动物体中具有表达活性和且表现为毛囊组织特异性，该启动子可用于进行动物产毛及毛发性能改良。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到绵羊毛囊特异性表达启动子片段的分离 克隆及表达模式鉴定。

背景技术

启动子（Promoter）是基因的重要组成部分，是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核 酸（DNA）序列。启动子通常位于基因的上游，能够被核糖核酸（RNA）聚合酶，转录调节 因子等识别并与之结合形成转录起始复合物区域，从而起始基因转录。在真核生物中，根据 启动子的作用方式及功能的不同可分为3种类型：组成型启动子、诱导型启动子、及组织特 异型启动子。在组成型启动子的调控下，基因的表达恒定在一个水平上，具有连续性，不呈 现时空特异性，亦不受外界因素的诱导；诱导型启动子需在某些特定的物理或化学信号刺激 下，启动或大幅度地提高基因的转录水平；组织特异性启动子则能够调控基因在某些特定的 器官或组织表达，且普遍具备发育调控特性。因为组织特异性启动子具有调控基因表达时空 性的特点，所以此类启动子可以在生物工程中，用于实现外源基因表达的靶向性，减少机体 能量和物质的损耗及外源基因随意表达对机体代谢活动的影响。也正因为如此，组织特异性 启动子对基因工程有着重要的意义。

在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已是一项常 用的技术。CMV及SV40启动子是现阶段基因工程中应用较为广泛的启动子，两者均可以 携带外源基因，并在几乎所有类型的细胞中高效表达。但由于这类启动子不具备靶向调控基 因表达的能力，因此往往会造成转基因个体的正常生长发育的异常而达不到实验目的。但组 织特异性启动子可以很好的解决了这一难题，它可以控制外源基因在特定的组织或细胞类型 中的表达，而不对其他组织的发育造成影响，因此组织特异性启动子越来越受到了科学家的 青睐。但是从目前在植物及动物中获得的组织特异性启动子中分析发现，普遍存在特异性不 是很高；数目较少；活性低等问题。这些极大的限制了组织特异性启动子在基因工程中的应 用。

本发明以绵羊为研究材料。绵羊是我国重要的经济动物之一，是牧民赖以生存的重要经 济来源，是农业生产总值的重要组成部分。毛用性状，是绵羊的主要经济性状之一，提高改 善这一个经济性状，可直接提高羊的生产性能。利用基因工程技术对绵羊毛用状经济性状进 行改良，是提高羊经济价值，增加牧民经济收入，提高人们生活水平的高效手段。本发明就 是解决目前绵羊毛囊组织特异性启动子数目不足的问题，分离克隆并鉴定了一个绵羊毛囊特 异表达启动子片段，为利用基因工程技术改良绵羊毛用状经济性状提供基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有可用于绵羊基因工程研究的组织特异表达启动子数目不足， 从藏绵羊基因组中分离克隆并鉴定出一个具有毛囊组织表达特异性的启动子，有望将此启动 子用于绵羊的基因工程改良，利用克隆得到的启动子片段构建了sKAP11.1p-GFP真核表达载 体，并在启动子后插入了ZsGreen1绿荧光报告基因。将构建好的载体利用原核显微注射的方 法整合到转基因小鼠基因组中，在个体水平上验证了该启动子的表达活性和组织特异性，为 日后利用该启动子奠定了基础。

实现本发明任务的技术方案如下所述：

1.组织特异性表达基因验证：采集藏绵羊包括毛囊、皮肤、心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、 皱胃、小肠、大肠、淋巴（肠系膜）、脂肪、肌肉、睾丸、卵巢在内的16种组织。提取这些 组织的总RNA，并用反转录PCR（RT-PCR）验证候选基因KRTAP11.1在各组织中的表达情 况。结果证明KRTAP11.1只在毛囊和皮肤中有表达，通过原位杂交实验进一步验证发现， KRTAP11.1基因只在毛干中表达，是一种毛囊特异表达基因。

2.启动子克隆及载体构建：通过特异性引物，从藏绵羊基因组上扩增得到5954KB大小的 启动子区域片段，命名为sKAP11.1p。并将该启动子区域连接入无启动子的pZsGreen1-1绿荧 光蛋白报告载体的启动子区域中，将构建好的载体命名为sKAP11.1p-GFP。

3.启动子表达模式验证：利用显微原核注射技术制作转基因小鼠，将线性化的 sKAP11.1p-GFP载体序列整合到转基因小鼠基因组中。待阳性小鼠4周龄时，采集小鼠毛发、 皮肤、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、舌、睾丸、脑组织，提取RNA。经表型观察及 RT-PCR验证ZsGreen1基因只在小鼠毛发中表达，证明sKAP11.1p启动子在哺乳动物体内具 有活性，且为毛囊组织特异性表达启动子。

本发明的优点在于：

（1）本发明分离克隆了绵羊毛囊特异表达启动子片段sKAP11.1p，并在个体水平上鉴定 了及其活性及组织特异性，为绵羊基因工程和分子育种提供了新的特异表达启动资源。

（2）本发明所构建的绵羊毛囊特异表达启动子sKAP11.1p-GFP载体，可以进一步用于 启动外源基因在毛囊中表达的功能研究。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和2是应用实施例中用于扩增藏绵羊KRTAP11.1基因部分核苷酸序列 的引物。

序列表SEQ ID NO：3是应用实施例中扩增的藏绵羊KRTAP11.1基因的部分核苷酸序列。序 列长度为127bp.

序列表SEQ ID NO：4和5是应用实施例中用于扩增本发明命名的藏绵羊sKAP11.1p启动子 核苷酸序列的引物序列。

序列表SEQ ID NO：6和7是应用实施例中用于扩增本发明命名的藏绵羊sKAP11.1p启动子 的部分核苷酸序列的引物序列。

序列表SEQ ID NO：8是应用实施例中扩增的本发明命名的藏绵羊sKAP11.1p启动子的部分 核苷酸序列。序列长度为561bp。

序列表SEQ IDNO：9是应用实施例中藏绵羊KRTAP11.1基因原位杂交探针的核苷酸序列。 序列长度为796bp。

序列表SEQ ID NO：10是应用实施例中扩增的本发明命名的藏绵羊sKAP11.1p启动子的核苷 酸序列。序列长度为5954bp。

图1：藏绵羊KRTAP11.1基因在藏绵羊各组织中的表达情况。图中：泳道1为100bp Marker； 泳道2-17依次为组织毛囊、皮肤（含毛囊）、心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、皱胃、小肠、大 肠、淋巴（肠系膜）、脂肪、肌肉、睾丸、卵巢；泳道18为无模板阴性对照。

图2藏绵羊KRTAP11.1基因在藏绵羊皮肤中的原位杂交结果。箭头（白色）所指的区域为探 针杂交信号。

图3：sKAP11.1p扩增片段。图中：泳道1为DL15000+2000Marker；泳道2为sKAP11.1p 扩增个片段；泳道3为无模版阴性对照。

图4：sKAP11.1p-GFP载体构造示意图。该载体为真核表达载体；sKAP11.1p启动子连接 ZsGreen1绿荧光报告基因；该载体具有卡那霉素及新霉素抗性。

图5：sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠及阴性对照小鼠的毛发表型检测结果。图5A为明场。 图中左上为sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠，右下为阴性对照小鼠；图5B为荧光场，波长 500nm。图中左上为sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠，右下为阴性对照小鼠。

图6：sKAP11.1p启动子片段组织特异性检测结果。图6A为明场；图6B为荧光场，波长500nm。 组织依次为：1毛发；2脾；3肝；4心；5肺；6胃；7肠；8肾；9睾丸；10脑；11肌肉； 12舌头。

具体实施方式

实施例1：藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP11.1组织表达谱验证

本实验所用试剂及仪器包括：TRIzol购买于Invitrogen公司（货号：15596026）；RNase-Free ddH2O购买于天根生化科技有限公司（货号：RT121）；反转录使用宝生物工程大连有限公司 的“PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser”试剂盒（货号：DRR047S），PCR反应使 用宝生物工程大连有限公司的TaKaRarTaq（货号：DR001）；DEPC（焦碳酸二乙酯）购买于 Sigma公司（货号：D5758）；原位杂交使用Affymetrix公司的的QuantiGene ViewRNA ISH Tissue  Assay原位杂交试剂盒（货号：QVT0050）；实验所用所有耗材均用0.1%DEPC浸泡过夜，并 于120℃高压灭菌30min。仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR仪。 （1）RT-PCR检测藏绵羊KRTAP11.1基因在各组织中的表达情况

采集藏绵羊（西藏林芝地区羊场）包括毛囊、皮肤（含毛囊）、心、肝、脾、肺、肾、瘤 胃、皱胃、小肠、大肠、淋巴（肠系膜）、脂肪、肌肉、睾丸、卵巢在内的16种组织样品。 利用TRIzol法提取各组织总RNA（购买于Invitrogen公司的试剂，货号：15596026），按照 操作产品说明书操作。提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性良好，经分光光度计检 测OD260/OD280在1.8-2.2之间，可用于进一步实验使用。从每个组织的总RNA中取出1μ g，利用“RT reagent Kit With gDNAEraser”试剂盒（购自宝生物工程大连有限 公司）分别反转录成cDNA，具体反应条件及操作参照产品说明书。利用PCR技术检测 KRTAP11.1基因（NCBI登录号：NM 001080740.1）在各组织中的表达情况，引物序列为SEQ ID NO：1和2所示。扩增得到的片段序列为SEQ ID NO：3所示。

PCR体系及反应条件如下：

PCR反应体系（总体积）为10μL：

PCR反应条件：

94℃5min；（94℃ 30s，60℃30s，72℃10s）*28循环；72℃3min

将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物上样4μL，100bpMarker上样4μL， 100V恒压电泳30min，紫外凝胶成像仪下拍照，结果如图1。

如图1所示，KRTAP11.1只在毛囊及皮肤（含毛囊）样品中具有扩增条带，说明KRTAP11.1 在所检测的组织中，只在毛囊和皮肤（含毛囊）中表达。

（2）原位杂交检测藏绵羊KRTAP11.1在藏绵羊皮肤中的表达位置

为了进一步确定藏绵羊KRTAP11.1基因在皮肤中的表达位置，我们通过原位杂交实验对 其进行了定位。使用QuantiGene ViewRNA ISH Tissue Assay原位杂交试剂盒（购自Affymetrix 公司，货号：QVT0050）。由Affymetrix公司根据SEQ ID NO9所示的序列合成探针。采集新 鲜藏绵羊皮肤样品，在4%多聚甲醛（含0.1%DEPC）中固定48h。将皮肤组织包埋成腊块并 用防脱切片制作皮肤组织切片，厚度为4μm。原位杂交操作参照试剂盒说明书。结果如图2 所示。

如图2所示，红色的探针信号存在于藏绵羊毛干之中，说明藏绵羊KRTAP11.1为毛囊特 异表达基因。

实施例2：藏绵羊毛囊特异表达基因KRTAP11.1启动子区域sKAP11.1p克隆

本实施例所用试剂及仪器包括：高保真扩增酶为宝生物工程大连有限公司的PrimeSTAR HS DNAPolymerase（货号：DR010A）；DNA纯化试剂盒使用天根生化科技（北京）有限公 司的TIANquick Midi Purification Kit试剂盒（货号：DP204）。仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR仪。

根据澳大利亚CSIRO（英联邦科学和工业研究组织）发布的藏绵羊基因组v2.0版本（网 址：http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oar2.0.php），在藏绵羊KRTAP11.1基因5’端上 游设计引物，扩增该基因启动子区域5954KB大小片段，并命名为sKAP11.1p（SEQ ID NO： 10）。为了进行下一步的真核表达载体构建，在扩增引物的5’端分别加入了SacII（正向引物） 及BamHI（反向引物）酶切位点。引物序列如SEQ ID NO：4、5。具体反应体系及条件如下：

PCR反应体系（总体积）为50μL：

反应条件：

94℃5min；（98℃10s，68℃7min）*35循环；72℃10min

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化产物上样4μL，DL15,000+2000Marker（天 根生化科技（北京）有限公司，货号：MD116）上样4μL，100V恒压电泳40min，紫外凝 胶成像仪下拍照，结果如图3。

如图3所示，扩增片段特异且清晰，大小与预期相符，可用于下一步实验。

实施例3：真核表达载体sKAP11.1p-GFP构建

本实施例所用试剂及仪器包括：限制性内切酶SacII和BamHI购自Fermentas公司； ZsGreen1-1载体骨架购自Clontech（货号：632473）；凝胶回收试剂盒使用天根生化科技（北 京）有限公司的TIANgel Midi Purification Kit（货号：DP209）；连接酶使用宝生物工程大连 有限公司的DNA Ligation Kit LONG（货号：D6024）；感受态细胞DH5α购自宝生物工程大 连有限公司（货号：D9057）。PCR反应使用宝生物工程大连有限公司的TaKaRa rTaq（货号： DR001）。质粒提取使用天根生化科技（北京）有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒 （货号：DP103）仪器为Bio-red公司的MyCyclerPCR仪。具体操作如下：

（1）对上述实施例2中PCR扩增所获得的sKAP11.1p启动子区域片段进行酶切，其目的 是切开片段两端的酶切位点，形成粘性末端，以便连接到载体中。

（2）反应体系及条件：

总体积20ul体系：

反应条件：37℃过夜。

酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，对sKAP11.1p约6000bp大小的片段进行切胶纯化 （使用TIANgel Midi Purification Kit，具体操作参照说明书）。

（2）酶切质粒ZsGreen1-1。目的是在质粒启动子区域切开与sKAP11.1p片段两端相应的 酶切位点，形成粘性末端，以便将sKAP11.1p片段连接到载体上。具体体系及反应条件如下：

总体积20μl体系：

反应条件：37℃过夜

酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，对线性化的ZsGreen1-1约4500bp大小片段进行切 胶纯化（使用TIANgel Midi Purification Kit，具体操作参照说明书）。

（3）连接。目的是将sKAP11.1p片段，连接入ZsGreen1-1载体的启动子区域，最终构 建成sKAP11.1p-GFP载体。使用DNALigation Kit LONG试剂盒。具体体系及反应条件如下：

总体积49μL体系：

（1）中得到的ZsGreen1-1酶切纯化产物        10μL

（2）中得到的sKAP11.1p片段酶切纯化产物     1μL

10X LONG Ligation Buffer                   5μL

ddH₂O    至                                49μL

反应条件：65℃3min后，冰中急冷；向反应体系中加入DNALigase<LONG>1μL，轻 微混合；16℃15h。

（4）载体质粒转化及提取。目的在于筛选阳性质粒并扩大培养。具体操作如下：

①冰上解冻DH5α感受态细胞100μL，向其中加入10μL连接产物，冰上静置30min；

②放入42℃水浴热激60s，冰上放置3min；

③加入900μL 37℃预热的LB培养基（不含抗生素），37℃振荡培养1h（225rpm）

④取200μL菌液涂布LB固体平板培养基（含卡那霉素，浓度30μg/mL），37℃过夜 培养。

⑤挑取白色菌落放于含有1mLLB培养基（含卡那霉素，浓度30μg/mL）的1.5mL离 心管中，），37℃振荡培养6h（225rpm）。

⑥以菌液为模板进行PCR检测，并设置阳性（sKAP11.1p片段为模板）及阴性（无模 板）对照。引物序列为SEQ ID NO：6、7；产物序列为SEQ ID NO：8，大小为561bp。具 体体系及条件如下：

PCR反应体系（总体积）为10μL：

PCR反应条件：

94℃5min；（94℃30s，60℃30s，72℃40s）*30循环；72℃3min

使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，有561bp扩增条带的样品即为阳性菌落。说明 此菌落中包含构建好的sKAP11.1p-GFP载体。

从阳性菌落的菌液取100μL，加入到装有6mLLB液体培养基（含卡那霉素，浓度30μ g/mL）的15mL离心管中。37℃过夜扩大培养。

使用TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒对扩大培养后的菌液进行质粒提取，最终获得构 建好的sKAP11.1p-GFP毛囊特异性真核表达载体。sKAP11.1p-GFP载体结构示意图如图4所 示。

实施例4：sKAP11.1p-GFP载体表达活性及特异性验证

本实施例所用的实验动物为实验动物为昆明小鼠（白色，由深圳华大基因研究院提供）。

（1）制作转基因小鼠

本实施例采用显微原核注射的方法（徐艺玫,等.绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表 达[J].生物技术通讯.2005）将线性化（利用限制性内切酶酶切环状载体，使载体由闭合的环状 结构变成开环的线性结构）的sKAP11.1p-GFP载体注射入小鼠原核期胚，通过通过同源重组 将sKAP11.1p-GFP片段整合到小鼠基因组中，制作成转基因小鼠，在个体水平上验证 sKAP11.1p启动子序列的活性及特异性。

转基因小鼠的制作委托于深圳华大基因研究院完成。制作流程包括：①利用限制性内切 酶AflⅡ单酶切sKAP11.1p-GFP载体，使载体的线性化；利用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；

②利用显微注射技术将纯化后的线性化的sKAP11.1p-GFP片段注射入小鼠早期原核胚胎中；

③将注射后的原核胚胎移植入代孕受体母鼠的子宫中；④待代孕母鼠产子后，鉴定转基因阳 性子鼠。

（2）sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠表型检测

由于sKAP11.1p-GFP载体中，sKAP11.1p启动子后连接有ZsGreen1绿荧光蛋白报告基因， 因此我们用活体成像系统在500nm波长的激发光下观察sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠及阴 性对照小鼠的毛发表型差异。结果如图4。

如图4所示，左上为sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠，右下为阴性对照小鼠。在500nm 波长的激发光下sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠表发射荧光信号，而阴性小鼠在荧光场下不 可见。说明sKAP11.1p启动子片段在小鼠毛发中具有良好的启动活性。

（3）sKAP11.1p-GFP启动子组织特异性验证

采集sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠及阴性毛发、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、 舌、睾丸、脑组织，将所有组织一同在活体成像系统中用500nm波长的激发光照射检测各组 织荧光发光情况。结果如图5。

1.如图5所示，在荧光场中，只有sKAP11.1p-GFP转基因阳性小鼠的毛发发射荧光，其他 组织均不可见。说明sKAP11.1p启动子片段具有毛囊组织表达特异性。